南京地區(qū)美洲黑楊雌、雄花芽分化的解剖學(xué)研究

陸 靜，陳文文，吳懷通，陳贏男

(南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

成花是植物生長發(fā)育過程中的重要轉(zhuǎn)折，是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到多種植物內(nèi)源和外界環(huán)境信號的共同調(diào)控?；跀M南芥(Arabidopsisthaliana)、金魚草(Antirrhinummajus)等草本模式植物的研究結(jié)果，目前公認(rèn)的成花調(diào)控途徑主要包括：春化途徑、光周期途徑、赤霉素途徑、環(huán)境溫度途徑、年齡途徑和自主途徑[1]。此外，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展促使越來越多花分生組織和花器官發(fā)育特征基因被分離鑒定。如花分生組織特征基因LFY(LEAFY)、AP1(APETALA1)、FUL(FRUITFUL)、CAL(CAULIFLOWER)等可以調(diào)控花序分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ稚M織，決定花器官起始和發(fā)育[2-4]；B類功能基因AP3(APETALA3)調(diào)控花瓣和雄蕊的發(fā)育[5]；C類功能基因AG(AGAMOUS)決定雌蕊和雄蕊形成[6]。關(guān)于木本植物成花機理的研究起步較晚，盡管研究者發(fā)現(xiàn)一些開花調(diào)控分子路徑在不同植物中存在保守性，如光周期途徑中CO-FT調(diào)控植物響應(yīng)日長、晝夜節(jié)律變化，并對休眠具有重要調(diào)節(jié)功能[7]；年齡途徑中miR156/miR172調(diào)控童期向成年期轉(zhuǎn)變[8]，但總體看對木本植物成花調(diào)控分子機制的認(rèn)識還十分有限。與草本植物不同，木本植物大多需經(jīng)歷較長的童期才能成花，且花器官分化延續(xù)時間較長。人們一方面希望培育早花品系，縮短童期，加快育種進(jìn)程；另一方面希望能夠延遲開花，調(diào)節(jié)光合產(chǎn)物分配，以提高木材產(chǎn)量、改良木材品質(zhì)。因此，研究木本植物花芽分化進(jìn)程和特點，闡明花芽分化過程中外部形態(tài)與內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，對于揭示樹木成花的分子調(diào)控機制具有重要意義。

美洲黑楊(Populusdeltoides)屬楊柳科楊屬(Populus)黑楊派，原產(chǎn)北美洲東部和中部地區(qū)，具有樹干通直、生長迅速、材質(zhì)優(yōu)良等特點[9]。自20世紀(jì)70年代引種以來，經(jīng)過40多年的大規(guī)模栽培實踐，美洲黑楊已成為我國重要的速生用材和造林樹種之一。同時，美洲黑楊也是人工雜交親本的主要來源[10]，如利用美洲黑楊與歐美楊(Populus×canadensis)雜交，從子代群體中選育出來的‘南林895楊’被收入國家林業(yè)和草原局首批林木良種名錄，適于在黃淮、江淮及長江中下游平原地區(qū)推廣種植[11]。本研究利用石蠟切片技術(shù)，對不同發(fā)育時期的美洲黑楊雌、雄花器官進(jìn)行觀察研究，以期明確美洲黑楊花芽分化時間，系統(tǒng)分析不同性別花器官發(fā)育關(guān)鍵階段和相應(yīng)特征，為進(jìn)一步深入研究楊樹花器官發(fā)育及性別分化的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以栽植于南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的成年美洲黑楊為試驗材料，樹高約20 m，冠幅5～6 m，樹冠四周受光均勻，長勢良好，無病蟲害。于2018年6—10月，每隔15 d采集1次雌、雄花芽；2018年11月至2019年3月，每隔30 d采集1次雌、雄花芽，共計采樣15次(編號T1—T15)。樣品編號與采樣時間的對應(yīng)關(guān)系見表1。

表1 采樣時間與樣品編號

1.2 試驗方法

觀察不同生長階段美洲黑楊雌、雄花芽外部形態(tài)特征并測量其長度，每時期7個生物學(xué)重復(fù)。將花芽浸泡于FAA固定液(體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液90 mL，冰醋酸、體積分?jǐn)?shù)為38%的甲醛和丙三醇各5 mL)，固定24 h以上。T11—T15時期的樣品，用手術(shù)刀去除花芽外部鱗片后再進(jìn)行固定。石蠟切片制作參考付盼等[12]的方法，包括：乙醇梯度脫水(體積分?jǐn)?shù)75%、85%、95%乙醇溶液，每梯度脫水各40 min；無水乙醇處理第1次20 min，第2次10 min)、透明處理(無水乙醇與二甲苯體積比 1∶1混合液靜置20 min，后轉(zhuǎn)入二甲苯溶液2次，依次為15 min和10 min)、浸蠟包埋(熔點為58～60 ℃)、切片(厚度8～10 μm)、烘片、脫蠟復(fù)水，并用番紅-固綠雙重染色法染色，封片烘干。將制作好的切片在Axio Imager 2型光學(xué)顯微鏡(ZEISS)下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲黑楊雌、雄花芽外觀形態(tài)特征

在南京地區(qū)，每年成年美洲黑楊的花芽形態(tài)分化始于5月底至6月初，6月中旬至7月中旬(T2—T4)雌花和雄花原基則出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)差異，雄花原基普遍較雌花原基大而飽滿。無論是雌花芽還是雄花芽，苞片在每個生長階段都保持外觀嫩綠、質(zhì)地堅硬、保留2道芽鱗痕(圖1A)。對不同生長階段美洲黑楊雌、雄花芽縱向長度進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示：花芽的生長趨勢呈“S”形(sigmoid)。表現(xiàn)為當(dāng)年6月初至10月初(T1—T9)，花芽長度增幅較大；10月末開始至次年1月(T10—T13)，生長速度增加緩慢，開始進(jìn)入休眠期；次年2月至3月(T14—T15)，花芽逐漸解除休眠，恢復(fù)生長，在T15階段迅猛增長，越發(fā)膨大，部分花芽的芽鱗出現(xiàn)明顯松動直至完全開花(圖1B)。

A.雌、雄花芽外觀形態(tài)對比comparison of appearance and morphology of male and female floral buds；B.雌、雄花芽生長曲線growth curves of male and female floral buds。**.同一時期雌、雄花芽長度存在極顯著差異(P<0.01)。** refered a extremely significant difference in floral bud length between female and male plants at the same stage(P<0.01).

2.2 美洲黑楊雌、雄花芽解剖結(jié)構(gòu)特征

為進(jìn)一步研究美洲黑楊雌、雄花芽形態(tài)分化的基本規(guī)律，利用石蠟切片技術(shù)，對比分析了不同時期雌、雄花芽的解剖結(jié)構(gòu)，并將所觀察到的美洲黑楊花芽發(fā)育過程分為5個階段(Stage Ⅰ-Stage Ⅴ，表2)。

表2 美洲黑楊雌、雄花芽發(fā)育階段

苞片分化期(Stage Ⅰ)：鱗片包裹內(nèi)的雌、雄花序原基外形均呈圓錐形，生長點頂端表面趨于平坦，并在側(cè)面首先分化形成苞片；在6月初，雄花芽長度和寬度均已大于雌花芽，且從苞片的分化和伸長情況來看，雄花序原基較早開始分化。隨著苞片的不斷伸長，花序呈現(xiàn)向頂分化，進(jìn)入小花原基起始期(Stage Ⅱ)：苞片腋部細(xì)胞逐漸分化形成盤狀花原基，隨后其邊緣細(xì)胞不斷膨大形成突起的組織環(huán)；同時，位于雌花芽頂端中央的細(xì)胞不斷擴(kuò)張，呈球形凸起(圖2，T3♀、T4♀)，而此時雄花芽頂端中央的細(xì)胞分化較慢，呈凹陷狀(圖2，T2♂)。

雌蕊分化期(Stage Ⅲ)：花原基四周形成的突起組織環(huán)繼續(xù)增大，最終形成杯狀花被(圖2，T8♀)；9月末，小花頂端出現(xiàn)明顯的二分叉狀結(jié)構(gòu)(圖2，T8♀)，子房已具雛形；11月中旬，形成具有柱頭、花柱和子房的完整雌蕊，即單性雌花(無花瓣結(jié)構(gòu))，柱頭四分裂，子房單室，含2～4心皮，側(cè)膜胎座。根據(jù)Boes等[13]對毛果楊(P.trichocarpa)雌花芽的解剖觀察，孢原細(xì)胞的發(fā)生也在這個時期開始。此后，雌蕊發(fā)育停滯，進(jìn)入冬季休眠期。第2年春季孢原細(xì)胞體積增大，分裂形成大孢子母細(xì)胞，伴隨鱗芽松動，大孢子母細(xì)胞進(jìn)一步分化形成大孢子和胚囊，胚珠倒生(Stage V)。至此，雌花發(fā)育成熟，每朵小花下有膜狀杯形花被(圖2,T13♀)。

雄蕊分化期(Stage Ⅲ)：7月初，在圓盤狀凹陷的分生區(qū)內(nèi)出現(xiàn)很多圓形凸起，即雄蕊原基(圖2，T3♂)；9月下旬，花盤內(nèi)已形成較為明顯的花藥結(jié)構(gòu)(圖2，T8♂)，花藥進(jìn)一步發(fā)育成蝶形花粉囊，可見4個花粉囊室，每個花粉囊室內(nèi)已分化出大量的小孢子母細(xì)胞(圖2，T12♂、T13♂)，此后雄花芽進(jìn)入休眠。第2年春季，小孢子囊最內(nèi)層細(xì)胞發(fā)育成絨氈層，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂，經(jīng)四分體時期最終形成成熟花粉(Stage V)，花藥表皮栓質(zhì)化(圖2，T15♂)，最終開裂促進(jìn)傳粉。辛昊陽等[14]對美洲黑楊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程進(jìn)行了詳細(xì)觀察，同樣發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂始于3月中旬，在花序露出鱗片之前完成，但未明確指出美洲黑楊成熟花粉粒的類型。董源[15]曾報道毛白楊(P.tomentosa)的成熟花粉為二核花粉粒。而判斷美洲黑楊成熟花粉粒的類型仍需對小孢子到花粉粒的發(fā)育過程進(jìn)行持續(xù)觀察。

圖2 不同發(fā)育時期美洲黑楊雌、雄花芽解剖學(xué)觀察

3 討 論

開花是有花植物生長發(fā)育過程的重要轉(zhuǎn)折點，植物的成花調(diào)控可以分為3個階段：開花誘導(dǎo)(floral induction)、花的發(fā)端(floral evocation)和花器官發(fā)育(floral organ development)[16-17]。不同于草本模式植物擬南芥，楊樹在完成童期向成年期轉(zhuǎn)變后，每年1次的季節(jié)性開花都需經(jīng)歷上述3個階段才能成花[18]。Yuceer等[19]通過對22 a樹齡的成年美洲黑楊開展長期調(diào)查，提出了跨越3 a的開花周期：第1個生長季的5—9月枝條頂端形成鱗芽，鱗芽在冬季經(jīng)歷休眠和春化作用；第2個生長季的3—9月，由頂端鱗芽發(fā)育而成的當(dāng)年生枝條由下向上可以分為3個區(qū)域，即營養(yǎng)區(qū)I(vegetative zone I)→開花區(qū)(floral zone)→營養(yǎng)區(qū)Ⅱ(vegetative zone Ⅱ)，只有位于開花區(qū)的腋芽經(jīng)過成花誘導(dǎo)和花的發(fā)端才能發(fā)育為肉眼可見的花芽，完成花器官發(fā)育并在冬季再次經(jīng)歷休眠；第3個生長季的3—5月開花，完成傳粉和受精過程。本研究在6月初所采集到的雌、雄花芽已經(jīng)完成了成花誘導(dǎo)和花的發(fā)端，進(jìn)入花器官發(fā)育階段。雌、雄花芽在T1階段雖然與營養(yǎng)芽形態(tài)相似，但并不是營養(yǎng)芽向生殖芽轉(zhuǎn)變的過渡階段，而是已經(jīng)處于花器官分化初期。此外，不同于擬南芥的4輪完全花，美洲黑楊為柔荑花序，其花結(jié)構(gòu)僅由苞片和雄蕊或雌蕊兩輪結(jié)構(gòu)組成，這種高度退化的花器官及緊密排列的花序結(jié)構(gòu)可能是楊柳科植物趨同進(jìn)化(convergent evolution)的結(jié)果，更有利于傳粉和受精[20]。

楊屬植物為雌雄異株(偶然存在雌雄同株的情況)，是研究植物性別決定遺傳機制的理想材料之一。Mitchell等[21]根據(jù)花發(fā)育過程將單性花分為兩種類型：Ⅰ型，在花發(fā)育過程中存在同時具備雌蕊和雄蕊的階段，在發(fā)育完成之前某一性別的花器官發(fā)生敗育，最終產(chǎn)生單性花；Ⅱ型，整個花發(fā)育過程僅出現(xiàn)一種性別的花器官。因此，在完成發(fā)育的Ⅰ型單性花中仍然可以看到殘存的、不育的相反性別花器官，將具有這種單性花的雌雄異株植物稱為隱性雌雄異株[22]，如柿子[23]、獼猴桃[24]等。本研究通過對美洲黑楊雌、雄花芽完整發(fā)育過程的解剖學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在雌或雄花芽苞片腋部發(fā)生的花器官原基僅發(fā)育成雌蕊或雄蕊，因此美洲黑楊雌花和雄花均為Ⅱ型單性花，其性別分化應(yīng)該發(fā)生在心皮原基和雄蕊原基起始之前。研究花芽發(fā)育和分化規(guī)律，探究花芽外部形態(tài)與內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，不僅為解析植物成花和花器官發(fā)育特征基因，揭示植物性別分化分子機制等前沿理論研究提供重要基礎(chǔ)，還可為生產(chǎn)實踐中優(yōu)異種質(zhì)資源的選育和管理等提供參考依據(jù)。例如，對不同品種大蒜(Alliumsativum)花芽分化進(jìn)程進(jìn)行解剖觀察，明確了花芽分化時間與品種熟性的關(guān)系，對栽培過程中調(diào)控大蒜抽薹開花具有指導(dǎo)意義[25]；對刺槐(Robiniapseudoacacia)不同時期花蕾外部形態(tài)與雌雄配子發(fā)育特征的剖析可為花器官離體培養(yǎng)接種外植體的選擇提供依據(jù)[26]；對青錢柳(Cyclocaryapaliurus)雌、雄花芽分化外部形態(tài)和內(nèi)部發(fā)育進(jìn)程相關(guān)性的研究可為選育優(yōu)質(zhì)青錢柳種質(zhì)和選擇栽培管理措施提供基礎(chǔ)[27]；對麻瘋樹(Jatrophacurcas)花發(fā)育形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)的研究可為人工增加麻瘋樹雌雄花比例、提高掛果率和種籽產(chǎn)量提供依據(jù)[28]。三倍體楊樹具有速生、優(yōu)質(zhì)、抗病等優(yōu)勢，利用2n花粉進(jìn)行雜交是培育三倍體楊樹的重要途徑[29]。辛昊陽等[14]詳細(xì)記錄了美洲黑楊小孢子母細(xì)胞的發(fā)生過程，為人工誘導(dǎo)2n配子的適時取材提供了參考。本研究對美洲黑楊雌、雄花芽發(fā)育關(guān)鍵時期開展了詳細(xì)的觀察和分析，將有助于指導(dǎo)楊樹的人工授粉，提高雜交概率。