血小板活化的分子機(jī)制及中藥活性成分抗血小板研究進(jìn)展*

王 珊 綜述，劉慧敏 審校

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442008)

中醫(yī)的“活血化瘀”理論與西醫(yī)的“抗血栓”相似，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥復(fù)方、中成藥、單味中藥及其有效成分主要通過改變血液流變學(xué)特性、調(diào)節(jié)血脂、改變血小板結(jié)構(gòu)和功能，而達(dá)到類似抗血栓的藥效。血小板活化是血栓形成的重要環(huán)節(jié)，抗血小板治療在血液循環(huán)系統(tǒng)疾病的研究中占據(jù)重要地位。中藥組分在一定程度上把中藥多成分、多靶點的復(fù)雜問題單一化，為中藥藥效作用機(jī)制的闡明提供了可能。中藥提取物中具有抗血小板活性的成分眾多，本文旨在綜述中藥成分抗血小板作用研究進(jìn)展，為中藥治療心腦栓塞性疾病和新藥研發(fā)提供參考。

1 血小板活化的分子機(jī)制

靜息狀態(tài)的血小板以不規(guī)則圓盤形隨血液流動，當(dāng)血管受損、血流動力學(xué)改變或受到化學(xué)物質(zhì)刺激時，血小板發(fā)生4種相互關(guān)聯(lián)的變化：形變、黏附、聚集和釋放，即血小板表面伸出偽足，附著于受損血管表面，聚集成團(tuán)，隨后釋放信使類物質(zhì)，統(tǒng)稱為血小板活化。一般把血小板聚集分為2種時相，第一相聚集主要是血小板聚集物的形成；第二相則代表釋放反應(yīng)。血小板釋放與聚集密切相關(guān)，如血小板致密顆粒和α-顆粒釋放的信使類物質(zhì)血小板因子-4(PF-4)、花生四烯酸(AA)、二磷酸腺苷(ADP)、5-羥色胺(5-HT)、P-選擇素等可引起進(jìn)一步的血小板活化。

目前認(rèn)為可以體外引發(fā)血小板聚集的誘導(dǎo)劑有AA、ADP、凝血酶、膠原、血小板活化因子(PAF)和腎上腺素等。其中，AA、ADP、PAF主要通過激活血小板膜上的G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)而激活血小板，聯(lián)合Gq、G12、Gi等蛋白，引發(fā)胞內(nèi)一系列的信號傳導(dǎo)，如第二信使(Ca2+、三磷酸肌醇)、酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶 C(PKC)等促進(jìn)血小板的聚集；環(huán)磷酸腺苷(cAMP)抑制血小板的聚集。凝血酶主要作用于蛋白酶激活受體和血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物，聯(lián)合Gq、G12蛋白和血管性血友病因子(vWF)影響血小板聚集和變形。膠原主要激活GPⅥ和整合素α2β1，其信號傳導(dǎo)通路的初始部分與其他G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的通路不同。膠原與受體結(jié)合后導(dǎo)致磷脂酶Cγ2(PLCγ2)磷酸化，活化的PLCγ2介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+增加促進(jìn)血小板活化，同時活化整合素，介導(dǎo)血小板的黏附反應(yīng)，促進(jìn)血栓形成。

血小板內(nèi)存在致密顆粒、α-顆粒和溶酶體，可分泌大量可溶性小分子和蛋白質(zhì)類物質(zhì)。致密顆粒儲存活化因子，如ADP可放大和維持最初的血小板活化；α-顆粒包含黏附分子、凝血因子、生長因子、趨化因子和大量黏附性受體，這些小分子或蛋白質(zhì)參與血栓形成、炎癥和部分單核細(xì)胞的生成等。血小板被激活后，收縮蛋白系統(tǒng)激活，將其顆粒內(nèi)容物釋放到血漿。首先為α-顆粒內(nèi)容物，包括PF-4、β-血小板球蛋白(β-TG)等，其次為致密顆粒內(nèi)容物釋放，包括ADP、5-HT、血栓烷A2(TXA2)、Ca2+等。血小板釋放與聚集密切相關(guān)，ADP、腎上腺素、Ca2+、TXA2 等引起的第二相聚集，形成不可逆的血小板聚集。α-顆粒膜上的P-選擇素，是血小板活化的最敏感標(biāo)志之一，檢測P-選擇素水平可反映血小板活化程度[1]。

1.1G蛋白偶聯(lián)受體

1.1.1ADP與血小板P2受體 ADP是第1個被鑒定為血小板激動劑的低分子化合物，本身對血小板的激動作用較弱，血小板活化后由致密顆粒釋放ADP，可放大其他激動劑誘導(dǎo)的血小板反應(yīng)，從而對血小板的功能發(fā)揮關(guān)鍵作用。ADP誘導(dǎo)血小板聚集功能的實現(xiàn)主要依賴于激活血小板膜表面的ADP受體，ADP受體屬于核苷酸受體(P2 受體)，現(xiàn)階段研究表明，血小板P2受體主要分為2類：配體離子通道(P2X)和G蛋白偶聯(lián)受體(P2Y)。其中P2Y是ADP受體，包括2種亞型：P2Y1和P2Y12。

P2Y1偶聯(lián)Gq蛋白，激活磷脂酶Cβ(PLCβ)，水解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)，IP3引起血小板內(nèi)Ca2+動員，胞漿Ca2+水平升高，促進(jìn)血小板活化聚集；DAG影響血小板顆粒釋放反應(yīng)，P2Y1引發(fā)血小板的可逆聚集。 P2Y12偶聯(lián)Gi 蛋白，上調(diào)PI3K/AKT信號通路和ERK水平[2]，抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)，降低血小板cAMP 含量，影響PKA的活性。綜合效應(yīng)為提高了血小板的活化反應(yīng)。

1.1.2AA與血栓烷受體(TP) AA誘導(dǎo)血小板聚集作用較強(qiáng)，生理條件下血小板膜磷脂在磷脂酶A2(PLA2)作用下轉(zhuǎn)化為AA，AA在環(huán)氧合酶作用下轉(zhuǎn)化為前列腺素 H2(PGH2)，PGH2 經(jīng)特定酶轉(zhuǎn)化為TXA2和其他前列腺素。TXA2 激活TP受體，TP受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，廣泛存在于多種不同細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)中，分為 TPα 和 TPβ 2種亞型，血小板中主要存在TPα 受體。TP激活劑主要與血小板中Gq與G12相偶聯(lián)，其中Gq最具標(biāo)志性。TP 激活劑使Gq分離為α、β、γ 3個亞基。Gβγ 聯(lián)結(jié)到PLCβ，生成IP3和DAG，其中 IP3刺激血小板中Ca2+釋放，增加血小板中Ca2+濃度；DAG增強(qiáng)PKC活性，導(dǎo)致血小板致密顆粒釋放反應(yīng)，進(jìn)一步加強(qiáng)血小板的聚集[3]。有研究表明，血小板中G12與RhoGEF偶聯(lián)后激活Rho介導(dǎo)的血小板聚集通路(依賴于RhoA/ROCK)。

1.2膠原與膠原受體 內(nèi)皮下膠原蛋白是一種強(qiáng)效血小板激動劑，在血管損傷后，暴露的膠原纖維有助于血栓的初步形成。研究較多的血小板表面膠原受體有2種：GP Ⅵ和整合素α2β1。GP Ⅵ屬于免疫球蛋白超家族，本身沒有信號傳導(dǎo)能力，與IgG Fc受體(FcR)γ鏈形成復(fù)合物后，結(jié)合膠原，導(dǎo)致PLCγ2磷酸化，活化的PLCγ2介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+增加和隨后的血小板激活。在靜息血小板中整合素α2β1對膠原親和力較低，但在活化血小板中整合素轉(zhuǎn)化為高親和力構(gòu)象，介導(dǎo)血小板與膠原的緊密黏附，從而增加與GP Ⅵ的相互作用，促進(jìn)血栓形成。有研究發(fā)現(xiàn)在GP Ⅵ缺乏的血小板中，膠原可依賴整合素α2β1介導(dǎo)酪氨酸磷酸化，并可與血栓烷類似物U46619共同促進(jìn)血小板ATP的釋放。但整合素是作為信號分子或是親和力調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，及其在血小板中介導(dǎo)的蛋白信號傳遞尚不十分清楚。

1.3凝血酶與蛋白酶激活受體 凝血酶在激活血小板中起著至關(guān)重要的作用，凝血酶可誘導(dǎo)體外血小板的形變、黏附和釋放反應(yīng)。凝血酶主要作用于血小板膜上的蛋白酶激活受體(PARs)，為7重跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，N端暴露于血小板胞外，與GPCRs結(jié)構(gòu)相似。目前研究證實PARs有4種亞型，其中人類血小板主要表達(dá)PAR-1和PAR-4。低濃度凝血酶即可裂解PAR-1的N端，以暴露配體結(jié)合區(qū)，而活化PAR-4則需要較高濃度的凝血酶，即PAR-1是凝血酶的主要信號受體。凝血酶與PAR-1結(jié)合后，活化胞內(nèi)Gq與G12，進(jìn)而升高胞內(nèi)Ca2+濃度并增加PKC活性。GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物也是一種凝血酶受體，GPⅠb的二聚體結(jié)構(gòu)通過二硫鍵與GPⅨ和GPⅤ形成復(fù)合物，作為vWF的結(jié)合位點影響血小板細(xì)胞骨架[4]。GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物也可能促進(jìn)PAR-1激活或通過凝血酶調(diào)節(jié)血小板的活化。

2 中藥組分抗血小板研究

2.1皂苷類 皂苷是一類苷元為三萜或螺旋甾烷的糖苷，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，生物活性較高，可改善血液流變學(xué)和高凝狀態(tài)，并有抗血小板和抗血栓等藥效活性。研究較多的有薯蕷皂苷、人參皂苷、三七皂苷等。薯蕷皂苷元在體外有明顯的抗ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用，且呈量效關(guān)系；薯蕷次苷A有體外抑制U46619誘導(dǎo)血小板聚集的活性[5]。人參皂苷Rg1可抑制凝血酶、膠原、ADP和AA誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)血小板聚集，明顯減弱三氯化鐵(FeCl3)誘導(dǎo)血小板黏附與血栓形成[6]；人參皂苷Re具有抗ADP、PAF、AA誘導(dǎo)的血小板聚集活性[7]；人參皂苷Ro抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，主要通過降低血小板胞漿Ca2+濃度和升高cAMP水平。三七總皂苷可明顯抑制由ADP、AA、膠原誘導(dǎo)的血小板聚集[8]，并有體外抗剪切力誘導(dǎo)血小板聚集的效應(yīng)[9]，且抑制血小板黏附活性優(yōu)于阿司匹林。知母皂苷AⅢ可完全抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，并可抑制血小板形變和釋放反應(yīng)。懷牛膝總皂苷可能通過調(diào)節(jié)前列腺素I2(PGI2)/TXA2，抑制血小板聚集，進(jìn)而改善心肌缺血。柴胡皂苷a可通過抑制內(nèi)源性AA的形成從而抑制血小板聚集，柴胡皂苷對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集也有很好的抑制作用[10]。

2.2黃酮類 中藥黃酮類成分繁多，多以2-苯基色原酮為母核，C6-C3-C6為基本骨架，多種黃酮類成分具有抗血小板活化的活性，主要通過阻斷TXA2受體，抑制5-HT 和TXA2的釋放及抑制血小板內(nèi)Ca2+濃度的升高等作用來抑制血小板活化。川陳皮素可能通過阻斷TXA2受體、抑制磷脂酰肌醇3激酶信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響cAMP和cGMP的生成，進(jìn)而抑制血小板磷酸二酯酶的活性，從而影響血小板黏附、聚集[6]。槲皮素呈劑量依賴性抑制血小板磷酸二酯酶3活性，提高血小板cAMP濃度，從而抑制ADP和PAF誘導(dǎo)的血小板聚集[11]。燈盞乙素可呈濃度依賴性抑制膠原、ADP及凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集[12]。葛根素可抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。水飛薊亭可抑制ADP、膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，其作用機(jī)制主要是抑制P-選擇素表達(dá)并激活整合素αⅡbβ3[13]。

2.3生物堿類 生物堿是一類堿性的含氮有機(jī)化合物，是中藥的重要活性成分之一，在抗血小板聚集方面具有顯著的藥理活性。研究證實，四氫異喹啉生物堿通過多途徑和多靶點抑制血小板聚集，蓮心堿和異蓮心堿均可有效抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，可能與其抑制Ca2+內(nèi)流有關(guān)。甲基蓮心堿能抑制凝血酶、膠原、U46619、ADP誘導(dǎo)的血清干細(xì)胞血小板聚集。小檗堿對膠原、ADP、AA誘導(dǎo)的血小板聚集具有顯著的抑制作用，主要機(jī)制可能涉及抑制TXA2的合成和Ca2+內(nèi)流或是競爭性抑制血小板α2腎上腺素受體，從而抑制血小板聚集[14]。川芎嗪可抑制凝血酶、ADP、膠原誘導(dǎo)的血小板聚集；鉤藤堿和異鉤藤堿對ADP、膠原、AA 和凝血酶誘導(dǎo)的大鼠和家兔血小板聚集均表現(xiàn)出顯著抑制作用，且呈一定的濃度依賴性。

2.4有機(jī)酸類 有機(jī)酸類化合物是中草藥中常見的水溶性成分，研究發(fā)現(xiàn)多種有機(jī)酸類化合物對體外ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有抑制作用。丹參活性成分丹酚酸可顯著抑制ADP、凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集[15]；當(dāng)歸和川芎的主要活性成分是阿魏酸，可抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制5-HT釋放[16]。金銀花的活性成分綠原酸和異綠原酸等可有效抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。馬尾松中提取的莽草酸可抑制由膠原、ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，并呈濃度依賴性。漆樹的活性成分漆酚可顯著抑制ADP或AA誘導(dǎo)的血小板聚集[17]。

2.5萜類 萜類成分眾多，也是中藥活性成分中重要的一部分，涉及血小板活性的主要有以下研究。二萜類化合物，銀杏內(nèi)酯K、B、A、C等均有抑制體外PAF誘導(dǎo)血小板聚集的活性[18]；藍(lán)萼甲素對AA和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制效果顯著，并可抑制環(huán)氧酶-1活性[7]。倍半萜化合物、白果內(nèi)酯對PAF誘導(dǎo)的血小板聚集有一定抑制作用[19]；莪術(shù)二酮可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集[20]；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、Ⅲ可抑制由ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集[21]；丹參酮ⅡA對于ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有抑制作用[22]。

2.6其他 現(xiàn)代研究證實，柏木醇是一種天然的血小板活化因子受體拮抗劑，可阻斷AA、膠原、ADP與PAF受體結(jié)合，從而抑制血栓生成[23]。人參多糖、香菇多糖、黃芪多糖、昆布多糖、萱藻多糖均有抑制血小板聚集的活性[6]。香豆類成分秦皮乙素有很強(qiáng)的抑制AA和膠原誘導(dǎo)血小板聚集的活性[24]。九里香酮和異栓翅芹醇對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有抑制作用[25]。丁香油可抑制由AA、PAF或膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，其中對AA誘導(dǎo)的聚集抑制作用優(yōu)于膠原。

3 小 結(jié)

本文首先從血小板受體方面總結(jié)了抗血小板聚集的作用機(jī)制，對血小板ADP受體、血栓烷受體、凝血酶受體、膠原受體等血小板膜受體激活后誘發(fā)血小板聚集的作用通路進(jìn)行闡述。其次，對現(xiàn)階段中藥抗血小板活性成分進(jìn)行分類總結(jié)，主要涉及皂苷類、黃酮類、生物堿類、有機(jī)酸類、萜類和其他類成分。以上多種中藥組分在抗血小板聚集活性方面具有較好的開發(fā)前景，但其更深入的作用機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系并不十分明確。中藥成分復(fù)雜多樣，從中藥活性成分及其衍生物中開發(fā)新的抗血小板治療用藥前景廣闊。