膠質(zhì)母細胞瘤惡性亞型形成與臨床相關(guān)性探討*

艾依丁 呂超 解楊 楊永暢 徐星 金勛

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤。根據(jù)2021 年世界衛(wèi)生組織（WHO）分類指南膠質(zhì)瘤可分為彌漫型和非彌漫膠質(zhì)瘤，其中彌漫型膠質(zhì)瘤占整體的80% 左右，WHO 分級為Ⅱ～Ⅳ級[1]。彌漫型低級別膠質(zhì)瘤（WHO Ⅱ級和Ⅲ級）根據(jù)腫瘤細胞形態(tài)可分為星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及間變型膠質(zhì)細胞瘤，50%患者在手術(shù)結(jié)合輔助性放療中獲益，中位總生存期8～10 年[1]。彌漫型膠質(zhì)瘤中，惡性程度最高且細胞形態(tài)上表現(xiàn)出高度異質(zhì)性的膠質(zhì)瘤稱為Ⅳ級膠質(zhì)瘤，又稱膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM），其標準治療方案是手術(shù)后放療聯(lián)合替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化療，但標準化治療后的患者5 年復發(fā)率高達90%，中位生存期僅15 個月[1]。GBM 的不良預后可歸因于其腫瘤微環(huán)境和腫瘤細胞自身的高度異質(zhì)性導致的放化療反應差異。探究具有放化療抵抗性的腫瘤細胞亞群的形成規(guī)律及相關(guān)機制，對制定和優(yōu)化GBM 患者的多模式治療策略有至關(guān)重要的作用。本文將圍繞放化療抵抗性亞型腫瘤細胞的形成相關(guān)分子調(diào)控機制及微環(huán)境探討GBM 治療的前景。

1 GBM 的亞型異質(zhì)性與可塑性

GBM 在細胞形態(tài)上表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性：在整體腫瘤組織的基因表達水平上可分為前神經(jīng)元（proneural，PN）、經(jīng)典（classical，CL）和間充質(zhì)（mesenchymal，MES）3 種亞型[2]。以此為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組亞型分類一定程度上具有預測預后及惡性進展的價值。如在低級別彌漫型膠質(zhì)瘤中，大部分腫瘤主要表達PN亞型特征，而在GBM 中，3 種亞型比例均衡，并且MES 亞型的患者相比于PN 亞型的患者預后差[3-4]。盡管轉(zhuǎn)錄組亞型對應的基因突變特點，如PN 亞型中的血小板源性生長因子受體α 多肽（platelet-derived growth factor receptors alpha，PDGFRA）擴增、CL 亞型中的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變、MES 亞型中的神經(jīng)纖維瘤?、裥停╪eurofibromatosis type Ⅰ，NF1）缺失等現(xiàn)象已有所報道，但在復發(fā)GBM 患者中常發(fā)生原發(fā)性腫瘤的突變基因現(xiàn)象，如EGFRvⅢ丟失或EGFR 減少等[5]。相應于此種突變基因的變化，復發(fā)GBM 患者中2/3 患者的基因轉(zhuǎn)錄譜與原發(fā)腫瘤有所不同，有證據(jù)顯示大多數(shù)原發(fā)性PN 亞型GBM 患者在標準化治療后復發(fā)時表現(xiàn)出MES 亞型[6]，上述臨床證據(jù)說明GBM 亞型的分子特征并非固定不變，而是在治療或疾病進展過程中可能會發(fā)生亞型的可塑性變化。

目前，針對膠質(zhì)瘤分子亞型可塑性變化的原因有兩種解釋：1）高度異質(zhì)性的GBM 本身具備不同亞型的腫瘤細胞，并在放化療等環(huán)境壓力下具有耐受性的細胞存活下來形成腫瘤的主要亞型；2）GBM 中不同亞型的腫瘤細胞在放化療等環(huán)境壓力下發(fā)生了亞型轉(zhuǎn)化。實際上，GBM 的大部分單細胞測序結(jié)果顯示同一個患者腫瘤組織中3 種亞型腫瘤細胞共存[7-8]，而富含MES 亞型腫瘤細胞的患者預后最差、對放化療抵抗性強[9]，但目前鮮見直接證據(jù)證明MES 亞型細胞本身在放化療等環(huán)境壓力下生存下來形成腫瘤的主要亞型。因此，不能排除非MES 亞型的腫瘤細胞在放化療等環(huán)境因素的影響下發(fā)生表觀遺傳重組獲得MES基因表達特性的可能性。事實上，在免疫缺乏鼠原位移植PN 亞型的膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cell，GSC）的膠質(zhì)瘤模型中，經(jīng)放療后回收的腫瘤細胞其基因表達及細胞特性上表現(xiàn)出MES 亞型的特點，即發(fā)生前神經(jīng)-間充質(zhì)亞型轉(zhuǎn)化（proneural-mesenchymal transition，PMT），而這種過程直接導致復發(fā)腫瘤對放化療的高度抵抗[10]。無論MES 亞型本身在腫瘤克隆進化中占主導地位，還是非MES 亞型轉(zhuǎn)化成對放化療有抵抗性的MES 亞型，最終復發(fā)的GBM 趨向MES 亞型富集并獲得放化療抵抗性的問題是直接與臨床預后密切相關(guān)的腫瘤細胞病理變化[11]。因此，深入了解MES 亞型維持及PMT 相關(guān)的分子調(diào)控機制對于完善GBM 治療方案至關(guān)重要。

2 MES 亞型維持及轉(zhuǎn)化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

在真核細胞中，基因的轉(zhuǎn)錄嚴格受控于結(jié)合DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域特異性序列的轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因此，特定細胞的轉(zhuǎn)錄譜的形成，在機制上依賴于特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與的分子機制。

2.1 C/EBPβ 和STAT3

GBM 亞型分類的根據(jù)是基因轉(zhuǎn)錄譜，所以早期的MES 亞型研究主要集中在尋找其特異性轉(zhuǎn)錄因子。針對MES 亞型特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模擬的研究發(fā)現(xiàn)[12]，C/EBPβ 和STAT3 可能對GBM 的MES 亞型轉(zhuǎn)錄起到重要作用，并通過功能性實驗證明C/EBPβ和STAT3 的共同過表達引起的神經(jīng)干細胞獲得MES亞型轉(zhuǎn)錄譜，如YKL40、SMA、Fibronectin、CTGF、OSMR等基因和蛋白的高表達；以及C/EBPβ 和STAT3 共同降表達引起MES 亞型膠質(zhì)瘤細胞低表達MES 標記基因和蛋白，如YKL40、Fibronectin、CTGF、OSMR 使膠質(zhì)瘤細胞失去致癌性?；谠撗芯拷Y(jié)果，其提出C/EBPβ 和STAT3 是調(diào)控GBM MES亞型特異性基因群的重要轉(zhuǎn)錄因子這一觀點（圖1A）。

2.2 TAZ

有研究在擴大候選轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子前提下重復了Iavarone 團隊的研究[13]。此研究發(fā)現(xiàn)由轉(zhuǎn)錄輔激活因子TAZ 與轉(zhuǎn)錄因子TEAD 構(gòu)成的獨立于C/EBPβ 和STAT3 的新MES 亞型特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖1A）[13]。在PN 亞型GBM 和低級別彌漫型膠質(zhì)瘤中TAZ 啟動子部位高度甲基化，證明DNA 甲基化為主的表觀遺傳調(diào)控機制參與GBM 亞型的維持。進一步的功能實驗證明，TAZ 是MES 亞型GBM 特性維持的必要調(diào)控因子，而且通過PN 亞型GBM 和低級別彌漫型膠質(zhì)瘤細胞模型中TAZ 過表達，證明了TAZ 誘導PMT 及膠質(zhì)瘤惡性進展。

2.3 NF-κB

在原代PN 和MES 亞型GSC 的蛋白表達分析中，發(fā)現(xiàn)NF-κB 的激活態(tài)蛋白磷酸化P65（p-P65）高表達于MES 亞型GSC，并且調(diào)控TAZ、C/EBPβ 和磷酸化STAT3（p-STAT3）的蛋白質(zhì)表達[10]（圖1A），提示NF-κB 信號通路在MES 亞型維持及PMT 中的重要性。NF-κB 作為重要的炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子不僅參與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、CC 類趨化因子配體2（chemokine CC motif ligand 2，CCL2）、白細胞介素（interleukin，IL）-6 和IL-8等早期炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，并且直接調(diào)控MES 相關(guān)標記基因，如CD44、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表達[10，14]，而被NF-κB 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的早期炎癥因子以直接或間接的方式激活NF-κB 自身在內(nèi)的MES 亞型的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如TAZ、C/EBPβ和STAT3，并形成多環(huán)節(jié)、多條信號通路的網(wǎng)絡(luò)[14]。

圖1 GBM 惡性亞型形成機制

因此，結(jié)合GBM 患者樣本實際情況分析MES亞型主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活機制，才能更好地設(shè)計針對性治療方案。

3 腫瘤微環(huán)境與MES 亞型

GBM 病理上通常有壞死、血管增生、出血、高密度細胞群、不規(guī)則細胞核等特征，上述病理特征伴隨著如氧氣、酸堿度、營養(yǎng)素、細胞因子、基質(zhì)細胞等，不同程度分布而形成腫瘤微環(huán)境。不同的腫瘤微環(huán)境影響不同GBM 亞型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達和激活，并形成不同亞型的選擇性集落。本研究組的前期研究[15]結(jié)果也證實，PN 膠質(zhì)瘤細胞主要分布在腫瘤血管周圍，MES 膠質(zhì)瘤細胞多分布在腫瘤壞死周圍缺氧區(qū)。現(xiàn)主要圍繞影響MES 亞型分布與維持相關(guān)的腫瘤微環(huán)境進行進一步的討論。

3.1 壞死與MES 亞型

壞死是GBM 的一個代表性病理特征，是腫瘤惡性進展的標志。引起壞死的代表性原因有3 種：1）血液供應、氧氣和營養(yǎng)素無法滿足腫瘤細胞的快速增殖所需，導致局部腫瘤組織區(qū)域壞死；2）血栓引起的局部出血及后續(xù)的血液凝固，引起血栓周圍細胞壞死；3）放療引起的放射性壞死[16]。但無論何種方式引起壞死，壞死部位周圍普遍伴隨嚴重缺氧環(huán)境，并且壞死細胞或周圍的應激性細胞（如衰老細胞）釋放損傷相關(guān)模式分 子（damage-associated molecular pattern，DAMPs）如腺苷、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、IL-1α、透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）等于周圍微環(huán)境中。而這些DAMP 不僅參與腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)控，也直接參與MES 亞型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活：如腺苷通過腺苷受體P2X7RB 不僅激活NF-κ 信號通路，還促進放療后GBM 的復發(fā)[17-18]；IL-1α 可通過其受體IL1R 激活NF-κB 信號通路；HMGB1和HA 可通過Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）-2和TLR-4 激活NF-κB 信號通路；而且HA 還可以直接結(jié)合MES 標記蛋白CD44，激活其下游信號通路，強化MES 亞型基因的表達[16]。上述潛在信號通路揭示了在壞死區(qū)周圍富集MES 亞型的原因（圖1A，1B）。

3.2 缺氧微環(huán)境與MES 亞型

正常腦組織氧水平在2.5%～12.5%，但在膠質(zhì)瘤組織中下降至2.4%以下甚至在壞死附近達到0.1%。而在這種缺氧環(huán)境可抑制缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α）蛋白的降解并發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性[19]。HIF-1α 不僅可轉(zhuǎn)錄調(diào)控其他癌種上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1 的表達，而且通過PLOD1激活NF-κB 活性態(tài)p-P65 來誘導GBM 的缺氧環(huán)境中的PMT[20]（圖1A，1B）。此外，本研究組前期研究[15，21]發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境中RNF144A 降表達改變BMI1 蛋白的穩(wěn)定性，而BMI1 通過干細胞因子（stem cell factor，SCF）激活NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性來增強MES 亞型GSC 在缺氧環(huán)境中的適應性。缺氧微環(huán)境還可以誘導腫瘤細胞特異性的代謝機制，如Warburg 效應，即腫瘤細胞通過Warburg 效應在有限的營養(yǎng)素環(huán)境中提高DNA 復制、蛋白質(zhì)合成所需要的能量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和前驅(qū)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，此過程中會產(chǎn)生大量的乳酸并形成酸性微環(huán)境。而腫瘤酸性微環(huán)境又可以維持MES 亞型及引起PMT 發(fā)生，并且還具有穩(wěn)定HIF-1α、激活NF-κB 信號通路的作用[22]。

3.3 炎癥微環(huán)境與MES 亞型

GBM 亞型轉(zhuǎn)錄譜的進一步深度分析顯示，MES亞型腫瘤組織伴隨大量的炎癥相關(guān)基因的表達[23]，提示MES 亞型可能伴隨炎癥相關(guān)免疫細胞的浸潤。事實上，腫瘤壞死及缺氧部位的DAMP 的沉積及其引起的早期炎癥因子，如集落刺激因子-1（colony stimulating factor-1，CSF-1）、基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）的化學濃度梯度的形成可趨化巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞、中性粒細胞等早期炎癥細胞向壞死及缺氧環(huán)境浸潤，而浸潤至腫瘤壞死區(qū)域的巨噬細胞在DAMP、SDF-1 等因素的影響下，由抑瘤性M1 轉(zhuǎn)化成促瘤性M2 進而促進GBM 的惡性進展[17]。實際上，近期單細胞測序結(jié)果也證實MES 亞型GSC 占比高的GBM 組織中會富集巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞，而這些GBM 組織中的巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞分泌的制瘤素M（oncostatin M，OSM）通過結(jié)合腫瘤細胞白血病抑制因子受體（leukemia inhibitory factor receptor，LIFR）激活STAT3 使腫瘤細胞獲得MES 亞型的特性[24]。炎性環(huán)境不但可以引起這種巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞誘導的MES 亞型轉(zhuǎn)化，還可以招募巨噬細胞，使其分泌TNF-α 在誘導下通過激活NF-κB 信號通路，使PN 亞型轉(zhuǎn)化成MES 亞型[4，10]。此外，DAMP 和小膠質(zhì)細胞的刺激下GBM 組織中的星形膠質(zhì)細胞可以轉(zhuǎn)化成反應性星形膠質(zhì)細胞，而這種反應性星形膠質(zhì)細胞通過IL-6、IL-8 和CCL2 激活腫瘤細胞的NF-κB、C/EBPβ 和STAT3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，使其轉(zhuǎn)化成MES 亞型并對放化療具有抵抗性[25]（圖1A，1B）。

3.4 腫瘤血管形成與PMT 循環(huán)

無論腫瘤壞死、缺氧或炎癥細胞的富集均可以導致大量血管形成因子如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）、PDGF 等分泌至周圍環(huán)境，而這些因子不僅招募血管上皮細胞到其微環(huán)境中，還促進血管上皮細胞的增殖使其形成GBM特異性的微血管[26]。微血管連接至循環(huán)血管時，腫瘤細胞可通過血液獲得充足的氧和營養(yǎng)素。而充足的氧和營養(yǎng)素環(huán)境抑制腫瘤細胞的壞死及缺氧區(qū)域的形成（圖1C），使PN 亞型的GSC 通過以EZH2 為主的多梳抑制復合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）表觀調(diào)控系統(tǒng)適應血管周圍環(huán)境并形成PN 亞型區(qū)域[15]。當腫瘤血管無法供應PN 亞型腫瘤細胞增殖所需要的氧和營養(yǎng)素時，再次形成局部細胞壞死及缺氧環(huán)境，進而發(fā)生PMT 過程轉(zhuǎn)化為MES 亞型。

綜上所述，GBM 的微環(huán)境是一個動態(tài)循環(huán)變化的過程，而此過程帶動GBM 不同亞型分布與轉(zhuǎn)化的過程。因此，根據(jù)GBM 亞型微環(huán)境變化機制挖掘適用性微環(huán)境調(diào)控靶點是控制GBM 惡性進展的關(guān)鍵。

4 亞型轉(zhuǎn)化與臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)

由于GBM 周圍的新生血管異常豐富，采用抗血管生成藥物（如貝伐單抗、舒尼替尼）治療是目前治療GBM 的另一種選擇。然而，目前一項以貝伐單抗為輔助化療藥物的大型前瞻性Ⅲ期臨床試驗結(jié)果顯示，標準治療+貝伐單抗治療并未改善GBM 患者的總生存期[27]。究其原因，雖然貝伐單抗的治療對PN 亞型有一定的抑制作用，但這種治療也導致了氧和營養(yǎng)素的供應不足，并局部形成缺氧及酸性等MES 微環(huán)境來激活MES 亞型轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，最終復發(fā)腫瘤呈現(xiàn)MES 亞型特性[28]。如前所述，TMZ 結(jié)合放療的標準化治療導致對放化療有抵抗性的MES 亞型富集并形成MES 亞型復發(fā)[10]。但也不能排除放療導致的放射性壞死釋放的DAMP 參與到PMT 并引起的放化療抵抗性（圖1D）。此外，放療引起的DNA 損傷也是GBM 亞型轉(zhuǎn)化相關(guān)領(lǐng)域里被受關(guān)注的部分。如當腫瘤細胞暴露于輻射環(huán)境時，輻射引起的DNA 損傷可通過共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）激活NF-κB 和C/EBPβ來誘導CD109 表達，在CD109 作用下激活YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄活性誘導發(fā)生PMT[14，29]，但這種DNA 損傷情況下被轉(zhuǎn)化的MES 亞型是否形成新的亞型克隆目前尚不清楚。當然，從GBM 亞型微環(huán)境的特異性分布和標準化治療后的微環(huán)境變化角度來看，也可以考慮將破壞亞型微環(huán)境作為治療GBM 的新策略。近期針對膠質(zhì)瘤開發(fā)的相關(guān)巨噬細胞BACE1 信號通路抑制劑MK-8931 能夠?qū)⒋倭鼍奘杉毎D(zhuǎn)化為對腫瘤細胞具有攻擊性的抑瘤巨噬細胞[30]，提示針對亞型微環(huán)境基質(zhì)細胞特性轉(zhuǎn)化的治療有望改善GBM 的惡性進展。

5 結(jié)語與展望

GBM 是成人原發(fā)性惡性腦腫瘤中十分常見和極具侵襲性的，臨床一線治療平均總生存期為15 個月。一旦治療失敗，預后較差。目前批準用于挽救治療的藥物僅有貝伐單抗，其中位總生存時間為8.7～9.2 個月。貝伐單抗失敗后，生存期約4 個月。因此，GBM迫切需要新的治療方法延長生存期。

目前，雖然已經(jīng)根據(jù)分子亞型的先前鑒定提出了使用個性化治療，但研究表明GBM 可以在一種亞型和另一種亞型之間轉(zhuǎn)換。此外，每個亞型均可以表達靜止和增殖的細胞亞狀態(tài)，這使設(shè)計新的治療策略變得困難。同一腫瘤背景下不同細胞亞狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變也可能導致數(shù)據(jù)誤解，尤其是標記物的表達與特定微環(huán)境相關(guān)時。因此，明確GBM 惡性亞型形成和轉(zhuǎn)化機制，從而制定相應的治療策略，是未來GBM 治療的關(guān)鍵。