前列腺癌組織中膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1基因轉(zhuǎn)錄水平微滴數(shù)字PCR檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證

楊德平，張艷，劉瑩，張培燕，孔娜娜，鄭江花，3

1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海 201318；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200032；3.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市同濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200092

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率在男性惡性腫瘤相關(guān)死亡原因中列第三位［1］。隨著我國(guó)生活水平、診斷技術(shù)的提高及社會(huì)老齡化程度加大，前列腺癌的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)［2］。目前，總前列腺特異抗原（total prostate specific antigen，TPSA）仍是我國(guó)前列腺癌的首要診斷指標(biāo)，早期檢測(cè)TPSA可降低前列腺癌的死亡率［1］。但中國(guó)前列腺癌聯(lián)盟（Chinese Prostate Cancer Consortium，CPCC）研究數(shù)據(jù)顯示，患者血清中TPSA含量為4～10 ng／mL時(shí)，前列腺穿刺陽(yáng)性率約為26%［3］，這可能是由于TPSA檢測(cè)結(jié)果受炎癥、直腸指診和良性前列腺增生等因素的影響，易產(chǎn)生假陽(yáng)性［4］。因此，臨床迫切需要尋找新的前列腺癌診斷標(biāo)志物，為前列腺癌的早期準(zhǔn)確篩查提供新的指標(biāo)。

膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1（collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）是分泌型糖基化蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約28 000，在人和大鼠中，其氨基酸序列同源性為92%［5］。有研究顯示，CTHRC1在癌癥組織中可參與多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，并促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，且在人胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和大腸癌中呈高表達(dá)［6-7］，但CTHRC1在前列腺癌中的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。微滴數(shù)字PCR法（droplet digital PCR，ddPCR）是近年研發(fā)的一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的PCR法［8］，是一種新型的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。本研究旨在建立前列腺癌組織中CTHRC1基因轉(zhuǎn)錄水平的ddPCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行驗(yàn)證，以期為前列腺癌的臨床診斷提供一個(gè)準(zhǔn)確性較高的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 樣本 收集2019—2020年復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科住院患者的73份前列腺穿刺組織樣本，其中前列腺癌組織樣本40份，患者年齡42～85歲，平均年齡（70.56±8.42）歲；非前列腺癌組織樣本33份，患者年齡49～85歲，平均年齡（68.56±7.67）歲。

1.2 主要試劑及儀器EcoRⅠ內(nèi)切酶及柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；TPSA檢測(cè)試劑盒、i2000SR免疫化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑購(gòu)自美國(guó)雅培公司；QX200TM微滴生成儀及QX200TM微滴讀取儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的CTHRC1序列（NM_001256099.2），經(jīng)序列比對(duì)分析，針對(duì)CTHRC1保守區(qū)，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，CTHRC1-F：5'-CTTCATATGTGGCCGCCAGG-3'，CTHRC1-R：5'-AGATGAGCCCCTGGAAAGCA-3'。同時(shí)設(shè)計(jì)β-actin（JQ619775）引物，β-actin-F：5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'；β-actin-R：5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建 采用柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒提取前列腺癌穿刺組織陽(yáng)性樣本總RNA，第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板擴(kuò)增CTHRC1保守區(qū)基因片段。委托生工生物工程（上海）有限公司構(gòu)建含CTHRC1保守區(qū)基因片段的質(zhì)粒PUC57，并鑒定質(zhì)粒的堿基數(shù)和濃度，換算出拷貝數(shù)。將質(zhì)粒PUC57經(jīng)EcoRⅠ酶酶切，線(xiàn)性化的質(zhì)粒用于后續(xù)方法的驗(yàn)證。

1.5 方法的建立 采用柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒提取標(biāo)本總RNA，第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×ddPCR Supermix Evagreen 10μL，上下游引物（10μmol／L）各0.4μL，模板3μL，ddH2O 6.2μL，共20μL。采用QX200TM微滴生成儀生成微滴，用PX1TMPCR板封口機(jī)熱封96孔板，再用QX100TMPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃30 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)；4℃5 min；90℃5 min；4℃保存。擴(kuò)增后將96孔板置QX200TM微滴讀取儀進(jìn)行分析，檢測(cè)到熒光信號(hào)的記為陽(yáng)性反應(yīng)，未檢測(cè)到熒光的被記為陰性反應(yīng)。最后應(yīng)用QuantaSoft分析軟件計(jì)算質(zhì)粒的絕對(duì)濃度。

1.6 方法的驗(yàn)證

1.6.1 引物特異性 取3份前列腺癌陽(yáng)性穿刺標(biāo)本，用柱式動(dòng)物組織總RNA純化試劑盒抽提總RNA，第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，CTHRC1-F／R和β-actin-F／R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。同時(shí)用這2對(duì)引物對(duì)6份前列腺癌穿刺陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，驗(yàn)證兩對(duì)引物的特異性。

1.6.2 正確度 用ddH2O將線(xiàn)性化質(zhì)粒PUC57稀釋至104、103、102、101及100copies／μL，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度重復(fù)檢測(cè)3次，將檢測(cè)值和理論值進(jìn)行Log10值轉(zhuǎn)換。

1.6.3 精密性

1.6.3.1 重復(fù)性 用ddH2O將線(xiàn)性化質(zhì)粒PUC57稀釋為101和103copies／μL，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算SD平均值和CV。

1.6.3.2 中間精密性 用ddH2O將線(xiàn)性化質(zhì)粒PUC57稀釋為101和103copies／μL，采用建立的方法于4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算SD，平均值和CV。

1.6.4 檢測(cè)限 用ddH2O將線(xiàn)性化質(zhì)粒PUC57稀釋為100copies／μL，采用建立的方法重復(fù)檢測(cè)10次。

1.6.5 線(xiàn)性范圍 用ddH2O將線(xiàn)性化質(zhì)粒PUC57稀釋為105、104、103、102、101和100copies／μL，采用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，取平均值。以理論值為橫坐標(biāo)，檢測(cè)值（拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換Log10值）為縱坐標(biāo)，建立線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)。

1.7 方法的應(yīng)用 采用建立的方法檢測(cè)73份臨床前列腺組織穿刺標(biāo)本中CTHRC1基因轉(zhuǎn)錄水平，TPSA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相應(yīng)患者血清中TPSA含量，并將TPSA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行ROC曲線(xiàn)分析，以獲得CTHRC1-TPSA指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷前列腺癌的預(yù)測(cè)概率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，ddPCR和TPSA法檢測(cè)73份臨床前列腺組織穿刺標(biāo)本結(jié)果間的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒的鑒定 質(zhì)粒含有堿基數(shù)為3 070 bp，質(zhì)粒濃度為40 ng／μL，即1.19×1010copies／μL。

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 引物特異性CTHRC1-F／R和β-actin-F／R引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)174和144 bp的基因片段，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。6份前列腺癌穿刺標(biāo)本采用兩對(duì)引物進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，均為陽(yáng)性，表明引物特異性良好，見(jiàn)圖2。

圖1 兩對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products with two pairs of primers

2.2.2 正確度 檢測(cè)值和理論值之間的Log值差異均＜1，且擬合度高，R2=0.995 9，見(jiàn)圖3。表明該方法具有良好的正確度。

2.2.3 精密性

2.2.3.1 重復(fù)性103和101copies／μL質(zhì)粒重復(fù)檢測(cè)20次的均值分別為1 110.500和12.378，SD分別為52.863和1.178，CV分別為0.048%和0.095%，CV均＜10%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.3.2 中間精密性103和101copies／μL質(zhì)粒于4個(gè)不同時(shí)間重復(fù)檢測(cè)20次的均值分別為1 122.000和11.918，CV均＜15%，SD分別為77.432和1.556，CV分別為0.069%和0.131%。表明該方法具有良好的中間精密性。

2.2.4 檢測(cè)限 重復(fù)檢測(cè)10次，100copies／μL質(zhì)粒PUC57的檢測(cè)值分別為2、1、0.8、1.7、0.8、1.7、1.1、1.7、1.7、2.1 copies／μL，因此確定該方法的檢測(cè)限為100copies／μL。

2.2.5 線(xiàn)性范圍 檢測(cè)值在100～104copies／μL范圍內(nèi)，與理論值呈良好的線(xiàn)性相關(guān)性，線(xiàn)性方程為：y=0.986 0x-0.880 9，R2=0.997 2，見(jiàn)圖4。當(dāng)模板數(shù)大于105copies／μL時(shí)，ddPCR陽(yáng)性微滴數(shù)達(dá)到飽和狀態(tài)，基底熒光信號(hào)基本消失，檢測(cè)值與理論值之間發(fā)生了偏離不相符，見(jiàn)圖5。

圖2 CTHRC1-F／R（A）和β-actin-F／R引物（B）檢測(cè)前列腺癌穿刺標(biāo)本的ddPCR結(jié)果Fig.2 Test results of prostate cancer biopsy specimens determined by ddPCR with CTHRC1-F／R（A）andβ-actin-F／R（B）primers

圖3 正確度驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Verification for accuracy

圖4 ddPCR檢測(cè)CTHRC1的線(xiàn)性范圍Fig.4 Linear range of determination of CTHRC1 by ddPCR

圖5 105 copies／μL質(zhì)粒的ddPCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Determination of 105 copies／μL plasmid by ddPCR

2.3 方法的應(yīng)用ddPCR法檢測(cè)40份前列腺癌穿刺標(biāo)本中CTHRC1基因轉(zhuǎn)錄水平Log10轉(zhuǎn)換后均值為21.40 copies／μL，33份，非前列腺癌穿刺標(biāo)本中CTHRC1基因轉(zhuǎn)錄水平Log10轉(zhuǎn)換后均值為10.47 copies／μL，前者顯著高于后者（Z=-4.339，P＜0.001）。ROC曲線(xiàn)分析表明，CTHRC1+TPSA聯(lián)合檢測(cè)可大幅提高前列腺癌檢測(cè)的曲線(xiàn)下面積（area under the curve，AUC），特異性及敏感性也高于TPSA和CTHRC1單獨(dú)檢測(cè)，表1和見(jiàn)圖6。

表1 ROC曲線(xiàn)評(píng)價(jià)TPSA、CTHRC1及CTHRC1+TPSA聯(lián)合檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 Statistical results of TPSA，CTHRC1 and CTHRC1+TPSA evaluated by ROC curve

圖6 CTHRC1、TPSA及CTHRC1+TPSA聯(lián)合檢測(cè)診斷前列腺癌的ROC曲線(xiàn)Fig.6 ROC curve of prostate cancer diagnosed with CTHRC1，TPSA and CTHRC1+TPSA

3 討 論

近年，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率有逐年增高的趨勢(shì)，早期診斷的準(zhǔn)確性是影響其診療效果的主要因素。目前，TPSA和游離前列腺特異抗原（free prostate specific antigen，fPSA）在臨床上運(yùn)用最為廣泛，其中TPSA特異性較低，在前列腺炎及前列腺增生等良性前列腺疾病中也會(huì)升高；fPSA存在含量低、半衰期短、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)［9-10］，因此，深入研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)早期診斷前列腺癌新的分子標(biāo)志物，對(duì)于前列腺癌的治療和預(yù)后具有重要意義。CTHRC1是一種分泌性蛋白，其高表達(dá)可增加癌細(xì)胞的浸潤(rùn)能力和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，從而加劇病情進(jìn)展［11］。研究顯示，CTHRC1與多種實(shí)體腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12-14］，但其與前列腺癌的關(guān)系鮮有報(bào)道。

ddPCR法不依賴(lài)于外部校準(zhǔn)曲線(xiàn)，能敏感和特異地檢測(cè)核酸，與qPCR法比較，對(duì)PCR抑制物具有較高耐受性［15］，已成為一種新的分子檢測(cè)技術(shù)，在癌癥檢測(cè)及核酸定量中廣泛應(yīng)用［16-17］。本研究針對(duì)CTHRC1基因的一段保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行驗(yàn)證后，構(gòu)建了含該保守區(qū)域的質(zhì)粒PUC57，用于ddPCR法的驗(yàn)證。結(jié)果表明，ddPCR法的檢測(cè)值與質(zhì)粒理論值之間具有較高的擬合度（R2=0.995 9），表明該方法具有良好的正確度；重復(fù)性CV＜10%，中間精密性CV＜15%；ddPCR法檢出限達(dá)100copies／μL；檢測(cè)值在100～104copies／μL范圍內(nèi)，與理論值呈良好的線(xiàn)性相關(guān)性，R2=0.997 2。方法驗(yàn)證結(jié)果表明，ddPCR法適合前列腺癌患者臨床樣本中CTHRC1基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，是一種可靠、準(zhǔn)確、靈敏的癌癥研究工具。

本研究采用建立的ddPCR法檢測(cè)了40例前列腺癌穿刺標(biāo)本和33份非前列腺癌穿刺標(biāo)本中的CTHRC1基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，CTHRC1基因在前列腺癌患者樣本中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于非前列腺癌樣本（P＜0.001），初步證實(shí)CTHRC1基因轉(zhuǎn)錄水平在前列腺癌中高表達(dá)。聯(lián)合檢測(cè)是篩查前列腺癌的有效手段，可增加發(fā)現(xiàn)使局限性前列腺癌和無(wú)癥狀的隱匿性前列腺癌的概率，從而使可根治的前列腺癌能被早期發(fā)現(xiàn)［18］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用ROC曲線(xiàn)分析CTHRC1與TPSA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)前列腺癌的診斷性能，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)比單獨(dú)TPSA和CTHRC1檢測(cè)具有更高的AOC，因此聯(lián)合檢測(cè)CTHRC1與TPSA有利于進(jìn)一步提高對(duì)前列腺癌的診斷能力，為前列腺的早期治療和改善預(yù)后提供幫助。

綜上所述，ddPCR法可用于前列腺癌患者組織中CTHRC1基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，CTHRC1在前列腺癌中異常表達(dá)提示其有可能成為前列腺癌患者的新篩查指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，但CTHRC1在前列腺癌發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)行深入研究。