下調(diào)TTK表達改善膠質母細胞瘤裸鼠的生存預后

冒 平 王乙锠 王 拓 杜昌旺 王茂德

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有侵襲性強、預后差等特點[1]。目前，GBM 即使接受“手術+替莫唑胺同步放化療+輔助化療”的標準治療方案，或“手術+替莫唑胺同步放化療+輔助化療+電場治療”的新型治療方案，中位生存期仍不超過2 年[2，3]。研究表明，獲得性放化療抵抗是導致GBM復發(fā)和治療失敗的主要原因[4]。近年來，越來越多的研究表明異常激活的蛋白激酶與多種腫瘤的耐藥和復發(fā)密切相關[5，6]。蘇氨酸/酪氨酸激酶（threonine tyrosine kinase，TTK）是一種雙重特異性激酶，過度激活會產(chǎn)生大量的有絲分裂異常紡錘體，促進腫瘤的發(fā)生[7]，TTK 高表達與胃癌[8]、胰腺癌[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]和前列腺癌[12]等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和不良預后有關。本研究探討TTK在GBM中的表達變化及其作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑U251 細胞系購自南京拜睿生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，Accutase 細胞消化液、細胞凋亡試劑盒、細胞周期試劑盒購自美國Sigma公司，細胞RNA提取試劑盒、反轉錄PCR 試劑盒、實時定量PCR 試劑盒、Alarma blue 試劑盒購自美國Invitrogen 公司，ECL 化學發(fā)光試劑盒購自美國Santa Cruz 公司，抗TTK 抗體、抗β-actin 抗體、辣根過氧化物酶標記（HRP）的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠IgG二抗購自英國Abcam 公司，NuPAGE Bis-Tris 蛋白質電泳凝膠購自美國Thermo Fisher 公司，GFP-shTTK 慢病毒包裝顆粒購自美國ORIGene 公司，結晶紫試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司，DAB 試劑盒購自美國Vector公司。

1.2 生信分析 利用TCGA GBM數(shù)據(jù)庫分析538種人類蛋白激酶編碼基因的差異性表達，生存曲線分析分析671例膠質瘤TTK表達水平與病人生存預后的關系。

1.2.1 數(shù)據(jù)獲取和處理 從TCGA官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載膠質瘤組織轉錄組數(shù)據(jù)，共獲得671例膠質瘤的基因表達及臨床信息。利用R 語言（R version 4.04）將人類基因組注釋文件與counts 數(shù)據(jù)合并處理，形成TCGA GBM 基因表達矩陣。

1.2.2 基因差異性表達分析 對比分析538種人類蛋白激酶編碼基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)GBM差異性高表達的目標蛋白激酶編碼基因，繪制基因表達曲線；進一步分析各亞型GBM 及正常腦組織TTK 表達水平。

1.2.3 生存曲線分析 利用GEPIA2 生信分析官網(wǎng)（http://gepia2.cancer-pku.cn/），分析目標蛋白激酶編碼基因在低級別膠質瘤（low-grade glioma，LGG）和GBM 中的差異性表達及臨床預后的關系，繪制生存曲線。

1.3 免疫組化染色 利用我院生物樣本庫建立的60例腦膠質瘤組織芯片進行TTK 免疫組化染色分析。60例中，男34例，女26例；WHO分級Ⅰ級8例，Ⅱ級10例，Ⅲ級19例，Ⅳ級23例。染色步驟：常規(guī)脫蠟及水化組織芯片；應用免疫組化抗原修復液（檸檬酸法）修復20 min，每隔5 min煮沸一次，自然冷卻至室溫，蒸餾水浸泡10 min；每張切片加入50 μl 過氧化酶阻斷液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次；加入10%正常山羊血清室溫孵育1 h，去除血清，加入一抗（1:200）4 ℃過夜，PBS洗滌2次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:1 000）室溫孵育1 h，PBS洗滌2次；加入DAB辣根過氧化物酶溶液室溫孵育3～5 min，光鏡下觀察切片染色情況，流水沖洗以終止染色；蘇木素復染，PBS洗滌；乙醇溶液脫水，滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。免疫組化染色結果由2名實驗員依據(jù)德國免疫組化標準評分[13]。陽性細胞比率評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞比率<10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～80%為3 分，>80%為4 分。染色強度評分：無染色為0分，弱染色為1 分，中度染色為2分，強染色為3 分。陽性細胞比率評分與染色強度評分乘積<5分為低表達，≥5分為高表達。

1.4 細胞實驗

1.4.1 細胞培養(yǎng) U251 細胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3 d換液一次；Accutase細胞消化液分離細胞，800 轉/min 離心，棄上清并重懸細胞，完成細胞傳代。常規(guī)凍存細胞，保證充足細胞儲備。

1.4.2 慢病毒轉染細胞 制備單細胞懸液，以1×105個/孔密度接種于6 孔培養(yǎng)板孵育8 h。待細胞完全貼壁后，將25 μl shTTK 慢病毒溶液、4 μl 聚凝胺與4 ml DMEM/F12 培養(yǎng)基混勻，加入6 孔板中培養(yǎng)24 h。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluo?rescent protein，GFP）表達情況，轉染滿意后，800 轉/min 離心5 min，收集沉淀并加入5 ml 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞繼續(xù)培養(yǎng)。采用qRT-qPCR和免疫印跡法驗證慢病毒轉染效率。

1.4.3 細胞增殖實驗 利用Alarma blue試劑盒測定細胞增殖能力。細胞重懸后以200 μl（1×103個/孔）接種于96 孔培養(yǎng)板，加入10%Alarma blue 試劑，37 ℃孵育8 h，熒光分光光度計測定每孔讀數(shù)。分組：shNT 組（RNA 干擾陰性對照組），shTTK #1 組（TTK敲低組1）和shTTK#2組（TTK敲低組2）。每個實驗組設3個復孔，繪制體外細胞增殖曲線。

1.4.4 細胞克隆形成實驗 以1×103個/孔接種于6 孔培養(yǎng)板。分組：shNT 組（RNA 干擾陰性對照組），shTTK#1組（TTK敲低組1）和shTTK#2組（TTK敲低組2）。每個實驗組設3個復孔。37 ℃孵育，每隔3 d換液一次，14 d 后PBS 洗滌細胞，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定45 min，PBS 洗滌后每孔加入結晶紫溶液1 ml 染色20 min，PBS 洗滌后熒光顯微鏡下拍照并計數(shù)。

1.4.5 細胞凋亡與周期實驗 分組：shNT 組（RNA 干擾陰性對照組），shTTK 組（TTK 敲低組）。細胞凋亡實驗：收集、重懸細胞于24孔培養(yǎng)板，初始接種濃度為1×106個/孔；空白對照組內(nèi)加入等體積PBS 液；預冷4 ℃PBS 洗滌細胞2 次（800 轉/min 離心5 min，棄PBS 液）；依次加入500 μl Annexin V 結合緩沖液+5 μl Annexin V-FITC液+5 μ PI液混勻，室溫避光染色10 min，1 h 內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞周期實驗：收集、重懸細胞并接種于24孔培養(yǎng)板，初始接種濃度為1×106個/孔；空白對照組內(nèi)加入等體積PBS液；預冷4 ℃PBS洗滌細胞2次（800轉/min離心5 min，棄PBS液）；預冷70%乙醇固定細胞，4 ℃冰箱過夜；離心并棄去乙醇液，4 ℃預冷PBS 洗滌細胞；加入500 μl PI+100 μg/ml RNaseA 液混勻；室溫避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.4.6 實時定量熒光PCR（qRT-qPCR）采用細胞RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，Nanodrop 2000 紫外分光光度計測定RNA濃度；采用反轉錄PCR試劑盒進行反轉錄，合成cDNA。PCR擴增cDNA：每孔加入2.5 μl cDNA、0.5 μl 正向引物（0.5 μmol/L）、0.5 μl反向引物（0.5 μmol/L）、1.5 μl DNase/RNase-free 蒸餾水和5 μl SYBR Green試劑；94°C預加熱2 min，40個循環(huán)（94 °C、30 s，60 °C、30 s，72 °C、40 s）。以GAPDH作為內(nèi)參。引物序列：TTK正義鏈5'-TCAT?GCCCATTTGGAAGAGTC-3'，反義鏈5'-CCACTTG?GTTTAGATCCAGGC-3'；GAPDH正義鏈5'-GGAGC?GAGATCCCTCCAAAAT-3'，反 義 鏈5'-GGCTGTT?GTCATACTTCTCATGG-3'。

1.4.7 免疫印跡法 收集并裂解細胞，得到純化蛋白樣本；將提純的10 μg蛋白樣本加入Bis-Tris 蛋白質電泳凝膠孔內(nèi)，在電壓100 V 的條件下電泳30 min，在30 V 條件下室溫轉膜1 h；加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 液反復漂洗3 次；加入一抗目標蛋白4 ℃孵育過夜；加入二抗蛋白后室溫孵育1 h；TBST液反復漂洗3 次，按ECL 化學發(fā)光試劑盒使用說明進行顯色處理，X 線曝光后，常規(guī)顯影、定影。使用Image J對結果進行量化，以β-actin為內(nèi)參。

1.5 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗 分組：shNT 組（RNA 干擾陰性對照組），shTTK#1組（TTK敲低組1），shTTK#2組（TTK 敲低組2）。選取6 周齡30 只裸鼠進行腦腫瘤原位成瘤實驗，每組10只。將細胞重懸為單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml，取10 μl 細胞懸液于無菌EP 管內(nèi)，冰盒上保存。腹腔注射0.05 ml 氯胺酮（100 mg/ml）及甲苯噻嗪（100 mg/ml）混合液麻醉裸鼠，利用立體定向儀固定裸鼠門齒及雙側乳突；微量注射器吸取6 μl 細胞懸液，固定并調(diào)零注射系統(tǒng)，注射速度設定為0.5 μl/min。碘伏消毒后，切開裸鼠頭皮，暴露骨膜，于矢狀縫右側前、外各2mm顱骨微型磨鉆鉆孔，直達硬腦膜；將微量注射器沿骨空垂直刺入裸鼠右額葉內(nèi)，深度距顱骨外板約3.5 mm；開啟注射系統(tǒng)，于裸鼠右額葉內(nèi)注入混懸細胞。注射完畢后，緩慢退出注射器，每分鐘拔出1 mm，直至完全退出，骨蠟封堵骨孔，縫合頭皮并消毒。將裸鼠置于30 ℃恒溫加熱板上，待麻醉恢復后，分籠飼養(yǎng)。每日觀察并記錄裸鼠情況，出現(xiàn)消瘦、弓背、癲癇及活動障礙等癥狀認為裸鼠腦內(nèi)已成瘤，當出現(xiàn)嚴重消瘦（體重下降超過40%）、癱瘓、持續(xù)性癲癇、無力攝食或飲水等嚴重癥狀認為裸鼠處于瀕死狀態(tài)[14]。安樂法處死裸鼠（腹腔內(nèi)注射氯胺酮及甲苯噻嗪+頸椎脫位法），Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件分析；定量資料以±s表示；采用單因素方差分析和LSD-t檢驗；Ka?plan-Meier 法繪制生存曲線；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生信分析結果538 種人類蛋白激酶編碼基因中，TTK 是GBM 表達水平最高的蛋白激酶之一（圖1A）。GBM 亞型[15]分析表明，TTK 在原神經(jīng)型（Pro?neural）、間質型（Mesenchymal）及經(jīng)典型（Classical）GBM 中的表達水平均明顯高于正常腦組織（圖1B）。GBM組織TTK的表達水平明顯高于LGG及正常腦組織（圖1C）。671 例腦膠質瘤病人中，TTK 低表達病人的總生存期更長（圖1D）。

圖1 GBM組織TTK表達的生信分析

2.2 我院膠質瘤病例TTK表達結果60例中，低表達28例（WHO分級Ⅰ級7例，Ⅱ級8例Ⅲ級8例，Ⅳ級5例），高表達32例（WHO 分級Ⅰ級1例、Ⅱ級2例，Ⅲ級11 例，Ⅳ級18 例；圖2）。高級別膠質瘤TTK 高表達率（69.0%，29/42）明顯高于LGG（16.7%，3/18；P<0.05）。

圖2 不同級別腦膠質瘤TTK表達的免疫組化染色（×200）

2.3 下調(diào)TTK 表達抑制U251 細胞增殖、促進細胞凋亡 與shNT組相比，shTTK#1組和shTTK#2組U251細胞TTK mRNA 和蛋白表達水平均明顯降低（P<0.05，圖3），細胞增殖及克隆形成能力均明顯降低（P<0.05，圖4）；而shTTK#1組和shTTK#2組之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05；圖4）。與shNT組相比（7.69%±0.39%），shTTK 組細胞凋亡率（21.79%±2.35%）明顯增高（P<0.05），G1 期細胞比例明顯增高（P<0.05；圖5），S期細胞比例明顯降低（P<0.05；圖5）。

圖3 shRNA干擾對U251細胞TTK表達的抑制效果

圖4 下調(diào)TTK表達對U251細胞增殖及克隆形成的影響

圖5 下調(diào)TTK表達對U251細胞周期的影響

2.4 下調(diào)TTK表達延長GBM裸鼠生存期 與shNT組相比，shTTK#1 組和shTTK#2 組裸鼠生存期明顯延長（P<0.05，圖6），而shTTK#1組和shTTK#2組之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05；圖6）。

圖6 下調(diào)TTK表達對U251細胞移植瘤裸鼠生存期的影響

3 討論

近年來，研究表明異常激活的蛋白激酶與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療抵抗及復發(fā)密切相關[5，6，16]。TTK是有絲分裂過程中調(diào)控染色體精確分離的重要檢查點蛋白，與細胞增殖密切相關[17]。研究表明，異常激活的TTK 可通過影響著絲粒定位和紡錘體組裝檢查點，導致染色體不穩(wěn)定和有絲分裂的紊亂，促進惡性腫瘤細胞的生長和遷移[18]。本研究發(fā)現(xiàn)GBM 組織TTK 呈高水平表達；特異性下調(diào)TTK 表達明顯抑制膠質瘤U251 細胞增殖、克隆形成能力，促進細胞凋亡，延長膠質瘤裸鼠生存期。這提示TTK 過表達促進GBM細胞增殖，與病人不良預后有關。

研究表明，多種特異性蛋白激酶抑制劑可有效抑制體內(nèi)外腫瘤細胞增殖[19，20]。Stratford等[21]研究發(fā)現(xiàn)特異性TTK小分子抑制劑可通過調(diào)控紡錘體組裝檢查點，誘導細胞周期停滯，進而降低染色體穩(wěn)定性并抑制胰腺癌細胞增殖。臨床研究發(fā)現(xiàn)，兩種新的TTK 抑制劑BAY 1161909 和BAY 1217389 具有非常好的抗腫瘤活性[22]。并且，這些特異性TTK 小分子抑制劑在提高抗腫瘤藥效的同時，可有效減少腫瘤的耐藥性[23]。研究表明，HLF 介導的miR-132 可靶向抑制TTK的表達，從而抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和治療抵抗[24]。我們的前期研究表明，線粒體裂變調(diào)節(jié)因子2（MTFR2）是TTK 最相關的基因之一，可通過激活TTK 啟動子增強TTK 的轉錄，從而促進膠質瘤干細胞的增殖[25]。然而，TTK 促進GBM 細胞增殖的上下游分子調(diào)控機制仍有進一步研究。

綜上所述，GBM 組織TTK 呈高水平表達，具有促進細胞增殖及抑制細胞凋亡的作用，與GBM的不良預后相關。