2種麻醉劑對紅耳龜麻醉時效及聽力的影響

雷金洪，王同亮，鐘香香，簡彤，楊昌玉，史海濤，汪繼超

（熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點實驗室，海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，?？?71158）

麻醉是開展電生理實驗的重要環(huán)節(jié)之一，麻醉劑的種類及其劑量對實驗效果產(chǎn)生較大影響。目前常用的麻醉劑分為2類：吸入性麻醉劑和非吸入性麻醉劑（李丹等，2017；王丹等，2021）。常用的吸入性麻醉藥有乙醚、氟烷、氯仿、甲氧氟烷、地氟醚和異氟醚等（Mongo & Vassort，1990；姜龍等，2014；Gentili，2020；Whiteet al.，2021）；常用的非吸入性麻醉劑為水合氯醛和戊巴比妥鈉等（Yana?gawaet al.，2016；肖美等，2020；Reimeret al.，2020；劉燕等，2021）。吸入性麻醉能較好的控制麻醉深度，使被麻醉對象快速進入麻醉狀態(tài)，且蘇醒迅速、平穩(wěn)（李鈺等，2014），但該類麻醉劑價格相對昂貴、易揮發(fā)、可引起動物喉痙攣（胡雄飛等，2020；王丹等，2021）；非吸入性麻醉操作簡單，可通過皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、口服及直腸灌注等方式對動物進行麻醉，具有較好的麻醉效果（孫樂天，穆曉麗，2011；姜龍等，2014；彭浩，趙妮妮，2016；Reynoldset al.，2016；保明偉等，2020）。麻醉誘導(dǎo)時間和麻醉持續(xù)時間是評價麻醉效果的重要指標(biāo)（Wixsonet al.，1987；Roderet al.，1993；Wadaet al.，1995；李少春等，2014；Caoet al.，2016；胡雄飛等，2020）。麻醉誘導(dǎo)時間短可使動物迅速進入麻醉狀態(tài)；麻醉持續(xù)時間長可減少或消除動物疼痛，符合動物福利要求（胡雄飛等，2020）。不同麻醉劑對同一動物的麻醉效果不同，且同一麻醉劑對不同動物類群的麻醉效果也存在較大差異。因此，麻醉劑選取需綜合考慮麻醉對象、麻醉時效、實驗需求等因素。

聽覺是動物進行聲音通訊的必要環(huán)節(jié)，敏感的聽覺有利于提高聲音通訊效率。聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）是一種通過記錄聽覺誘發(fā)電位來反映動物聽力敏感性的電生理測試方法（Tsubokawaet al.，1980；Greenberg，2007；Zaitounet al.，2017）。該方法主要測定動物的可聽范圍、ABR閾值、反應(yīng)時間等指標(biāo)，其中可聽范圍寬、ABR閾值低、反應(yīng)時間短，表明動物的聽覺越敏感。目前，該方法因具有無損傷、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點，被廣泛用于魚類、兩棲類、爬行類、哺乳類等動物的聽力敏感性研究（Corwinet al.，1982；Ken?yonet al.，1998；Brittan-Powellet al.，2010；Wolfet al.，2017；Wanget al.，2019；Teubenbacheret al.，

2020）。采用該方法測定聽力時，需對動物進行深度麻醉。不同的麻醉劑可導(dǎo)致聽覺測定結(jié)果產(chǎn)生差異，且同一麻醉劑及其劑量對不同動物類群聽力測定也產(chǎn)生較大影響（Looijet al.，2004；Rueb?hausenet al.，2012；Carrascoet al.，2019）。因此，在開展動物聽力研究過程中需選擇合適的麻醉劑及其劑量。

龜類是現(xiàn)生爬行動物中的古老類群（Clack，1997）。與其他動物類群相比，龜類聽覺的可聽范圍相對較窄（通常小于1 kHz）。龜類聽力的相關(guān)研究中常采用戊巴比妥鈉對動物進行麻醉（Heardet al.，2001；Wanget al.，2019），目前因管控提升，該藥物開始限制使用。因此，需選取和評估其他麻醉劑對龜類的麻醉效果及其對聽力敏感性的影響。水合氯醛是一種常用的非吸入性麻醉劑，小劑量可鎮(zhèn)靜、中劑量可催眠、大劑量可引起昏迷和麻醉（徐平，2007；周潔等，2010）。水合氯醛適用于心肌功能試驗、電生理試驗（周昆，屈彩芹，2008；Valenzuelaet al.，2016），被認(rèn)為是一種安全、有效的麻醉劑（Reich & Wiatrak，1996；Valenzuelaet al.，2016；Fonget al.，2021）。目前尚無相關(guān)研究評估水合氯醛對龜類的麻醉效果及其用于該類群聽覺研究的可行性。本研究選取了成體雌性和雄性紅耳龜Trachemys scripta elegans作為研究對象，通過比較麻醉起效時間、維持時間及可聽范圍、ABR閾值、反應(yīng)時間，評估了2種麻醉劑對紅耳龜?shù)穆樽硇Ч吐犃Φ挠绊?。研究結(jié)果將為龜鱉動物的麻醉及聽力的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2021年6月13日從?？谖牟旝M養(yǎng)殖專業(yè)合作社購置雌性（體質(zhì)量：911.39 g±61.37 g，n=16）和雄性（體質(zhì)量：871.06 g±76.64 g，n=16）紅耳龜，置于海南師范大學(xué)生態(tài)園龜鱉養(yǎng)殖池（長200 cm×寬100 cm×高25 cm）馴化。飼養(yǎng)過程中每隔3 d投放足量鱷龜糧（5#，海豚水族有限公司）1次，當(dāng)日取出剩余食物，清洗養(yǎng)殖池并換水。馴化1周，期間環(huán)境溫度29~31℃。實驗時將紅耳龜隨機分成4組，每組8只：A組為注射水合氯醛雄性，B組為注射水合氯醛雌性，C組為注射戊巴比妥鈉雄性，D組為注射戊巴比妥鈉雌性。動物個體處于深度麻醉狀態(tài)時，進行后續(xù)電生理實驗。動物處于深度麻醉狀態(tài)的判斷方法：注射麻醉劑30 min后，采用鑷子輕輕刺激動物的后肢肌肉和眼角膜無明顯反應(yīng)。如果動物尚未處于深度麻醉狀態(tài)，則按照首次注射劑量的20%進行補加注射（Wanget al.，2019）。實驗結(jié)束后，將實驗動物置于水桶中（未加水），并在龜?shù)谋臣咨细采w濕抹布，待實驗動物清醒后，置于養(yǎng)殖池中飼養(yǎng)。實驗動物處理程序已獲得海南師范大學(xué)海南省生態(tài)環(huán)境教育中心實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)（HNECEE-2018-001）。

1.2 動物麻醉

選取水合氯醛（CAS No.：302-17-0；天津市大茂化學(xué)試劑廠，天津）和戊巴比妥鈉（CAS No.：57-33-0；山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，山東）為麻醉劑，研究這2種麻醉劑對紅耳龜?shù)穆樽頃r效。麻醉劑的配置及劑量如下：將0.10 g戊巴比妥鈉加入20.00 mL生理鹽水中，配制成0.5%的混合溶液，實驗前測量紅耳龜?shù)捏w質(zhì)量，按照3.00 mL·kg?1的劑量，注射到實驗對象的后肢肌肉中（Wanget al.，2019）。將0.50 g水合氯醛加入10.00 mL蒸餾水中，配置成5%的混合溶液，按照6.00 mL·kg?1的劑量，注射到實驗對象的腹腔內(nèi)。水合氯醛的濃度和劑量為本課題組前期經(jīng)大量實驗確定，該濃度和劑量對紅耳龜具有較好的麻醉效果，且個體清醒后能夠長期正常存活。為保證麻醉效果，實驗過程中麻醉劑現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 麻醉時效指標(biāo)

本研究采用麻醉起效時間和麻醉維持時間評價2種麻醉劑的麻醉時效。麻醉起效時間是指從注射麻醉劑開始到動物剛進入深度麻醉狀態(tài)（無明顯角膜反應(yīng)）的時間。麻醉維持時間是指從動物剛進入深度麻醉狀態(tài)開始到動物開始具有明顯角膜反應(yīng)的時間。

1.4 ABR測試

ABR測試系統(tǒng)主要包括神經(jīng)生理工作站（RZ6 Multi-I/O Processor；Tucker-Davis Technolo?gies，Alachua，F(xiàn)L，USA）、前 置放大器（RA4PA；Tucker-Davis Technologies，Alachua，F(xiàn)L，USA）及低阻抗數(shù)字探頭（TDT RA4LI；Tucker-Davis Technolo?gies，Alachua，F(xiàn)L，USA）。設(shè)備的連接、參數(shù)設(shè)置、校準(zhǔn)、聲音信號刺激的產(chǎn)生和呈現(xiàn)參考Wang等（2019）的研究。實驗過程中測定純音刺激和點刺激2種類型的聲音刺激下紅耳龜?shù)穆犃γ舾行浴＜円舸碳さ拇碳ゎl率為0.2~1.5 kHz，每個頻率的刺激時間長度為9 ms，2 ms上升/下降，采樣頻率為24 414 Hz，聲壓從35 dB 到90 dB，以5 dB 的間隔遞增。點刺激的刺激時長為0.1 ms，其中249 ms 的刺激間隔，聲壓從35 dB 到90 dB，以5 dB 的間隔遞增。刺激頻率4 次/s。每個ABR 波形疊加200次。ABR 閾值的確定方法：同一頻率下不同聲強對應(yīng)的所有ABR 波形圖中，通過視覺檢測可重復(fù)的波形，所有可重復(fù)的波形中所對應(yīng)的最低聲壓級，即為ABR 閾值。反應(yīng)時間是指在ABR 波形圖中，聲壓為75 dB 時第一個出現(xiàn)的波谷對應(yīng)的時間。實驗期間，溫度29~31 ℃，濕度66%~72%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 和SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)分布（Kolmogorov-Smirnov test）和方差齊性檢驗（Levene test）。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）分析不同組間麻醉起效時間及麻醉維持時間的差異顯著性；采用獨立樣本t檢驗分析不同組別ABR 閾值及反應(yīng)時間的差異顯著性。顯著水平設(shè)置為α=0.05。數(shù)據(jù)以±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 2種麻醉劑對紅耳龜麻醉效果的影響

水合氯醛的麻醉起效時間（雄性：65.75 min±4.09 min；雌性：66.25 min±3.27 min）和維持時間（雄性：409.13 min±10.04 min；雌性：403.52 min±11.77 min）在兩性間均無顯著差異（P>0.05）；戊巴比妥鈉的麻醉起效時間（雄性：32.38 min±3.24 min；雌性：31.88 min±2.52 min）和維持時間（雄性：182.63 min±5.98 min；雌性：184.13 min±6.45 min）在兩性間也均無顯著差異（P>0.05），但水合氯醛的麻醉起效時間（66.00 min±3.71 min）和維持時間（406.44 min±11.32 min）均顯著長于戊巴比妥鈉的麻醉起效時間（32.13 min±2.91 min）和維持時間（183.38 min±6.26 min）（P<0.05）。

2.2 2種麻醉劑對紅耳龜可聽范圍的影響

紅耳龜聽力閾值呈U 型，可聽范圍為0.2~1.2 kHz，在0.5~0.7 kHz最敏感（圖1）。

2.3 2種麻醉劑對紅耳龜聽覺閾值的影響

在可聽范圍內(nèi)，2 種麻醉劑對雄性紅耳龜?shù)腁BR 閾值影響無顯著差異（P>0.05；圖1：A）。雌性在 0.6~1.2 kHz 范圍內(nèi)，B 組高于 D 組，但差異不顯著（P>0.05；圖1：B）。

圖1 2種麻醉劑對雄性（A）和雌性（B）紅耳龜聽力閾值的比較Fig. 1 Comparison of hearing threshold of 2 anesthetics in male（A）and female（B）Trachemys scripta elegans

2.4 2種麻醉劑對紅耳龜聽覺反應(yīng)時間的影響

A 組在0.7~1.2 kHz 范圍內(nèi)的反應(yīng)時間高于C 組，但差異不顯著（P>0.05；圖2：A）；B 組在0.3~0.8 kHz 范圍內(nèi)的反應(yīng)時間高于D 組，但差異不顯著（P>0.05；圖2：B）。

圖2 2種麻醉劑對雄性（A）和雌性（B）紅耳龜反應(yīng)時間的比較Fig. 2 Comparison of latency of 2 anesthetics to male（A）and female（B）Trachemys scripta elegans

3 討論

合理有效的麻醉劑及其劑量有助于保障實驗結(jié)果的可靠性，也是實驗動物福利的要求（Zurloet al.，1996；孫安會等，2016；李丹等，2017）。大量研究評估了戊巴比妥鈉和水合氯醛對動物的麻醉效果，并得到了不同的研究結(jié)論。楊亞南等（2018）發(fā)現(xiàn)，按體質(zhì)量 400 mg·kg?1、40 mg·kg?1分別腹腔注射10%水合氯醛和2%戊巴比妥鈉后，水合氯醛組Wistar 大鼠Rattus norvegicus的麻醉起效時間（6.2 min±1.2 min）和維持時間（106.6 min±5.2 min）顯著低于戊巴比妥鈉組的麻醉起效時間（11.9 min±1.5 min）和維持時間（123.4 min±8.8 min），說明戊巴比妥鈉對Wistar 大鼠的麻醉效果更好，這與Schulz 等（2004）和李貽奎（2012）的研究結(jié)果一致。陳紅燕等（2017）發(fā)現(xiàn)，與腹腔注射2%戊巴比妥鈉（45 mg·kg?1）相比，10%水合氯醛（350 mg·kg?1）麻 醉 SD 大 鼠的起效 時間更短，深度麻醉時間適當(dāng)，且首次麻醉成功率更高，方法更簡便。相關(guān)研究結(jié)果（Fieldet al.，1993；程曉峰等，2005；蔣文臣等，2014；鐘渝，孫丹寧，2014）也支持這一結(jié)論。楊悅等（2012）和Ganigara等（2019）認(rèn)為，這2種麻醉劑的麻醉效果并無明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)，與戊巴比妥鈉相比，腹腔注射水合氯醛麻醉起效時間（66.00 min±3.71 min）和維持時間（406.44 min±11.32 min）均較長。麻醉起效時間和維持時間明顯大于先前嚙齒類動物中的相關(guān)研究結(jié)果。因此，水合氯醛（5%、300 mg·kg?1）和戊巴比妥鈉對紅耳龜均具有較好的麻醉效果。戊巴比妥鈉具有更短的麻醉起效時間，而水合氯醛能夠維持更長時間的麻醉狀態(tài)。

由于麻醉劑和劑量對腦干神經(jīng)元的反應(yīng)特性具有顯著的調(diào)節(jié)作用，因此麻醉劑的類型和劑量可能影響動物聽力的測定（Carrascoet al.，2019）。研究發(fā)現(xiàn)，與清醒狀態(tài)相比，氯胺酮/甲苯噻嗪導(dǎo)致動物聽覺反應(yīng)時間顯著增加，聽覺閾值顯著升高（Smith & Mills，1991；Looijet al.，2004）；采用異氟醚麻醉小鼠Mus musculus的聽覺閾值較氯胺酮麻醉的顯著提高（Ruebhausenet al.，2012）；采用烏拉坦麻醉豚鼠Cavia porcellus，聽覺閾值和振幅不受影響，但可能通過阻滯突觸傳導(dǎo)而引起聽神經(jīng)動作電位和中樞傳導(dǎo)時間延長，導(dǎo)致聽覺反應(yīng)時間延長（丁大連，張志堅，1995）。Bobbin 等（1979）的研究結(jié)果表明，戊巴比妥鈉不會影響大鼠的聽覺反應(yīng)時間和振幅強度。Wang 等（2019）和Wang 等（2021）發(fā)現(xiàn)，戊巴比妥鈉是用于開展龜類聽力研究的理想麻醉劑。本研究發(fā)現(xiàn)，采用水合氯醛和戊巴比妥鈉麻醉的紅耳龜?shù)穆犛X閾值和反應(yīng)時間均無顯著差異，因此水合氯醛也可用于開展紅耳龜聽力的研究。

本研究首次評估了5%水合氯醛和0.5%戊巴比妥鈉對紅耳龜麻醉效果及聽力的影響。2 種麻醉劑對龜類均具有較好的麻醉效果，且戊巴比妥鈉具有更短的麻醉起效時間，而水合氯醛能夠維持更長時間的麻醉狀態(tài)。因此可根據(jù)具體實驗過程中的時效性，合理選取麻醉劑。此外，本研究結(jié)果表明水合氯醛和戊巴比妥鈉均可用于開展紅耳龜聽力的研究。結(jié)合水合氯醛致死率低、來源可靠、性價比高等優(yōu)點（蔣文臣等，2013；陳紅燕等，2017；王丹等，2021），以及開展聽力測定的時間要求，建議優(yōu)先選用水合氯醛作為麻醉劑開展龜類聽覺的研究。