雌激素調(diào)節(jié)自噬的細(xì)胞保護作用研究進展

孫琦，張紅綜述 趙自剛審校

雌激素包括雌酮、17β-雌二醇(17β estradiol，E2)、雌三醇，通過雌激素受體(estradiol receptors，ERs)發(fā)揮作用，參與諸多生理功能的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞的生長、分化、代謝和死亡等。生理條件下，細(xì)胞自噬是細(xì)胞代謝過程中的衰老細(xì)胞器和異常蛋白質(zhì)等成分降解的過程，受多條信號通路與多種信號分子的調(diào)節(jié)，有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；病理狀態(tài)下，自噬被激活或抑制，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬對于防治相關(guān)疾病具有積極作用[1]。研究表明，雌激素通過其受體ERα、ERβ和G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G-protein coupled estrogen receptor，GPER)對自噬發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，從而在疾病防治中發(fā)揮有益作用[2]。本文綜述雌激素對細(xì)胞自噬的雙向調(diào)節(jié)作用與部分機制，以期加深對雌激素藥理作用的認(rèn)識，為相關(guān)疾病的防治提供新思路。

1 細(xì)胞自噬概述

細(xì)胞自噬為一個高度保守的細(xì)胞分解代謝過程，是內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要貢獻(xiàn)者，在細(xì)胞分化和發(fā)育、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器質(zhì)量控制、代謝和免疫等諸多過程中發(fā)揮重要作用。一方面，自噬可降解有害或多余的細(xì)胞成分，減少這些成分對細(xì)胞的直接或間接損傷；另一方面，降解的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞代謝過程中所需的營養(yǎng)和能量，用于細(xì)胞重塑[3]。自噬在形態(tài)學(xué)上分為3種不同的形式：微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬、巨自噬。微自噬被定義為溶酶體膜動力學(xué)，直接包裹和運輸細(xì)胞質(zhì)成分到溶酶體或液泡進行降解的過程；分子伴侶介導(dǎo)的自噬被描述為溶酶體膜上特定可溶性蛋白質(zhì)降解的選擇性機制；巨自噬是雙膜小泡包裹需要降解物質(zhì)形成自噬小體，再與溶酶體融合后降解的過程。盡管這些自噬形式在過程上存在差異，但都具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功效[4]。由于巨自噬是最具有自噬特征的一種形式，一般情況下若無特殊說明，自噬均指“巨自噬”，故本文重點介紹巨自噬的過程。

簡單來說，自噬的形成過程包括[5]：細(xì)胞內(nèi)待降解底物形成分隔膜；分隔膜延伸、拓展形成自噬前體；自噬前體包裹降解底物形成自噬泡，進而形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體；自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體；水解酶將自噬溶酶體中的底物分解成可能再利用的小分子物質(zhì)。在饑餓或應(yīng)激因素的作用下，并由多種自噬相關(guān)基因及信號蛋白的調(diào)控，引起自噬形成。自噬在各種疾病發(fā)展進程中的作用及參與調(diào)控自噬的因素受到學(xué)者們的關(guān)注。一般來說，可控范圍內(nèi)的自噬有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，過度自噬或自噬不足均可引起細(xì)胞損傷，成為多種疾病的重要發(fā)生機制之一；靶向自噬并以恢復(fù)自噬通量正?；癁槟繕?biāo)，成為決策不同疾病治療措施的重要依據(jù)之一。

2 雌激素抑制細(xì)胞過度自噬的作用

2.1 神經(jīng)保護作用 對于神經(jīng)細(xì)胞而言，自噬通常維持基本代謝，保護細(xì)胞免受能量代謝障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏、炎性反應(yīng)和各種病理狀況的影響，但過度自噬是有害的。Yang等[6]應(yīng)用雙側(cè)卵巢去勢(ovariectomy，OVX)大鼠結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(bilateral common carotid arteries occlusion，BCCAO)建立雌激素缺乏血管性癡呆大鼠模型，發(fā)現(xiàn)正常大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，細(xì)胞核圓而飽滿，核仁和細(xì)胞質(zhì)清晰，雙層核膜清晰，染色質(zhì)排列均勻，細(xì)胞質(zhì)中有正常數(shù)量形態(tài)典型的細(xì)胞器；雌激素缺乏大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列松散、紊亂，數(shù)量明顯減少，多為梭形或多邊形，形態(tài)不規(guī)則，超微結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞核變形，核仁縮小，核膜溶解，核染色質(zhì)聚集成塊，細(xì)胞器數(shù)量顯著減少，線粒體腫脹和空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張和破裂；雌激素治療后，細(xì)胞核和細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，且E2早期治療比后期治療效果更顯著。進一步研究顯示，雌激素缺乏大鼠海馬體自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1表達(dá)顯著增加，E2早期治療后顯著降低。Lin等[7]在不同的脊髓損傷大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，E2處理顯著減少了大鼠脊髓壞死和缺損面積，脊髓中運動神經(jīng)元顯著保留，減少了自主神經(jīng)功能障礙，改善了運動功能，同時顯著降低了神經(jīng)元LC3Ⅱ和Beclin-1的mRNA與蛋白表達(dá)。Yue等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸顯著降低了神經(jīng)細(xì)胞活力，上調(diào)了自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ、下調(diào)了P62表達(dá)；GPER激動劑G1預(yù)處理可增強神經(jīng)細(xì)胞活力，降低Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ、增強P62表達(dá)，且G1的保護作用被GPER抑制劑G15阻斷；G1通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)—蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)—哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬。此外，在大鼠模型上發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞過度自噬參與了脊髓缺血再灌注損傷的發(fā)生過程，抑制過度自噬可減輕這一損傷[9]，但雌激素是否能通過抑制過度自噬發(fā)揮作用還需要研究。

上述研究表明，雌激素可以有效減輕血管性癡呆及脊髓損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，這種作用是通過抑制過度自噬實現(xiàn)的，且GPER激活可抑制谷氨酸誘導(dǎo)的過度自噬從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但雌激素抑制自噬發(fā)揮有益作用是否與ERα、ERβ有關(guān)，還需要研究。

2.2 心肌保護作用 過度自噬參與了多種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，包括心臟肥大、心力衰竭和缺血再灌注損傷。女性絕經(jīng)前心血管疾病的發(fā)病率較低，與雌激素水平相關(guān)。雌激素調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬的作用受到關(guān)注。Wang等[10]的研究顯示，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理增加了心肌細(xì)胞的乳酸脫氫酶活性，降低了細(xì)胞活力，上調(diào)了Atg5和Beclin1的mRNA表達(dá)，增加了LC3-Ⅱ表達(dá)，E2治療逆轉(zhuǎn)了LPS的上述不良作用。結(jié)果表明，LPS引起心肌損傷與功能障礙的作用與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、降低細(xì)胞活力有關(guān)，E2保護心肌細(xì)胞的作用是通過逆轉(zhuǎn)LPS引起心肌細(xì)胞過度自噬實現(xiàn)的。

Bcl2/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3，BNIP3)作為一種缺氧誘導(dǎo)的標(biāo)志物，可誘導(dǎo)自噬和凋亡，心肌BNIP3高表達(dá)與心肌肥厚、心肌病的發(fā)生相關(guān)。Chen等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3過表達(dá)引起了心肌H9c2細(xì)胞的自噬和凋亡，E2通過下調(diào)BNIP3、自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、凋亡蛋白Caspase3表達(dá)，從而阻斷了BNIP3誘導(dǎo)的自噬和凋亡，減少了H9c2細(xì)胞死亡。多西環(huán)素或E2處理，增強了BNIP3與ERα結(jié)合，削弱了BNIP3與Bcl-2、Rheb和泛素結(jié)合，從而減輕了細(xì)胞損傷，說明ERα與Bcl-2或Rheb競爭結(jié)合BNIP3，從而允許Rheb激活mTOR，導(dǎo)致自噬抑制。

E2或ERβ處理均顯著抑制了缺氧引起H9c2細(xì)胞的自噬與凋亡、BNIP3高表達(dá)，促進胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)、p-Akt磷酸化和Bcl-2表達(dá)，降低了缺氧相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白和線粒體凋亡相關(guān)蛋白的積累，提高了缺氧條件下Bak蛋白水平；ERβ拮抗劑可完全消除ERβ的心臟保護特性；瞬時轉(zhuǎn)染Tet-On ERβ基因，增加了缺氧處理H9c2細(xì)胞的ERβ表達(dá)，ERβ通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α調(diào)節(jié)的BNIP3和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3信號通路抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬和凋亡[12]。

研究顯示[13]，心肌細(xì)胞表達(dá)GPER，G1可減弱血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，并下調(diào)心鈉素(atrial natriuretic factor，ANF)和腦鈉肽的基因表達(dá)水平；G1處理抑制了AngⅡ增加心肌細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的作用，提高了p-Akt、p-70S6K1和p-mTOR的蛋白水平，降低了p-4EBP1的表達(dá)；G1抑制心肌細(xì)胞自噬的作用被GPER拮抗劑G15、Akt抑制劑MK2206、自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)抑制。結(jié)果表明，GPER激活通過上調(diào)PI3K-Akt-mTOR信號通路和抑制自噬來減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，從而發(fā)揮心肌保護作用。生物信息學(xué)分析表明，F(xiàn)am120b、RGD1562310、Ctrb1、Rap1gap和Pag1這5種蛋白可能是參與G1抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的關(guān)鍵蛋白，但這5種蛋白與心肌細(xì)胞自噬的作用有待進一步觀察。

上述研究表明，雌激素治療能夠減輕多種因素引起的心肌細(xì)胞自噬，減輕心肌細(xì)胞死亡進而發(fā)揮心肌保護作用，該作用與心肌細(xì)胞的3種ERs有關(guān)；單純激動心肌細(xì)胞ERs，亦發(fā)揮同樣的心肌保護作用。

3 雌激素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用

3.1 神經(jīng)保護作用 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與老齡化高度相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，β-淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)聚集是AD顯著的病理特征，廣泛用于AD神經(jīng)病理學(xué)的診斷[14]。由于體內(nèi)分泌的雌激素通過其受體發(fā)揮提高記憶力、改善認(rèn)知能力的功能，故AD主要發(fā)病女性人群為絕經(jīng)后的婦女[15]。大量研究表明，自噬增強可促進Aβ降解，從而保護AD患者的神經(jīng)功能[16]。雌激素通過其受體調(diào)節(jié)自噬具有減少Aβ聚集、促進Aβ降解的作用，進而抑制AD的發(fā)展進程[17]。Wei等[18]采用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，ERβ過表達(dá)有助于增加LC3-Ⅱ表達(dá)，提高自噬通量；ERβ轉(zhuǎn)染增加了LC3陽性表達(dá)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)自噬體和自溶體，且敲除ERβ降低了LC3-Ⅱ表達(dá)；ERβ選擇性激動劑DPN(diarylpropionitrile)顯著增加了SH-SY5Y細(xì)胞LC3-Ⅱ的水平；ERβ過表達(dá)增加了SH-SY5Y細(xì)胞ATG7表達(dá)和ATG5-ATG12復(fù)合物的形成，而ERβ沉默具有相反的效果，且依賴于ATG7表達(dá)；這些證據(jù)表明，ERβ通過激活A(yù)TG7蛋白誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞自噬，且ERβ與SH-SY5Y細(xì)胞的自噬狀態(tài)呈正相關(guān)。雌激素通過其受體激活自噬促進Aβ降解，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，使雌激素可能成為治療AD的備選新藥物。

此外，G1對大腦中動脈閉塞小鼠模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有明顯的保護作用，且這種作用在GPER-/-小鼠中消失；谷氨酸通過激活體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞mTOR和c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，降低星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，G1處理通過調(diào)節(jié)p38 MAPK通路而不是mTOR和JNK信號通路使自噬恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，從而達(dá)到保護星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用[19]。結(jié)果表明，活化GPER增加自噬有利于保護星形膠質(zhì)細(xì)胞。

3.2 心肌保護作用 在D-半乳糖(D-galactose)引起心肌老化的小鼠模型上，E2治療顯著提高了小鼠心肌功能，降低了心肌老化標(biāo)志物的蛋白水平，提高了Beclin1、LC3、ATG5的mRNA與蛋白表達(dá)，降低了Beclin1、LC3、ATG5的甲基化水平；E2的作用被ERα特異性抑制劑甲基哌啶吡唑(methyl-piperidino-pyrazole，MPP)抑制；結(jié)果表明，E2通過ERα下調(diào)了自噬相關(guān)基因的甲基化、增加自噬進而發(fā)揮抗心肌老化的作用[20]。在OVX大鼠內(nèi)毒素血癥模型上，E2替代治療提高了內(nèi)毒素血癥OVX大鼠的存活率，抑制了LPS引起心肌核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)p65、誘生型一氧化氮合酶高表達(dá)與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)，提高了心肌自噬標(biāo)志蛋白(Atg12、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ)表達(dá)及血紅素加氧酶-1和熱休克蛋白70表達(dá)，結(jié)果表明，E2通過增加心肌細(xì)胞自噬可對抗LPS的心肌損傷[21]。

3.3 肝細(xì)胞保護作用 膿毒癥和膿毒癥性休克是急危重癥醫(yī)學(xué)面臨的重要臨床問題。王云等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)后，雄性大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶顯著高于雌性大鼠，肝細(xì)胞損傷程度、嗜中性粒細(xì)胞浸潤程度均強于雌性大鼠，自噬蛋白表達(dá)增加但低于雌性大鼠，雌激素處理顯著降低了2個轉(zhuǎn)氨酶水平及肝細(xì)胞損傷程度，且低于雌性大鼠，且自噬蛋白表達(dá)明顯高于CLP的雄性和雌性大鼠；同樣的實驗結(jié)果亦應(yīng)用雄性小鼠進行了驗證。這一結(jié)果表明，雌激素通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬減輕膿毒癥后的肝損傷。此外，具有植物雌激素作用的葛根素(puerarin，PU)可減輕重金屬鎘污染對小鼠肝細(xì)胞AML-12的細(xì)胞毒性，該作用與抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和恢復(fù)細(xì)胞自噬活性有關(guān)[23]。

3.4 骨保護作用 研究表明，雌激素可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。流行病學(xué)證據(jù)表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因和發(fā)病機制與雌激素代謝和缺乏密切相關(guān)，ERs廣泛分布于滑膜、骨和軟骨細(xì)胞[24]。酸敏感離子通道1α(acid sensing ion channels 1α，ASIC1α)是一種鈉離子滲透通道，通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡損傷軟骨細(xì)胞，亦可通過增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞凋亡和滑膜炎性反應(yīng)從而參與酸誘導(dǎo)的軟骨和骨損傷[25-26]。抑制或缺乏ASIC1α可保護關(guān)節(jié)免受酸誘導(dǎo)的損傷，細(xì)胞自噬參與了這一過程，因此靶向ASIC1α可能在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中發(fā)揮作用[27-29]。Song等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，E2通過ERα以時間依賴的方式降低了軟骨細(xì)胞ASIC1α蛋白表達(dá)；且更為顯著地降低了蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(10 μm)處理6 h后軟骨細(xì)胞ASIC1α蛋白水平，表明E2通過降解ASIC1α以達(dá)到降低ASIC1α蛋白水平的作用；E2增加了Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)，減輕了酸處理的軟骨細(xì)胞凋亡，表明E2的抗凋亡作用是通過上調(diào)自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)進而誘導(dǎo)自噬實現(xiàn)的；自噬抑制劑CQ預(yù)處理抑制了E2降低ASIC1α表達(dá)的作用，進而阻斷了E2抗軟骨細(xì)胞凋亡、減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷的有利作用。這一數(shù)據(jù)表明，雌激素可通過降低ASIC1α表達(dá)、激活自噬，進而抑制ASIC1α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷，雌激素成為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎新的藥物，這為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療開辟新的道路。

4 雌激素減輕急性肺損傷的作用

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是重癥患者最早發(fā)生的器官損傷之一，也是引起患者高病死率的一個主要原因。近年來的研究顯示，雌激素及其受體可減輕多種原因?qū)е碌腁LI，其機制涉及抑制氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡、改善內(nèi)皮屏障功能等多個方面[30-33]。細(xì)胞自噬在ALI的發(fā)病過程中具有雙刃劍作用，自噬過度或不足均參與了ALI的發(fā)生，自噬通量正常化成為防治ALI的關(guān)鍵靶點，以調(diào)節(jié)自噬通量正常化的一些治療措施在減輕ALI的過程中發(fā)揮重要作用[34]。此外，靶向巨噬細(xì)胞自噬，有利于減輕LPS誘導(dǎo)膿毒癥后的炎性反應(yīng)[35]，提示減輕自噬可能成為通過抗炎機制減輕膿毒癥ALI的新措施。但雌激素抗ALI的作用是否與調(diào)節(jié)自噬有關(guān)，還有待進一步證實。

5 小結(jié)與展望

雌激素對細(xì)胞自噬的雙向調(diào)節(jié)作用參與了多種疾病發(fā)展進程中的細(xì)胞保護作用，從而可能成為自噬相關(guān)疾病防治的有效藥物之一。雌激素對自噬發(fā)揮的雙向調(diào)節(jié)作用主要是通過不同的ERs實現(xiàn)的，且與PI3K-AKT-mTOR、NF-κB、MAPK等多種信號通路有關(guān)。在重癥醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，細(xì)胞自噬參與了多種致病因素引起組織器官損傷的病理過程，雌激素治療也對組織器官損傷具有很好的干預(yù)作用，但相關(guān)機制仍未完全闡明。因此，深入研究雌激素調(diào)節(jié)自噬進而發(fā)揮細(xì)胞保護作用與機制，將助力器官損傷的臨床決策，也有利于拓展雌激素的藥理學(xué)作用，為以雌激素作為新型藥物、在多種疾病中發(fā)揮有利干預(yù)作用提供實驗依據(jù)。同時，還需要將雌激素藥理學(xué)作用的基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床，也將為疾病開辟新的治療思路。此外，應(yīng)結(jié)合臨床資料，關(guān)注雌激素對于自噬相關(guān)疾病的治療效果，以期擴展雌激素的臨床應(yīng)用范圍。但在臨床上如何尋找反映自噬通量的生物標(biāo)志物仍是目前的難題。