循環(huán)腫瘤細(xì)胞的鑒定分析方法研究現(xiàn)狀及進(jìn)展

馬 瑩 綜述，寧大為，于華杰，王振丹，李 勝，夏 梅，李 浩△ 審較

1.山東省藥物研究院，山東濟(jì)南 250062；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/山東省腫瘤防治研究院/山東省腫瘤醫(yī)院肝膽外科，山東濟(jì)南 250117；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南 250117；4.山東省濟(jì)南市章丘區(qū)人民醫(yī)院急診外科，山東濟(jì)南 250200

惡性腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是世界范圍內(nèi)惡性腫瘤患者病死率升高的重要原因[1-2]。近期研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)可能是惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因之一[3]，因CTC具有稀有性、異質(zhì)性等特點，對鑒定分析造成困難。針對以上問題，本文對CTC的鑒定分析方法及應(yīng)用現(xiàn)狀及進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CTC的生物學(xué)特性

CTC是指自發(fā)或因診療操作從原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤中脫落進(jìn)入外周血液循環(huán)的一類腫瘤細(xì)胞[3]。1869年ASWORTH[4]在轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤患者的外周靜脈血涂片中發(fā)現(xiàn)了大小、外觀與腫瘤細(xì)胞完全相同的細(xì)胞，首次提出了CTC的概念。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤患者中，進(jìn)入血液的大部分CTC短期內(nèi)被吞噬或發(fā)生凋亡，存活的CTC在血液中經(jīng)過一段時間的潛伏，侵入組織中形成可檢測到的病變[5-8]。極少數(shù)具有高活性和轉(zhuǎn)移性的CTC相互聚集，形成循環(huán)腫瘤微栓子(CTM)，從而具有更強(qiáng)的侵襲和抗吞噬能力[9]。CTC的稀有性和其本身的異質(zhì)性，對CTC的檢測提出了挑戰(zhàn)性。

2 CTC的檢測方法

由于外周血中CTC水平較低，其檢測過程可分為對外周靜脈血中CTC的分離富集和鑒定分析。富集是利用腫瘤細(xì)胞的生物、物理特性分離CTC與血細(xì)胞，以提高其檢測靈敏度，其中無需特殊標(biāo)志物的富集方法包括膜濾過分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)(ISET)、密度梯度離心技術(shù)和介電泳技術(shù)等[10]。依據(jù)生物親和原理的富集方法，還包括基于細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志物上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)和細(xì)胞角蛋白(CK)表達(dá)的免疫磁性陽性篩選法和陰性篩選法等[11]。但是因富集方法不同，富集后的CTC中?；祀s著白細(xì)胞、單核細(xì)胞，甚至循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，需要進(jìn)一步鑒別區(qū)分。CTC的鑒定分析是利用腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征或表面抗原、遺傳物質(zhì)等對CTC進(jìn)行區(qū)分和研究。

3 基于細(xì)胞病理學(xué)原理鑒定分析CTC

CTC從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，與原發(fā)腫瘤細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相似，與正常血細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有所差異。通過細(xì)胞化學(xué)染色方法，依據(jù)細(xì)胞病理學(xué)原理，由光鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)判定異常細(xì)胞。光鏡下判別的參考項目主要包括細(xì)胞或細(xì)胞核直徑、核質(zhì)比、細(xì)胞核性狀與染色情況等[12-13]。VONA等[14]利用ISET對外周血中摻入的腫瘤細(xì)胞株(HepG2、Hep3B、MCF-7、HeLa和LNCaP)進(jìn)行分離鑒別，在濾膜上觀察到了與所用腫瘤細(xì)胞株相似的細(xì)胞。LU等[15]使用8 μm孔徑濾膜對61例食管鱗狀細(xì)胞癌患者及22例健康志愿者的外周血進(jìn)行富集，依據(jù)細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對采集到的細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌患者CTC檢出率為32.8%(20/61)，而健康志愿者外周血中未發(fā)現(xiàn)CTC。

但HOFMAN等[16]利用ISET研究了良性腫瘤患者、惡性腫瘤患者和健康志愿者外周血中的CTC，依據(jù)細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)判別分離得到細(xì)胞的良惡性，發(fā)現(xiàn)具有惡性特征的細(xì)胞在良性腫瘤患者和惡性腫瘤患者中分別占5.3%和43.1%。而NANOU等[17]通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞株在使用孔徑為5 μm的濾膜過濾時，由于壓力、濾孔數(shù)目和分布密度等原因可能受到損傷，導(dǎo)致相應(yīng)的細(xì)胞表面特征丟失，甚至核的形狀發(fā)生改變，診斷出的假陽性結(jié)果使細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在CTC檢測中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。

4 基于分子特征鑒定分析CTC

4.1基于遺傳物質(zhì)鑒定分析CTC

4.1.1通過基因表達(dá)及突變鑒定分析CTC 熒光原位雜交 (FISH)能夠定位染色體上特殊DNA序列，或探測、定位RNA，可在基因組水平上檢測CTC中單個基因的變化[10]。ZHAO等[18]通過FISH技術(shù)將CTC分為3個亞組：上皮標(biāo)志物(CK、EpCAM)陽性，CD45-細(xì)胞(上皮性CTC)；上皮表型/間充質(zhì)標(biāo)記陽性，CD45-細(xì)胞(混合表型CTC)；間充質(zhì)標(biāo)志物(Twist、Vimentin)陽性，CD45-細(xì)胞(間質(zhì)性CTC)。有學(xué)者對具有特殊分子改變的腫瘤患者進(jìn)行了研究，PAILLER等[19]采用FISH技術(shù)檢測了39例以克唑替尼作為間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑治療ALK重排非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者，發(fā)現(xiàn)ALK拷貝數(shù)增加的CTC，CTC數(shù)量的變化可能是克唑替尼在ALK重排NSCLC患者療效的預(yù)測性生物標(biāo)志物。

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)可檢測血液標(biāo)本中是否存在CTC，用于PCR檢測的核酸片段主要來自于上皮或特異性表達(dá)組織，因此能夠降低白細(xì)胞對檢測結(jié)果的影響[20]。盡管RT-PCR檢測靈敏度高，但由于異常轉(zhuǎn)錄和假陽性，特異度可能較低，這限制了RT-PCR用于CTC的鑒定。

4.1.2通過染色體畸變鑒定分析CTC 人類染色體異常包括染色體數(shù)目畸變、結(jié)構(gòu)異常，幾乎所有腫瘤患者都出現(xiàn)染色體異常[21]。研究人員試圖通過鑒別染色體異常細(xì)胞從而區(qū)分CTC與其他細(xì)胞。XU等[22]分析發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者外周血中，三倍體(8號染色體)CTCs≥3組的1年生存率和總生存率比三倍體CTCs<3組短，三倍體CTC計數(shù)而不是總CTC計數(shù)可以作為化療敏感性的預(yù)測因子。研究還發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者血液中分離的CTC中多個染色體可能以多倍體形式存在，SWENNENHUIS等[23]用FISH探針標(biāo)記了前列腺癌的1號、7號、8號和17號染色體著絲粒區(qū)域，發(fā)現(xiàn)以上染色體均存在多倍體現(xiàn)象。KIM等[24]通過基于細(xì)胞大小的過濾平臺，采用FISH技術(shù)檢測外周血標(biāo)本中細(xì)胞染色體的異?？截悢?shù)，在肺癌患者和良性肺病患者外周血中均檢測到非整倍體細(xì)胞，這些發(fā)現(xiàn)揭示了在使用FISH進(jìn)行惡性腫瘤診斷時出現(xiàn)假陽性的可能性。

4.1.3通過測序技術(shù)鑒定分析CTC 測序技術(shù)通過堿基序列信息獲取特定基因組或該基因組中的目標(biāo)區(qū)域的堿基，是分析惡性腫瘤特定基因組畸變的有力工具[25]。與其他技術(shù)相比，可以發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致顯著的表型改變的微小遺傳突變，實現(xiàn)分析自動化，降低人工偏倚[26]。CAPPELLETTI等[27]通過下一代測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性腎癌患者外周血中CTC存在異質(zhì)性，部分CTC含有9p21.3缺失，證明CTC的分子特征能夠預(yù)測可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的亞克隆事件。LEE等[28]通過下一代測序技術(shù)，對婦科腫瘤患者無細(xì)胞循環(huán)DNA(cfDNA)和循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的變異進(jìn)行比較，認(rèn)為聯(lián)合檢測腫瘤患者cfDNA和CTC可提高液體活檢診斷惡性腫瘤的靈敏度，這有望為指導(dǎo)惡性腫瘤的臨床治療策略提供更好的遺傳靶點信息。測序技術(shù)也有幾個明顯的缺點，例如測序成本、通量、深度、靈敏度及標(biāo)本要求等方面的局限，使單細(xì)胞分析具有一定難度。

4.1.4通過微陣列技術(shù)鑒定分析CTC 基因表達(dá)譜和微陣列比較基因組雜交(aCGH)技術(shù)已被用來檢測CTC表達(dá)情況，基因表達(dá)譜能在RNA水平上提供有關(guān)標(biāo)本的信息，特別是可疑和新轉(zhuǎn)錄物的上/下調(diào)節(jié)，而aCGH能在DNA水平上提供有關(guān)標(biāo)本的信息，包括拷貝數(shù)變化、特定突變變體或全局基因組變化[29]。STEINERT等[30]通過aCGH、突變譜和微衛(wèi)星檢測技術(shù)(MSI)，證實了結(jié)直腸癌來源的單個CTC的腫瘤細(xì)胞特性，CTC的突變譜與相應(yīng)的腫瘤組織相似，但不完全相同，一些CTC在關(guān)鍵基因如KRAS或TP53上出現(xiàn)了在原發(fā)腫瘤灶中無法檢測到的突變。

4.2基于免疫學(xué)方法鑒定分析CTC 該類方法通過細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況，利用免疫組化或免疫熒光技術(shù)，研究不同標(biāo)志物在細(xì)胞表面的表達(dá)情況，如鑒別CTC和白細(xì)胞，對富集的CTC進(jìn)行定量、定性分析。強(qiáng)生開發(fā)的CellSearch系統(tǒng)采用的檢測方法曾經(jīng)是公認(rèn)比較可靠的方法，利用CK8/18/19、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、CD45標(biāo)志物組合對富集標(biāo)本進(jìn)行檢測，將CK8/18/19陽性、DAPI陽性、CD45陰性的細(xì)胞定義為上皮類型CTC[31]。LI等[32]通過對富集CTC進(jìn)行E-Cadherin、Vimentin和Twist的三聯(lián)免疫熒光染色，46例CTC陽性患者中有32例(69.6%)共表達(dá)Twist和Vimentin，與門靜脈癌栓、TNM分級及腫瘤大小密切相關(guān)。部分研究人員引入了腫瘤相關(guān)抗原來鑒定分析富集到的細(xì)胞。BERGMANN等[33]使用CellSearch系統(tǒng)對49例晚期潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的血液標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)16例CTC陽性患者中有10例(63%)表達(dá)PD-L1，患者體內(nèi)和不同患者間CTC的PD-L1表達(dá)具有異質(zhì)性，PD-L1表達(dá)的CTC與較差整體生存率相關(guān)。目前沒有特異性的標(biāo)志物可徹底區(qū)分CTC與其他細(xì)胞，不同類別的組織表達(dá)的標(biāo)志物可能不同，甚至相同類別的組織也可表達(dá)異質(zhì)的標(biāo)志物，腫瘤標(biāo)志物在某些情況下的表達(dá)會升高[34]。因此，通過免疫學(xué)方法檢測特定標(biāo)記物得到的結(jié)果不一定是CTC。

5 細(xì)胞病理學(xué)結(jié)合免疫學(xué)方法鑒定分析CTC

外周血中可能存在著數(shù)量稀少的單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞及因炎癥等因素進(jìn)入血液的內(nèi)皮細(xì)胞，甚至正常的上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞有時很難通過細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。例如有研究者在乳腺癌和黑色素瘤患者中發(fā)現(xiàn)一些非常大的非典型細(xì)胞(>30 μm)具有多葉核，但血小板標(biāo)記CD61的ICC染色證實了它們是巨核細(xì)胞[35]。因此，研究者在細(xì)胞化學(xué)染色與細(xì)胞病理學(xué)識別的基礎(chǔ)上，聯(lián)合了免疫組織化學(xué)法或免疫熒光法對結(jié)果進(jìn)行驗證[36-37]。常用的方法是對難以通過形態(tài)特征判別的異常細(xì)胞，通過上皮細(xì)胞相關(guān)抗原(EpCAM、CK等)和白細(xì)胞特異性抗原CD45進(jìn)行驗證。TSUTSUYAMA等[38]利用巴氏染色(Pap)法結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)法對CTC進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷，將CTC定義為CK陽性且具有惡性形態(tài)學(xué)特征的非典型細(xì)胞，單獨(dú)或結(jié)合Pap染色進(jìn)行CD34(內(nèi)皮細(xì)胞)、CD61(巨核細(xì)胞)、CD68(巨噬細(xì)胞)及CD45(白細(xì)胞)的ICC以供確認(rèn)。隨著科技手段的進(jìn)步，未來或許能夠?qū)⒓?xì)胞病理學(xué)鑒定方法與遺傳學(xué)鑒定方法聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步明確鑒定CTC結(jié)果。

6 其他檢測鑒定CTC的方法

惡性腫瘤在轉(zhuǎn)移過程中，除使惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液參與循環(huán)系統(tǒng)外，會有部分惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)入體液(尿液、胸腔積液等)，通過對該部分進(jìn)行檢測，可以為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供輔助診斷。尿液標(biāo)本CTC檢測未見相關(guān)報告，有研究選取10例肺癌患者胸腔積液標(biāo)本，利用糖酵解及單細(xì)胞測序技術(shù)檢測到存在惡性腫瘤細(xì)胞，建立了胸腔積液檢測CTC技術(shù)體系[39]。另有研究者選取50例肺腺癌患者，采集外周血、胸腔積液及腦脊液進(jìn)行檢測，探究糖代謝用于CTC檢測的可行性，發(fā)現(xiàn)己糖激酶-2(HK2)是檢測CTC的代謝功能相關(guān)標(biāo)記物，用于NSCLC可能在治療前確定患者的預(yù)后[40]。

7 展 望

美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)在《AJCC腫瘤分期手冊(第7.8版)》中強(qiáng)調(diào)了CTC作為腫瘤cM0(i+)的重要意義，證明CTC的鑒定分析可為乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等實體腫瘤的療效評價和預(yù)后評估提供實時監(jiān)測信息。但是目前大多數(shù)的鑒定方法區(qū)分的是具有某些分子特征特定細(xì)胞群，嚴(yán)格意義上并不能稱為CTC。組織病理學(xué)是腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合免疫學(xué)方法通過細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)初步識別富集細(xì)胞的良惡性，進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞表面抗原區(qū)分CTC、脫落上皮細(xì)胞和血液細(xì)胞，能夠最大程度降低檢測結(jié)果的假陽性和假陰性。對CTC形態(tài)學(xué)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化及深入研究，以及對CTC的形式分析有助于揭示CTC與循環(huán)中血細(xì)胞、免疫細(xì)胞的相互作用，闡明CTC免疫逃逸和轉(zhuǎn)移播散的機(jī)制，有利于推動CTC鑒定領(lǐng)域的極大發(fā)展。