非小細(xì)胞肺癌早期診斷中的MALDI-TOF MS應(yīng)用*

閆馨予 高俊珍

1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特市 010059； 2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

肺癌是發(fā)病率及死亡率一直居高不下的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署(International Agency for Research on Cancer，IARC)2018年發(fā)布的報(bào)告顯示：2018年世界排名前10的癌癥類型中,肺癌不僅是最常見的癌癥(占新發(fā)病例的11.6%)，而且是癌癥里的主要死因(占死亡總病例的18.4%)[1]。肺癌分類中，非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是其最常見的組織學(xué)類型，超過60%的肺癌患者在診斷時(shí)已為晚期，患者通常無法選擇手術(shù)切除治療，只能寄希望于現(xiàn)在主要的治療手段如常規(guī)化療和放射治療[2]。目前常用的醫(yī)學(xué)診斷方法主要是低劑量螺旋CT、支氣管鏡檢等技術(shù)，雖然低劑量螺旋CT的應(yīng)用相比胸部X線片明顯提高了非小細(xì)胞肺癌早診率，使死亡率下降了20%[3]，但是其非小細(xì)胞肺癌的早期診斷率仍然不能令人滿意，腫瘤標(biāo)志物的識(shí)別也是惡性腫瘤診斷的可用方法[4]，但其靈敏度和特異度并不算高。故為了提高5年生存率，迫切需要及時(shí)有效的、更早于影像學(xué)診斷的、靈敏性和特異性更高的、無創(chuàng)便捷的早期診斷方法。

代謝組學(xué)作為一門廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域的飛速發(fā)展學(xué)科，是基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的延展。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，有特定的代謝過程[5]，或可利用代謝組學(xué)技術(shù)監(jiān)測(cè)這些代謝物的變化或波動(dòng)情況，識(shí)別未知代謝產(chǎn)物達(dá)到早期診斷的目的。

1 代謝組學(xué)概述

1.1 代謝組學(xué)的定義 代謝組學(xué)主要通過分析體內(nèi)小分子代謝產(chǎn)物(相對(duì)分子質(zhì)量<1 000)來推測(cè)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境是否遭受了病毒入侵或攝入含有毒素的食物藥物并評(píng)估機(jī)體整體狀態(tài)。目前人們普遍認(rèn)為代謝組學(xué)可用來推測(cè)機(jī)體受到疾病或外部因素等干擾而產(chǎn)生的最終應(yīng)答，通過探究生物體受到外部刺激而產(chǎn)生的最終代謝產(chǎn)物的變化。

1.2 代謝組學(xué)的特點(diǎn) 圓滿完成人類基因組的測(cè)序讓我們?cè)诜肿俞t(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入新紀(jì)元。雖然整個(gè)生命活動(dòng)中是基因組提供藍(lán)圖，蛋白組提供所需結(jié)構(gòu)并催化激活相應(yīng)蛋白，但最后生動(dòng)反映生物體在環(huán)境中的表達(dá)仍是通過它的動(dòng)態(tài)代謝及產(chǎn)物[6-7]。代謝組學(xué)具有以下特點(diǎn)：(1)基因和蛋白表達(dá)的有效微小變化會(huì)逐步放大呈現(xiàn)在最終的代謝物上，許多不能從基因組、蛋白質(zhì)組體現(xiàn)的變化也可從代謝組中體現(xiàn)。(2)代謝組學(xué)位于系統(tǒng)生物學(xué)最下游，直接反映機(jī)體病理狀態(tài)下所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物的最終狀態(tài)，故相較于基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組更準(zhǔn)確[8]。(3)人類基因組大約有4萬，編碼多達(dá)100萬個(gè)蛋白質(zhì)[9]，但代謝產(chǎn)物估計(jì)只有幾千種，其種類遠(yuǎn)少于基因和蛋白的數(shù)目，研究起來相對(duì)方便。(4)可選取獲取方式便捷的體液如血液、唾液等作為代謝組學(xué)的研究標(biāo)本。(5)不需要全基因組測(cè)序或建立大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫。這些特點(diǎn)使得代謝組學(xué)成為比蛋白質(zhì)組學(xué)更吸睛的研究熱點(diǎn)，但是代謝組學(xué)為什么最近才逐漸開始興起呢？之前的分子研究為何始終只圍繞在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)方面？部分緣由為代謝組學(xué)的技術(shù)所限。

1.3 代謝組學(xué)的檢測(cè)技術(shù) 核磁共振(NMR)、液相色譜—質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜—質(zhì)譜法(GC-MS)、MALDI-TOF-MS等是代謝組學(xué)常用技術(shù)。NMR是最早的可測(cè)量生物標(biāo)本代謝物的技術(shù)，該技術(shù)雖然在選取腫瘤標(biāo)志物[10]、判斷預(yù)后[11]、病理分型[11]、早期診斷[12]等方面已成功應(yīng)用。但它有著不少缺點(diǎn)：光譜分辨率不高；導(dǎo)出的圖譜上受到多種化合物峰值互相干擾的影響以至于解析成果受限，其敏感性也較LC-MS低[13]。LC-MS和GC-MS技術(shù)的靈敏度及特異性均高，也被大量應(yīng)用于各種腫瘤代謝研究中。但它們的局限也讓人無法忽視，GC-MS沒法應(yīng)用于高極性代謝物，只能在穩(wěn)定的化合物上作用。不能廣泛應(yīng)用于所有樣本，而且不具備完整的圖譜庫，想要繼續(xù)深入研究，還需要自己建立分析圖庫。所以目前這兩種技術(shù)仍處在建立龐大且可供對(duì)比的代謝物圖譜階段。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷更新，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)成為了最常用的新型軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)之一[14]。

1.3.1 MALDI-TOF-MS技術(shù)的原理及特點(diǎn)：它的原理是將合適波長的激光照射在檢測(cè)樣品與基質(zhì)混合形成的共結(jié)晶薄膜上，利用基質(zhì)對(duì)激光的強(qiáng)吸收將所測(cè)分子鏈逐出并使其離子化，同時(shí)基質(zhì)可使該分子鏈免遭超強(qiáng)激光直接照射而導(dǎo)致的不可逆損傷。最后將生物分子運(yùn)送至質(zhì)量分析器中分析具體分子量。MALDI-TOF-MS具有以下特點(diǎn)：(1)方法便捷；(2)樣本簡(jiǎn)單預(yù)處理即可，低樣本量也能直接研究；(3)快速大范圍檢測(cè)的同時(shí)還可以保證高靈敏度；(4)更耐鹽、去垢劑和較高濃度緩沖溶液的污染；(5)質(zhì)荷比值可對(duì)應(yīng)于代謝小分子等的分子量。這些功能使MALDI-TOF MS成為常規(guī)臨床分析的關(guān)鍵平臺(tái)，非常適合生物活性物質(zhì)快速、大范圍、高通量的篩選。非小細(xì)胞肺癌的早期代謝變化相比于正常細(xì)胞很可能只有細(xì)微的差別，普通的分析技術(shù)也許無法鑒定出這究竟是不是腫瘤細(xì)胞，更無法明確這是否屬于非小細(xì)胞肺癌，但MALDI-TOF-MS技術(shù)極其敏感，即使在接近亞飛克(Sub-femtomole)分子水平的濃度范圍內(nèi)仍可檢測(cè)到生物大分子[15](如多肽、蛋白質(zhì))，不僅可以研究細(xì)胞內(nèi)各種基因表達(dá)產(chǎn)物的多項(xiàng)代謝過程，而且可以在分子水平上直接分析微量代謝小分子、蛋白質(zhì)、多肽和它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息(相對(duì)誤差僅為0.01%～0.1%)。該技術(shù)對(duì)于癌癥的診斷具有一定價(jià)值[16]，也讓我們對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷燃起了希冀。而MALDI-TOF-MS也因其可在細(xì)胞層面識(shí)別分子與組織病理學(xué)特征，更具先進(jìn)性而成為比其他技術(shù)更好的工具，也讓代謝組學(xué)在非小細(xì)胞肺癌的早期診斷方面更具優(yōu)勢(shì)。

1.3.2 MALDI-TOF-MS技術(shù)的應(yīng)用及局限性：現(xiàn)在很多研究者關(guān)于組織或組織切片、完整細(xì)胞的蛋白全質(zhì)譜圖分析都直接采用快速便捷的MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)。一些研究者開始根據(jù)腫瘤細(xì)胞在發(fā)展過程中會(huì)產(chǎn)生與正常細(xì)胞不同的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物這一特性應(yīng)用于胃癌[17]、肺癌[18-19]、前列腺癌[20]等研究中，并在肺癌的早期診斷和篩查及病理分型中取得了一定的進(jìn)展。還有報(bào)道提出NSCLC血清中存在的4種差異表達(dá)蛋白(α1-AG、Tf、TTR、ITIH2)有望成為 NSCLC 新型血清診斷標(biāo)志物。劉曉晴教授的團(tuán)隊(duì)通過MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了NSCLC患者血清及尿液樣本中與健康人不同的多肽，并建立了靈敏度和特異度均高的診斷模型和病理分類模型，更為NSCLC的早期診斷和病理分型診斷提供了強(qiáng)力的補(bǔ)充和憑證。同時(shí)還有研究表明質(zhì)譜成像可以將NSCLC快速而準(zhǔn)確的分出亞型。也發(fā)現(xiàn)了可能的耐藥模型和預(yù)測(cè)分子，為實(shí)現(xiàn)肺癌個(gè)體化化療提供依據(jù)，助推精準(zhǔn)醫(yī)療。這都提示了該技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌的早期診斷方面未來可期，但是由于MALDI-TOF-MS技術(shù)是一項(xiàng)新興且具有一定局限性的技術(shù)，在研究結(jié)果的驗(yàn)證和解釋缺乏統(tǒng)一的實(shí)用性的操作手冊(cè)，目前在非小細(xì)胞肺癌的早期診斷的研究數(shù)量并不可觀。 目前MALDI-TOF-MS技術(shù)已批準(zhǔn)用于臨床微生物學(xué)以及制藥行業(yè)的常規(guī)使用中，取代了微生物學(xué)里傳統(tǒng)的生化測(cè)試，但尚未全面進(jìn)入臨床應(yīng)用中，尤其是非小細(xì)胞肺癌方面的研究，無論是從研究數(shù)量或者是研究結(jié)果的可靠性都不能達(dá)到100%。該技術(shù)目前的局限性有以下幾點(diǎn)：(1)MALDI-TOF-MS技術(shù)經(jīng)常出現(xiàn)所獲蛋白質(zhì)的峰值表達(dá)相近或重疊交錯(cuò)，增加了潛在腫瘤標(biāo)志物的分析鑒定難度。(2)MALDI-TOF-MS技術(shù)無法確定差異蛋白數(shù)量。(3)樣品的選擇會(huì)影響結(jié)果的有效性。(4)需要對(duì)樣本標(biāo)準(zhǔn)化處理，以確保高度可重復(fù)的分析。(5)由于樣品的極端異質(zhì)性及其動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)含量，需對(duì)樣品預(yù)處理來進(jìn)行全面分析。(6)該技術(shù)本身的分析特性具有相對(duì)較低的重現(xiàn)性和分離度。

2 代謝組學(xué)在非小細(xì)胞肺癌早期診斷的應(yīng)用

目前代謝組學(xué)在腫瘤診斷方面的研究主要還是集中在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等方面，更具說服力的就是Odunsi團(tuán)隊(duì)因當(dāng)前可用的血清生物標(biāo)記物不足以可靠地區(qū)分上皮性卵巢癌(EOC)患者和健康個(gè)體。該團(tuán)隊(duì)利用1H-NMR光譜分析從38例EOC患者、12例卵巢良性腫瘤患者(術(shù)前血清)及53例健康女性的血清樣本進(jìn)行了分析研究，發(fā)現(xiàn)能100%識(shí)別正常絕經(jīng)前婦女、卵巢良性腫瘤和卵巢上皮性癌，對(duì)絕經(jīng)后婦女和卵巢癌的識(shí)別率也高達(dá)97.4%和97%。然而即使在研究較多的婦科腫瘤方面，也離真正建立完整的診斷模型以及實(shí)現(xiàn)診斷系統(tǒng)化有著不小的距離。雖然研究者們已經(jīng)獲得了大量能反映機(jī)體病理變化的生物代謝物，但是這些潛在的腫瘤標(biāo)志物之間并沒有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，而且缺乏交叉驗(yàn)證，雖然血液、尿液、唾液等發(fā)現(xiàn)了越來越多的潛在生物標(biāo)志物，但目前仍處于基礎(chǔ)研究中。在NSCLC細(xì)胞中持續(xù)特異高表達(dá)的生物標(biāo)志物(癌胚抗原等)在臨床實(shí)踐中成為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，但這些標(biāo)志物雖能輔助診斷非小細(xì)胞肺癌，但陽性率和敏感度較弱。故而特別期望能多角度尋找特異性、靈敏度均高的NSCLC早期診斷標(biāo)志物。

NSCLC的早期診斷及病理分型最開始還是從蛋白質(zhì)組學(xué)方向出發(fā)研究。楊洋等研究者應(yīng)用SELDI-TOF-MS結(jié)合SVM對(duì)NSCLC患者和對(duì)照組(兩組分別為112、123)進(jìn)行血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜的研究分析，篩選出3個(gè)差異性顯著的蛋白標(biāo)記物(載脂蛋白C-Ⅰ觸珠蛋白α1鏈和S100A4蛋白)，發(fā)現(xiàn)了這3種差異蛋白的協(xié)同應(yīng)用有利于NSCLC的早期檢測(cè)和診斷。隨后有研究報(bào)道指出碳酸酐酶1可成為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷血清標(biāo)志物。他們采用二維凝膠電泳(2DE)聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)分別提取了肺癌組、良性對(duì)照組、健康組(三組分別為11、12和10)的血清蛋白,得到12種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并利用ELISA和蛋白質(zhì)印跡在擴(kuò)大樣本量中(三組分別為22、18和18)驗(yàn)證了所得蛋白，其中碳酸酐酶1(CA1)的表達(dá)在肺癌組明顯升高。Klupczynska團(tuán)隊(duì)利用ZipTip技術(shù)聯(lián)合MALDI-TOF-MS對(duì)癌癥患者(n=153)和對(duì)照組(n=63)的血清樣本分析研究發(fā)現(xiàn)C3和纖維蛋白原α鏈的片段具有顯著差異，該組研究不僅找到了蛋白標(biāo)志物，而且進(jìn)行了驗(yàn)證，步驟更加嚴(yán)謹(jǐn)。有學(xué)者在300例肺部良性病變患者和NSCLC患者之間觀察到疾病特異性觸珠蛋白-β，該蛋白的糖基化可以將NSCLC與BLD區(qū)別開來。還有研究團(tuán)隊(duì)甚至通過MALDI-TOF MS對(duì)50例參加厄洛替尼和索拉非尼Ⅱ期試驗(yàn)的NCSLC患者進(jìn)行了血清肽譜分析。在所有出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)的患者的血清中檢測(cè)到兩種特異性肽，為助推精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新思路，但是樣本量偏小，代表性不高。后續(xù)隨著研究技術(shù)的不斷更新，大家開始將目光放在了能夠更好地反映細(xì)胞究竟發(fā)生了什么的代謝組學(xué)上。Zhang的研究團(tuán)隊(duì)想評(píng)估腫瘤發(fā)展過程中的血清代謝物變化，選取了25例Ⅰ期肺癌患者和相匹配的健康對(duì)照組，用1H-NMR聯(lián)合RRLC確定了25個(gè)能高靈敏度區(qū)分兩組的代謝產(chǎn)物，提示了早期肺癌確實(shí)可用代謝組學(xué)來分析探究。還有研究團(tuán)隊(duì)采用高靈敏度、高分辨率的UPLC-Q-TOF檢測(cè)健康人(對(duì)照組)和肺癌患者(病例組)尿液中微量分子代謝物，成功發(fā)現(xiàn)11個(gè)常見的代謝標(biāo)志物可以用來描述肺癌的病譜特征，其中4例具有診斷肺癌的潛力[曲線下面積(AUC)>0.8]。隨著技術(shù)不斷發(fā)展，Miyamots利用GC-MS分析研究了NSCLC和其他肺癌患者的血清樣本，賴氨酸、色氨酸和組氨酸的濃度在NSCLC明顯降低，而乙醇胺、甘油、麥芽糖、乳酸、谷氨酸和棕櫚酸的濃度中明顯升高。這些代物都有顯著差異，有可能具有NSCLC的早期診斷意義。而Leonor等使用1H-NMR對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者在疾病不同階段的血清代謝譜研究，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比非小細(xì)胞肺癌的代謝譜里有18種代謝物的濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化。這無疑為尋找非小細(xì)胞肺癌的早期診斷生物標(biāo)志物提供了強(qiáng)力的補(bǔ)充證據(jù)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有17種可反映NSCLC患者不同疾病發(fā)展階段的代謝物，為NSCLC患者的早期發(fā)現(xiàn)、與健康個(gè)體的鑒別以及了解疾病各階段的病理生理機(jī)制提供助力，單單通過傳統(tǒng)的血液指標(biāo)可無法做到區(qū)分NSCLC的發(fā)展階段。Mu等使用偽靶向GC-MS研究了136例非吸煙女性受試者(65例NSCLC患者，6例良性肺腫瘤患者和65例健康對(duì)照)的代謝譜，發(fā)現(xiàn)代謝譜出現(xiàn)了能量代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝紊亂，氧化應(yīng)激等變化。該研究為NSCLC的診斷提供了半胱氨酸、絲氨酸和1-單油酰甘油作為生物標(biāo)記物。還有研究團(tuán)隊(duì)利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)156例Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者和60例健康對(duì)照者的血漿樣本研究發(fā)現(xiàn)β-羥基丁酸，檸檬酸和富馬酸顯著不同。Ruiying研究團(tuán)隊(duì)對(duì)142例NSCLC患者和159例對(duì)照組患者進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析并發(fā)現(xiàn)了6種代謝物可作為潛在生物標(biāo)志物用于NSCLC。該結(jié)果也通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的1 027例NSCLC患者和108個(gè)癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。還有研究提示含膽堿的磷脂可能是早期NSCLC的標(biāo)志物。磷脂組的進(jìn)一步研究對(duì)于更好地描述肺癌患者體內(nèi)代謝物組成的變化至關(guān)重要。有研究證明使用UPLC-MS分析 99例NSCLC患者和112例對(duì)照者的血漿樣本發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇，可的松可作為早期診斷標(biāo)志物，且同時(shí)具備高敏感性和特異性，還觀察到特定血漿代謝物與NSCLC的病理類型或分期之間存在顯著關(guān)聯(lián)。這都表明代謝組學(xué)確實(shí)擁有無限潛力。

當(dāng)然，非小細(xì)胞肺癌等方面的研究也在逐步開展，但由于之前所提的諸多限制如技術(shù)分析問題以及現(xiàn)在的研究數(shù)量情況、驗(yàn)證方式的選擇和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，代謝組學(xué)在非小細(xì)胞肺癌的早期診斷研究仍無法進(jìn)入臨床應(yīng)用中。雖然說正向著臨床實(shí)用性方向發(fā)展，但還只是在初始階段，仍需要不斷拓展代謝組學(xué)在非小細(xì)胞肺癌應(yīng)用方面的廣度和深度。

3 展望

非小細(xì)胞肺癌的早期診斷目前仍是研究者們聚焦的方面，目前多組研究顯示非小細(xì)胞肺癌患者與健康人群的血清多肽存在差異，我們希望采用MALDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理手段，建立一種新的NSCLC早期診斷模式，從血清學(xué)角度發(fā)現(xiàn)早期非小細(xì)胞肺癌潛在生物標(biāo)志物，而MALDI-TOF-MS測(cè)定和鑒定不同類型和階段肺癌生物分子的能力已被肯定。但該技術(shù)所需費(fèi)用高，且仍需要大量數(shù)據(jù)來支持研究結(jié)果，包括研究質(zhì)量也需要提升，如果能夠增進(jìn)可靠的交叉驗(yàn)證方法就能更進(jìn)一步擴(kuò)展研究平臺(tái)。相信隨著MALDI-TOF-MS技術(shù)不斷應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌，會(huì)更加深刻、全面認(rèn)識(shí)發(fā)生機(jī)制、代謝網(wǎng)絡(luò)改變等方面，在早期診斷方面也一定會(huì)獲得長足進(jìn)步。