王淑云,盧雅艷,李 佳
中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心耳鼻喉科,北京 100161
鼻咽癌是源于咽部上部區(qū)域的惡性腫瘤,全球每年約有10萬(wàn)例鼻咽癌確診病例,其中大部分病例發(fā)生在我國(guó),以及南亞、北非和北極地區(qū)[1-2]。鼻咽癌發(fā)病是多因素作用的結(jié)果,包括EB病毒感染、遺傳易感性、不健康的生活方式和環(huán)境危害(如吸煙和接觸灰塵污染)等[3-4]。盡管近年來(lái)對(duì)鼻咽癌的治療取得了較大進(jìn)步,然而大多數(shù)鼻咽癌患者因癥狀無(wú)特異性,往往被診斷時(shí)已至中晚期,已出現(xiàn)腫瘤侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[5]。因此,探索能夠診治鼻咽癌的有效生物標(biāo)志物對(duì)提高患者早期診斷率、改善患者預(yù)后意義重大。組蛋白去乙?;?HDAC)是一類細(xì)胞內(nèi)的金屬蛋白酶,具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的作用,可影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[6]。在雌激素受體(ER)陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系中沉默HDAC1會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[7]。HDAC1在卵巢癌患者的血清中明顯升高,建議將HDAC1作為診斷卵巢癌的血清生物標(biāo)志物[8]。HDAC7在生理和病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等[9]。目前,在肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤中觀察到HDAC1、HDAC7的異常表達(dá)[10]。然而,目前鮮有關(guān)于HDAC1、HDAC7在鼻咽癌患者中表達(dá)的研究報(bào)道。因此,本研究擬探討鼻咽癌患者癌組織中HDAC1、HDAC7表達(dá)水平及其與臨床、病理特征和預(yù)后的關(guān)系,以期為鼻咽癌的診治提供參考。
1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月本院收治的鼻咽癌患者102例為研究對(duì)象,其中男50例,女52例;年齡38~72歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病理檢查確診為鼻咽癌;(2)所有鼻咽癌患者在最初活檢時(shí)未接受過(guò)放療或化療;(3)臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床信息不完整;(2)隨訪失敗或死亡原因不明;(3)合并其他腫瘤;(4)合并嚴(yán)重心血管疾??;(5)妊娠期女性。對(duì)102例鼻咽癌患者均連續(xù)隨訪至2021年1月。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的鼻咽癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn),所有患者都具有明確的鼻咽癌組織學(xué)診斷依據(jù)。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)第8版鼻咽癌TNM分期系統(tǒng)(2017)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行分期?;颊呒凹覍倭私獗狙芯?,并簽署知情同意書(shū)。
1.2方法
1.2.1標(biāo)本采集 采集所有研究對(duì)象癌組織及癌旁組織,分別納入鼻咽癌組與癌旁組。
1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HDAC1、HDAC7表達(dá) 通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)鼻咽癌患者癌組織及癌旁組織中HDAC1、HDAC7的表達(dá)水平。石蠟切片脫蠟(10 min),乙醇脫水(濃度順序依次為100%、95%和75%),并用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。將組織與3%H2O2一起孵育(20 min,室溫)以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,蒸餾水洗滌(5 min)。將切片置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值為6)中進(jìn)行抗原修復(fù),95~100 ℃下加熱10 min,然后用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(5 min)。將切片在室溫下轉(zhuǎn)移到抗原中修復(fù)10 min,采用聚丁二酸丁二醇酯(3 min)洗滌。在室溫下與10%牛血清清蛋白孵育(20~30 min)后,將組織與50 μL小鼠抗人HDAC1、HDAC7抗體(1∶5 000、1∶2 000,Boster,中國(guó),批號(hào):652414、741659)在4 ℃下孵育過(guò)夜。用聚丁二酸丁二醇酯作為陰性對(duì)照,然后在37 ℃下復(fù)溫30 min,用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。每張切片用50 μL生物素偶聯(lián)的二抗在37 ℃下孵育30 min,然后用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(3 min)。將鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶加入切片,在37 ℃下孵育30 min,并用聚丁二酸丁二醇酯洗滌(4 min)。組織在室溫下用二氨基聯(lián)苯胺溶液染色,然后在控制染色時(shí)間的顯微鏡下觀察。隨后,用蒸餾水終止相應(yīng)的反應(yīng)。蘇木精用于復(fù)染,然后用蒸餾水洗滌切片。用稀鹽酸清洗染色切片表面,用自來(lái)水沖洗3 min。脫水后依次進(jìn)行二甲苯透明和中性膠封片,顯微鏡下觀察切片。
免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)醫(yī)師采用雙盲法確認(rèn)。HDAC1、HDAC7的表達(dá)產(chǎn)物定位在細(xì)胞質(zhì)中,鼻咽癌組織細(xì)胞HDAC1、HDAC7免疫組織化學(xué)法染色后細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)褐色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400),每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。從染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比兩個(gè)方面判定染色指數(shù)(SI)。染色強(qiáng)度:無(wú)明顯染色計(jì)0分,有淡黃色染色計(jì)1分,有棕黃色染色計(jì)2分,有棕褐色染色計(jì)3分;陽(yáng)性細(xì)胞百分比:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分,陽(yáng)性細(xì)胞占比<34%計(jì)1分,34%~<68%計(jì)2分,≥68%計(jì)3分。SI:SI=染色強(qiáng)度得分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分,SI≥5分為陽(yáng)性表達(dá),SI<5分為陰性表達(dá)。
1.2.3隨訪 術(shù)后每3個(gè)月通過(guò)電話和問(wèn)卷調(diào)查信對(duì)患者進(jìn)行隨訪。從最初的手術(shù)日期到死亡日期為總生存期。通過(guò)家庭報(bào)告確定患者的死亡,并通過(guò)查閱公共記錄進(jìn)行核實(shí)。所有患者出院后均隨訪3年或直至患者死亡。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析,HDAC1、HDAC7在組織中的表達(dá)采用例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用多因素Cox回歸模型探討影響鼻咽癌預(yù)后的相關(guān)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1癌旁組、鼻咽癌組中HDAC1、HDAC7表達(dá)情況比較 鼻咽癌組HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率高于癌旁組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。
2.2不同特征鼻咽癌患者的 HDAC1、HDAC7表達(dá)情況比較 不同性別、年齡鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率明顯高于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。
2.3鼻咽癌患者預(yù)后情況 102例鼻咽癌患者出院至隨訪結(jié)束,3年生存率為60.8%(62/102)。HDAC1陽(yáng)性和陰性患者3年總生存率分別為45.7%(32/70)和93.8%(30/32),而HDAC7陽(yáng)性和陰性患者3年總生存率分別為51.4%(38/74)和85.7%(24/28);HDAC1、HDAC7陽(yáng)性的鼻咽癌患者3年生存率均明顯低于HDAC1、HDAC7陰性的鼻咽癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表1 癌旁組、鼻咽癌組中HDAC1、HDAC7表達(dá)情況比較[n(%),n=102]
表2 HDAC1、HDAC7表達(dá)與鼻咽癌臨床、病理特征的關(guān)系[n(%)]
2.4影響鼻咽癌患者預(yù)后的單因素分析 腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者3年生存率明顯低于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。
2.5影響鼻咽癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、分化程度低、HDAC1陽(yáng)性、HDAC7陽(yáng)性是鼻咽癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。
表3 影響鼻咽癌患者預(yù)后的單因素分析[n(%)]
表4 影響鼻咽癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析
鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)耳鼻咽喉科最常見(jiàn)的惡性腫瘤,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其治療失敗的主要因素。早期預(yù)測(cè)鼻咽癌預(yù)后需要一種特異度及靈敏度高,且成本效益高的新型血清蛋白生物標(biāo)志物,以減少鼻咽癌治療失敗。由BRLF1編碼的Rta蛋白(一種轉(zhuǎn)錄激活因子)是EB病毒早期裂解的產(chǎn)物,是調(diào)節(jié)EB病毒感染從潛伏期到裂解階段變化的關(guān)鍵因素,因此被提出作為診斷鼻咽癌的分子生物標(biāo)志物。此外,微小RNA(miR)-10b和miR-34也是用于鼻咽癌診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在新型核酸標(biāo)志物。然而,這些標(biāo)志物不能用于預(yù)測(cè)鼻咽癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。
HDAC1、HDAC7在許多生理、病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,包括細(xì)胞分化、基因表達(dá)、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老、程序性細(xì)胞死亡和致癌過(guò)程。GUO等[11]的研究證實(shí)HDAC1、HDAC7參與致癌、血管生成、細(xì)胞增殖和侵襲過(guò)程,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。另外,ISHIKAWA等[12]也證實(shí)腫瘤的許多生理、病理過(guò)程與HDAC1、HDAC7相關(guān),如腫瘤的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、耐藥性等,并且HDAC1、HDAC7還參與癌基因激活和抑癌基因失活。另有研究已在各種腫瘤中檢測(cè)到HDAC1、HDAC7的異常表達(dá),包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和食管癌[13]。既往研究表明,HDAC1、HDAC7的表達(dá)升高可抑制細(xì)胞凋亡,與星形細(xì)胞瘤患者預(yù)后不良關(guān)系密切[14]。HDAC1、HDAC7陽(yáng)性表達(dá)與ER/孕激素受體表達(dá)呈負(fù)相關(guān),可預(yù)測(cè)浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌的不良預(yù)后[15]。本研究結(jié)果顯示,鼻咽癌組HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率高于癌旁組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者HDAC1、HDAC7陽(yáng)性率明顯高于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明HDAC1、HDAC7與鼻咽癌臨床、病理特征有關(guān)。
HDAC1、HDAC7是反映癌癥發(fā)生和某些癌癥侵襲性的生物標(biāo)志物。據(jù)報(bào)道,與正常大腸黏膜組織相比,大腸腺癌組織中HDAC1、HDAC7過(guò)度表達(dá),HDAC1、HDAC7在上皮和固有層中均被發(fā)現(xiàn),HDAC1、HDAC7也被證實(shí)與大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[16]。在機(jī)制方面,HDAC1、HDAC7可以增加抗凋亡Bcl-xl和Bcl-2的表達(dá)豐度,并降低促凋亡Bax蛋白水平[17]。HDAC1、HDAC7還被證明在多種惡性腫瘤中高表達(dá),可能作為預(yù)后不良的標(biāo)志物,靶向降低HDAC1、HDAC7表達(dá)水平可能是腫瘤的一種治療方法[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn),HDAC1、HDAC7陽(yáng)性的鼻咽癌患者3年生存率均明顯降低(P<0.05)。且鼻咽癌患者預(yù)后的單因素分析發(fā)現(xiàn),腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、浸潤(rùn)深度為深肌層、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者3年生存率明顯低于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、浸潤(rùn)深度為黏膜層及肌層、分化程度為高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HDAC1、HDAC7陽(yáng)性是鼻咽癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。臨床研究表明,HDAC1、HDAC7結(jié)合癌胚抗原和糖類抗原19-9可用于結(jié)直腸癌早期診斷[20],本研究未探討HDAC1、HDAC7對(duì)鼻咽癌的診斷效能,這將在后續(xù)研究中進(jìn)行。
綜上所述,鼻咽癌患者癌組織中HDAC1、HDAC7高表達(dá),其與臨床、病理特征有關(guān),HDAC1、HDAC7陽(yáng)性是鼻咽癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2022年21期