RhoA/ROCK-p38/ERK通路參與血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究進(jìn)展

廖意娟，馬逸杰，饒澤華，易麗貞，吳雪芬，宋家薇，劉 欣，岳增輝

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410208)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種以動脈內(nèi)膜斑塊為特征的血管類疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AS是導(dǎo)致我國嚴(yán)重心血管疾病的常見病理因素之一[1]。對于AS的發(fā)病機(jī)制，動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致AS的始動環(huán)節(jié)，因此對與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)物質(zhì)參與AS機(jī)制的研究較多。而研究發(fā)現(xiàn)AS與血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型變化亦存在密切關(guān)系[2]。在最初的AS形成過程中，促炎物質(zhì)刺激觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)皮細(xì)胞因子分泌，導(dǎo)致血管炎癥，觸發(fā)VSMCs去分化為增殖合成型，VSMCs不斷增殖并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，參與形成AS纖維帽[3]。隨著病變的持續(xù)，AS斑塊進(jìn)展為易損斑塊，破裂風(fēng)險增高，甚至誘發(fā)血栓形成，導(dǎo)致危重心血管疾病的發(fā)生。因此，闡清AS形成的具體機(jī)制，有利于進(jìn)一步指導(dǎo)AS的防治。Ras同源物基因組成員A/Ras相關(guān)卷曲螺旋蛋白激(Ras homolog gene family,member A/Ras homolog associated coiled-coilcontaining protein kinase,RhoA/ROCK)信號通路是一種非Ca2+依賴性平滑肌收縮調(diào)節(jié)信號通路。該通路可通過調(diào)控肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)等下游蛋白的磷酸化，調(diào)節(jié)平滑肌功能。多項(xiàng)研究證明RhoA/ROCK通路是參與AS的重要通路[4-5]。絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)與細(xì)胞增殖調(diào)控關(guān)系密切，其家族成員p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)參與VSMCs表型轉(zhuǎn)換的作用尚具爭議，研究發(fā)現(xiàn)其可能具有促進(jìn)或抑制VSMCs增生的雙重效應(yīng)[6-7]。RhoA/ROCK作為p38 MAPK、ERK1/2上游調(diào)節(jié)因子，兩者共同參與VSMCs表型轉(zhuǎn)換的關(guān)聯(lián)性研究及是否共同參與調(diào)控AS的探索具有一定意義。課題組前期研究證明了隔藥餅灸可通過促膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制炎性物質(zhì)表達(dá)等途徑保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而改善AS、穩(wěn)定易損斑塊[8-9]，而涉及血管平滑肌的研究較少。因此，本文將從AS與VSMCs表型轉(zhuǎn)換相關(guān)概念、RhoA/ROCK-p38 MAPK/ERK1/2通路參與VSMCs表型轉(zhuǎn)換及AS的研究進(jìn)展、隔藥餅灸干預(yù)該通路防治AS可能性等方面進(jìn)行綜述。

1 動脈粥樣硬化與血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換

AS早期以感受環(huán)境刺激(如生長因子/抑制劑、機(jī)械作用、細(xì)胞間相互作用及各類炎癥介質(zhì)等)、內(nèi)皮細(xì)胞功能受損為主，內(nèi)皮細(xì)胞激活，促炎性細(xì)胞聚集，血小板活化沉積，釋放多種細(xì)胞因子，活化VSMCs和巨噬細(xì)胞，VSMCs由收縮表型去分化為高度增殖的合成表型，遷移至內(nèi)膜層并增生產(chǎn)生大量基質(zhì)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化和遷移，導(dǎo)致血管壁通透性增加，脂質(zhì)沉積，巨噬細(xì)胞源性及VSMCs源性泡沫細(xì)胞形成，進(jìn)而發(fā)展為斑塊[10]?？梢?，VSMCs表型轉(zhuǎn)換是參與動脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)鍵因素之一。

在正常狀態(tài)下，動脈中層平滑肌細(xì)胞保持極低合成活性收縮狀態(tài)；當(dāng)血管損傷及炎癥時，VSMCs可去分化為增殖合成型。VSMCs在內(nèi)膜的遷移和增殖，參與斑塊的進(jìn)展[11]。VSMCs表型何為主導(dǎo)與其特定蛋白表達(dá)密切相關(guān)。其中，平滑肌α-肌動蛋白、肌動蛋白相關(guān)蛋白及調(diào)寧蛋白等是VSMCs收縮表型的標(biāo)志蛋白；骨橋蛋白和彈性蛋白原等為增殖型VSMC的標(biāo)志蛋白。而VSMCs表型的調(diào)控由環(huán)境信號決定，如機(jī)械力、特定分子的內(nèi)吞作用和影響VSMCs特定基因表達(dá)的生長因子等[12]。其中，血小板衍生生長因子BB和轉(zhuǎn)化生長因子β是血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵介質(zhì)[13]，前者參與了血管平滑肌細(xì)胞特異性基因表達(dá)的主動抑制，而后者則促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞收縮表型形成[14]。研究證明，VSMCs特異性基因表達(dá)的調(diào)節(jié)依賴于多種因子的相互作用[15]，體內(nèi)VSMCs的表型調(diào)節(jié)部分是通過抑制轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的，而參與該途徑的因子活性由多種信號通路調(diào)控，包括RhoA/ROCK、ERK1/2、p38 MAPK等。

2 RhoA/ROCK-p38 MAPK/ERK1/2相關(guān)分子及功能

2.1RhoA與ROCK Rho蛋白屬小G蛋白超家族的亞家族成員,由Rho、Rac、Cdc42等5個亞家族組成。Rho亞家族蛋白包括RhoA、RhoB和RhoC，其中RhoA為Rho亞家族蛋白的主要研究成員[16]。與所有Rho蛋白一樣，RhoA在非活性鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)結(jié)合形式與活性鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)結(jié)合形式之間循環(huán)。其活化狀態(tài)受到GDP/GTP鳥嘌呤交換因子、GTP酶激活蛋白、GDP解離抑制因子的共同調(diào)節(jié)[17]。Rho經(jīng)典循環(huán)機(jī)制，即是細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體與各種細(xì)胞因子、黏附分子、激素等結(jié)合，刺激GEFs集聚，促進(jìn)Rho-GTP替代Rho-GDP，Rho蛋白激活，進(jìn)一步識別下游效應(yīng)器；GAP可加速RhoA內(nèi)源性GTP酶活性，使開關(guān)失活；GDPI允許Rho蛋白在胞膜與胞質(zhì)中移動。除此之外，還存在多種非經(jīng)典調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)一步調(diào)控Rho蛋白循環(huán)，如微小核糖核酸(micro-ribonucleic-acid，miRNA)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[18]，磷酸化與去磷酸化循環(huán)[19]等。其中，磷酸化調(diào)節(jié)在動脈壁中尤為重要。RhoA信號作為調(diào)節(jié)VSMCs功能相關(guān)的多種信號匯聚點(diǎn)，其他途徑可能通過磷酸化調(diào)節(jié)RhoA[20]。

ROCK為RhoA主要下游效應(yīng)器，由N末端的激酶域、C末端的PH區(qū)域及Rho結(jié)合區(qū)域(Rho binding domain，RBD)構(gòu)成[21]。ROCK可參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如肌動蛋白細(xì)胞骨架組裝,細(xì)胞收縮、增殖、分化等。RhoA介導(dǎo)的ROCK是VSMCs的主要調(diào)節(jié)因子，也是操縱這些細(xì)胞其他功能的關(guān)鍵因素。其亞型ROCK1和ROCK2具有65%的氨基酸序列同源性，但卻發(fā)揮不同作用并調(diào)控不同靶蛋白。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ROCK1與ROCK2可能具有相反效應(yīng)[22]，但仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。其中，ROCK2被認(rèn)為是各種信號途徑的整合點(diǎn),尤其是調(diào)節(jié)VSMCs收縮的信號[23]。然而由于ROCK1和ROCK2在VSMCs中均有表達(dá)[24]，目前并不能明確ROCK不同亞型在VSMCs功能的具體作用。活化的RhoA以RhoA-GTP形式與ROCK的RBD結(jié)合后,ROCK空間結(jié)構(gòu)改變,活性中心暴露，進(jìn)一步發(fā)生多位點(diǎn)磷酸化而被激活,ROCK表現(xiàn)出激酶活性并磷酸化多種下游底物，如MLC、肌球蛋白磷酸酶、LIM激酶、埃茲蛋白、肌鈣蛋白、粘著斑、激酶和ERK1/2等[25]，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮、增殖、遷移等多種功能。

2.2p38 MAPK與ERK1/2 MAPK家族由ERK1/2、p38 MAPK、JNK/SAPK和ERK5四個亞群組成。MAPK與細(xì)胞增殖調(diào)控關(guān)系最為密切，是細(xì)胞外信號與細(xì)胞核間信號傳遞的共同途徑，該途徑利用三級激酶級聯(lián)反應(yīng)(MAPKKK-MAPKK-MAPK)進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。MAPK通路可被多種胞內(nèi)外刺激(包括生長因子、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子等)激活[26]，因而能介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)生物效應(yīng)。已有學(xué)者提出，MAPK信號通路可能參與血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究來闡明[27]。

p38 MAPK在分化的平滑肌中表達(dá)，并被激活ERK1/2的相同神經(jīng)遞質(zhì)激活[28]。p38 MAPK與ERK1/2的上調(diào)可促進(jìn)VSMCs增殖，而p38 MAPK在某些環(huán)境下可抑制ERK1/2活性。Kintscher等[29]發(fā)現(xiàn)p38 MAPK參與了血管緊張素Ⅱ(Angiotensinogen Ⅱ，ATⅡ)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞精氨酸酶活性的增加，間接促進(jìn)VSMCs增殖；又可負(fù)性調(diào)節(jié)AT Ⅱ誘導(dǎo)的人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞ERK1/2，減少VSMCs增生。該差異性結(jié)果可能與參與調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的VSMCs增殖的p38 MAPK亞型不同[30]有關(guān)。ERK1/2信號被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[31]。miRNA參與了ERK1/2信號通路蛋白在增殖性VSMCs中的下調(diào)。吳昊等[32]總結(jié)發(fā)現(xiàn)miR-24、miR-31、miR-221、miR-146a、miR-208可通過促進(jìn)VSMCs增殖誘導(dǎo)其向合成表型轉(zhuǎn)換；miR-1、miR-21、miR-26a、miR-100、miR-133、miR-365則可通過抑制VSMCs增殖和遷移、上調(diào)收縮基因以及加速VSMCs分化誘導(dǎo)VSMCs向收縮表型轉(zhuǎn)換。miRNA在循環(huán)血液中十分穩(wěn)定，許多生物標(biāo)志物的研究均基于循環(huán) miRNA 的定量[33]，因此VSMCs表型相關(guān)miRNA可在一定程度上反映ERK1/2表達(dá)情況。

3 RhoA/ROCK-p38 MAPK/ERK1/2通路關(guān)聯(lián)性及進(jìn)展

RhoA/ROCK被證明是MAPK家族成員的上游調(diào)節(jié)因子，ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化依賴于RhoA/ROCK途徑[34]，是p38 MAPK、ERK1/2激活所必要的[35]。

磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是細(xì)胞膜中鞘磷脂代謝產(chǎn)生的一種生物活性脂類物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移，與Cer和Sph負(fù)調(diào)控因子共同調(diào)控細(xì)胞增殖與遷移，在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。S1P誘導(dǎo)VSMCs增殖遷移過程中，Rho信號通路對ERK1/2和p38 MAPK存在差異性調(diào)節(jié)。Rho通過MEK1/2調(diào)節(jié)ERK1/2活化；ROCK以與其無關(guān)的方式負(fù)性調(diào)節(jié)ERK1/2，并通過MKK3/6正性調(diào)節(jié)p38 MAPK[36]。這是G蛋白耦合受體通過Rho途徑調(diào)控MAPK不同成員的首次描述。后期研究發(fā)現(xiàn)，S1P因受體類型的不同在VSMCs中具有促進(jìn)和抑制遷移的雙重作用，S1PR1/3是趨化受體，誘導(dǎo)VSMCs遷移，S1PR2則介導(dǎo)抑制細(xì)胞遷移；且S1P具有在相對低水平誘導(dǎo)遷移、高劑量抑制的特點(diǎn)，其中高濃度的S1P通過S1PR2激活ROCK，抑制VSMCs遷移[37-38]。Rho信號通路對ERK1/2和p38 MAPK產(chǎn)生差異性調(diào)節(jié)時，S1PR何種類型占主導(dǎo)及參與機(jī)制等是值得進(jìn)一步研究的問題。Tong等[39]和Ngok等[40]發(fā)現(xiàn)，ERK1/2和RhoA/ROCK以相互激活的方式支持表皮生長因子受體途徑和尿激酶型纖溶酶原激活劑刺激的細(xì)胞增殖與遷移。Taglietti等[41]卻認(rèn)為ROCK介導(dǎo)RhoA信號對ERK1/2活性的負(fù)調(diào)節(jié)。這種差異性結(jié)果可能與ERK1/2可通過磷酸化RhoA不同位點(diǎn)發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用有關(guān)。而p38 MAPK亞型亦被證明可能受RhoA的差異調(diào)節(jié)，對細(xì)胞增殖遷移發(fā)揮不同作用，其調(diào)節(jié)方式取決于RhoA自身被激活的機(jī)制[42]。Chen等[43]研究發(fā)現(xiàn)RhoA和ERK1分別是miR-125a-3p和miR-483-5p的靶基因，miR-125a-3p和miR-483-5p可能共同調(diào)節(jié)RhoA/ROCK1/ERK1/2信號通路的活性，通過抑制該通路可促進(jìn)多發(fā)性對稱脂肪瘤病的成脂作用。他們認(rèn)為RhoA/ROCK1/ERK1/2信號通路是開發(fā)防治多發(fā)性對稱脂肪瘤病或肥胖患者藥物的潛在治療靶點(diǎn)。研究中分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR與MAPK、Wnt、TGF-β和肌動蛋白細(xì)胞骨架信號通路的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，而這些通路已被證明密切參與血管平滑肌增殖及AS的調(diào)控，RhoA/ROCK1/ERK1/2信號通路的研究是否參與其中值得進(jìn)一步探索。而在涉及RhoA、ERK1通路的研究中，miR-125a-3p和miR-483-5定量可作為反映RhoA、ERK1表達(dá)情況的指標(biāo)之一。Li等[44]通過相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)分析表明，Rho 信號和MAPK/ERK信號是參與前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)介導(dǎo)的血栓素-前列腺素受體(thromboxane-prostanoid,TP)依賴性VSMCs表型轉(zhuǎn)化最相關(guān)的信號通路。

由上可知，RhoA/ROCK信號通路與p38 MAPK、ERK1/2通路相互聯(lián)系參與VSMCs表型轉(zhuǎn)換，其中以ERK1/2更為密切。

4 隔藥餅灸干預(yù)可能性

隔藥餅灸屬于中醫(yī)灸法的一種，其本質(zhì)是通過刺激相應(yīng)穴位發(fā)揮中藥及艾灸的藥性和溫?zé)岬茸饔弥委熛嚓P(guān)疾病。而隔藥餅灸被認(rèn)為是防治AS的 一種安全有效的治療方式，但對于隔藥餅灸有效防治AS的分子學(xué)機(jī)制，目前研究尚未闡明。

Huang等[45]發(fā)現(xiàn)艾灸可能通過抑制大鼠脊髓MAPK信號通路減輕慢性炎癥性內(nèi)臟痛，認(rèn)為艾灸影響了ERK、JNK和p38通路，其中ERK通路占主導(dǎo)，MAPK/ERK通路可能是艾灸抗炎鎮(zhèn)痛中MAPK信號通路的主要通路。而近期多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)隔藥灸能下調(diào)相應(yīng)組織p38MAPK、ERK的表達(dá)參與治療克羅恩病、子宮內(nèi)膜異位癥、佐劑性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及慢性支氣管炎等多種疾病[46-49]。本課題組前期在隔藥餅灸參與防治AS機(jī)制的研究中，基于久病入絡(luò)，久病多瘀，病絡(luò)者治其血的原理，選取丹參、山楂、澤瀉、郁金、大黃等活血化瘀降濁之藥物為藥餅主要成分[50]。其中，丹參與山楂是治療心血管疾病的經(jīng)典藥對?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，張建永等[51]發(fā)現(xiàn)丹參山楂有效組分配伍(SC121)是通過多靶點(diǎn)、多通路及多生物途徑協(xié)同抗動脈粥樣硬化，但其具體機(jī)制尚未闡明。楊凱麟等[52]亦發(fā)現(xiàn)，丹參可多靶點(diǎn)多通路發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗斑塊形成四大作用，其中MAPK信號通路為關(guān)鍵通路之一。

由此可知，隔藥餅灸防治AS可能與MAPK通路密切相關(guān)，其與p38MAPK、ERK1/2的關(guān)系值得進(jìn)一步探索。

5 討 論

內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs之間的相互作用在調(diào)節(jié)心血管穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞參與AS進(jìn)展的機(jī)制相對明晰，而對VSMCs的研究較少。因此，探索VSMCs參與AS的分子學(xué)機(jī)制值得進(jìn)一步進(jìn)行。VSMCs表型轉(zhuǎn)換參與了AS斑塊形成。而隨著AS病變的持續(xù)，大量炎性物質(zhì)浸潤，脂質(zhì)聚集增大，纖維帽變薄，斑塊趨于不穩(wěn)定、易破裂，極大增加了心肌梗死、腦栓塞等重大心血管疾病誘發(fā)的風(fēng)險。調(diào)節(jié)VSMCs的增殖與遷移被認(rèn)為可能是預(yù)防AS的有效策略[53]。因此，闡明VSMCs表型轉(zhuǎn)換參與AS的機(jī)制，有利于進(jìn)一步指導(dǎo)AS的防治。

RhoA/ROCK通路是參與AS的關(guān)鍵通路之一，該通路作為p38 MAPK、ERK激活所必要的上游調(diào)節(jié)因子，兩者共同參與AS的機(jī)制值得進(jìn)一步探索。VSMCs增殖與遷移參與AS斑塊形成，p38 MAPK、ERK1/2與VSMCs表型轉(zhuǎn)換關(guān)系密切，可能通過調(diào)控VSMCs表型變化參與AS的調(diào)控。因此，筆者認(rèn)為，RhoA/ROCK通路可能通過進(jìn)一步調(diào)控p38 MAPK、ERK1/2刺激VSMCs表型轉(zhuǎn)換參與AS，其過程可因激活物種類及含量、RhoA磷酸化位點(diǎn)、p38亞型等原因出現(xiàn)差異性調(diào)節(jié)，但需進(jìn)一步驗(yàn)證。

結(jié)合前述，隔藥餅灸防治AS可能與p38 MAPK/ERK1/2通路參與艾灸抗炎、藥餅成分降脂等作用有關(guān)。因此，隔藥餅灸防治AS、穩(wěn)定易損斑塊與RhoA/ROCK-p38MAPK/ERK1/2通路關(guān)系的研究，是本課題組接下來的主要探索方向。但目前暫無相關(guān)研究表明隔藥餅灸治療AS與VSMCs表型轉(zhuǎn)換相關(guān)，未來應(yīng)著力推進(jìn)隔藥餅灸改善AS在VSMCs方面的機(jī)制研究，明確參與表型轉(zhuǎn)換的相關(guān)蛋白、因子等，以期為AS的防治提供新的方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。