GAGE基因在惡性腫瘤中的研究進展

張靜，奎翔，楊解順，歐志燕，王燕

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科，昆明 650000)

癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA/CT)是一類具有特異性表達模式的腫瘤相關抗原，GAGE基因家族是CTA家族的重要子成員，在正常組織中表達受限，僅在正常睪丸和腫瘤組織中表達[1]。GAGE全長650 bp，含有一個開放閱讀框，編碼138個氨基酸組成的蛋白質。Van den Eynde等[2]運用細胞毒性T淋巴細胞篩選法進行研究發(fā)現(xiàn)，GAGE序列與報道數(shù)據庫中的任何基因均沒有明顯同源性，故將其命名為GAGE。GAGE基因家族由至少8個編碼高度同源性蛋白質的基因組成，根據不同特征分為GAGE-1、GAGE-2和GAGE-8、GAGE3-7三組，其中GAGE-1最獨特，其有一個在其他GAGE基因中被中斷的外顯子編碼的C端；而其余GAGE成員(即GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-7)存在98%以上的同源性，基于GAGE-3、GAGE-7中存在一個潛在的磷酸化酪氨酸(Y9)，故分為GAGE-2、GAGE-8和GAGE-3、GAGE-7兩組[3]。GAGE-1、GAGE-2和GAGE-8編碼抗原肽YRPRPRRY，由人類黑色素瘤的人類白細胞抗原-CW6分子呈遞，GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6和GAGE-7B編碼抗原肽YYWPRPRRY，由人類白細胞抗原-A29分子呈遞[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，與GAGE家族高度相關的腫瘤抗原在多種腫瘤中表達。近年研究分別針對肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌等進行探討，檢測惡性腫瘤組織中GAGE的表達，發(fā)現(xiàn)GAGE的表達與惡性腫瘤的生長、轉移、侵襲及預后等相關[5-10]。現(xiàn)對GAGE基因在惡性腫瘤中的研究進展予以綜述。

1 GAGE概述

GAGE是一種酸性小蛋白，含有117個氨基酸(分子量為12 900)[11]。GAGE基因家族是X染色體連鎖基因，位于X染色體p21～q13[4]。既往研究認為，GAGE中存在使細胞對γ干擾素或Fas介導的細胞凋亡產生抗性的成員，可使細胞在Fas誘導的殺傷中存活下來。GAGE的抗凋亡活性位于胱天蛋白酶8激活的下游以及Fas途徑中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶裂解的上游。在某些腫瘤中，細胞凋亡在抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著至關重要的作用，因此抗凋亡基因的過度表達與腫瘤的發(fā)生有關。另有研究發(fā)現(xiàn)，GAGE可使細胞對化療治療劑、紫杉醇和γ射線產生抗性[12]。Chen等[13]研究揭示，Vault RNA可誘導癌基因GAGE家族中的GAGE-6基因，部分誘導人腫瘤細胞MCF-7耐藥，Vault RNA宿主非編碼小RNA的同源序列Vault RNA1-1與多聚嘧啶序列結合蛋白相關剪接因子直接結合，導致DNA結合域釋放多聚嘧啶序列結合蛋白相關剪接因子靶基因(如GAGE-6)，并允許GAGE-6轉錄，從而誘導并促進細胞增殖和集落形成，產生耐藥性。上述表觀遺傳調控機制可能為對抗化療耐藥提供新的治療靶點。另有研究證實，GAGE與惡性腫瘤的轉移和侵襲也有一定相關性[14]。

2 GAGE與惡性腫瘤

2.1GAGE與肝癌 2020年全球癌癥數(shù)據統(tǒng)計顯示，原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是全球第六大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[15]，5年死亡率居所有腫瘤第3位，且近年40歲以下的發(fā)病率逐年升高[16]。外科手術是治療肝癌的有效手段，但大部分患者預后較差，通常僅少于1/5的腫瘤呈局限性，可通過手術(切除和肝移植)治愈[17]。因此，尋找早期發(fā)現(xiàn)和評價肝癌的新的標志物有重要意義。

多種GAGE家族基因在肝細胞癌中表達。早在1999年，Schlott等[18]利用穿刺活檢獲得肝癌組織并提取細胞RNA，通過凝膠電泳和cDNA測序發(fā)現(xiàn)，60%的肝癌標本中檢出GAGE-1、GAGE-2的RNA，僅在GAGE-1、GAGE-2表達缺失肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)了MDM2基因的突變，提示肝癌中完整MDM2蛋白的合成與GAGE-1、GAGE-2基因表達上調有關。此外，MDM2蛋白的C端環(huán)區(qū)還參與了細胞周期素A基因的抑制，該基因控制著細胞周期蛋白從G1期向S期的轉變，MDM2點突變可導致Arg轉變?yōu)镾er或鋅指結構的丟失。用鋅指結構缺失的MDM2 RNA轉染細胞時，可在轉染細胞中觀察到高水平的細胞周期蛋白A[19]。Riener等[20]研究發(fā)現(xiàn)，94%的肝癌樣本呈GAGE陽性，且GAGE陽性與CD4+T細胞數(shù)量呈正相關，但與CD8+T細胞數(shù)量無關，表明GAGE蛋白表達與肝癌患者總生存率降低有關。農彩蓮等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GAGE-1基因在QGY-7701肝癌細胞株中呈陽性表達，而在正常肝組織中不表達，證明GAGE基因在肝癌診斷中有一定價值。Chao等[22]應用免疫組織化學技術檢測到肝細胞癌組織中GAGE-1蛋白的表達，且癌組織中GAGE-1蛋白表達水平顯著高于癌旁組織；且酶聯(lián)免疫吸附試驗結果顯示，肝細胞癌、肝硬化、乙型肝炎患者以及健康人血清中均存在抗GAGE-1抗體陽性反應，表明GAGE-1蛋白具有中等的癌癥限制性表達模式和免疫原性，這為GAGE-1在免疫治療和肝細胞癌診斷中的應用奠定了基礎。Shi等[23]通過多因素Cox回歸分析篩選出細胞因子信號轉導抑制因子2、GAS2L3、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白5、GAGE-2A等6個基因組成的預后基因特征，其中GAGE-2A是危險預后基因，在肝細胞癌預后預測方面，細胞因子信號轉導抑制因子2是唯一的保護性基因標志物，而GAGE-2A等5個基因的改變與總生存期和無病生存期密切相關。但是，GAGE能否成為肝細胞癌早期診斷標志物和免疫治療靶點還需要深入研究，以提高早期診斷指標的價值，從而更好地研制有效的靶向藥物并加強免疫治療效果。

2.2GAGE與胃癌 胃癌是全球第四大常見的癌癥死亡原因，2020年癌癥數(shù)據顯示，約77萬人因胃癌死亡[15]。目前最有效的胃癌治療手段仍是外科手術治療，但由于腫瘤的轉移和擴散，術后患者病死率仍很高。Lee等[24]建立了實驗性小鼠胃癌自發(fā)轉移至多器官的模型，其卵巢種植表現(xiàn)出典型的Krukenberg瘤特征，并在卵巢轉移的胃癌細胞中發(fā)現(xiàn)了35個差異表達基因，同時分析信使RNA發(fā)現(xiàn)，GAGE-12家族(GAGE-12J、GAGE-12B、GAGE-12I和GAGE-12G)的平均表達量超過5倍，且GAGE-12家族基因是胃癌細胞卵巢轉移的最重要差異表達基因，而敲除GAGE-12基因不僅影響該基因轉錄，還可抑制腫瘤轉移、體外腫瘤細胞球的形成和體內腫瘤的生長。由此推測，GAGE-12基因通過調控胃癌轉移相關基因的表達影響胃癌的生長和轉移。

Shi等[25]應用基因芯片和反轉錄定量聚合酶鏈反應技術檢測有無淋巴結轉移的胃癌組織中的差異表達基因，揭示了GAGE-7B在體內對胃癌轉移、生長和血管生成的影響，通過免疫組織化學法檢測GAGE-7B蛋白表達，基因芯片、反轉錄定量聚合酶鏈反應和Western blotting等方法檢測GAGE-7B下游靶基因，結果顯示，淋巴結轉移灶GAGE-7B表達水平明顯明顯高于原發(fā)灶，且低分化胃癌細胞系中GAGE-7B的表達水平高于高分化胃癌細胞系，推測GAGE-7B高水平表達與臨床分期較晚以及患者生存期較短有關。在Transwell體外實驗中，GAGE-7B過表達細胞系的遷移和侵襲能力增強，提示GAGE-7B顯著增強了胃癌的轉移、生長和血管生成能力。

為了揭示GAGE介導胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制而進行的實驗顯示，GAGE-7B誘導的p38δ/p-促分裂原活化的蛋白激酶激活的蛋白激酶2/p-熱激蛋白27受微RNA(mircoRNA，miRNA/miR)-30c負調控，抑制了GAGE-7B和p38δ的表達，從而使p38δ/p-促分裂原活化的蛋白激酶激活的蛋白激酶2/p-熱激蛋白27通路被miR-30c滅活，推測GAGE-7B信使RNA是p38δ的競爭性內源性RNA，含有miR-30c結合位點的GAGE-7B-3′非編碼區(qū)可誘導胃癌細胞表達p38δ，并上調p38δ/p-促分裂原活化的蛋白激酶激活的蛋白激酶2/p-熱激蛋白27通路，顯著促進胃癌的轉移、增殖和血管形成[25]。在關于胃腸道間質瘤的研究中，Ghadban等[26]采用免疫組織化學方法對51例胃腸道間質瘤中的CT10/黑色素瘤抗原(melanoma antigen，MAGE)-C2和GAGE進行分析，結果顯示，與侵襲性較低的腫瘤相比，高級別胃腸道間質瘤表達GAGE和CT10/MAGE-C2的概率更高，且表達GAGE或CT10/MAGE-C2的患者均存在中高度復發(fā)風險，通過比較臨床病理參數(shù)發(fā)現(xiàn)，GAGE的表達與核分裂象和腫瘤大小有關，但與腫瘤的位置無關。綜上所述，GAGE基因的表達與胃腫瘤的轉移、惡變有重要關系。

2.3GAGE與乳腺癌 乳腺癌居全球癌癥死亡率的第5位，2020年乳腺癌發(fā)病率居全球第1位，全球女性新發(fā)乳腺癌約226萬例，遠超女性其他癌癥，全球女性乳腺癌死亡人數(shù)居癌癥致死的第1位[15]。隨著生活方式的現(xiàn)代化、生育模式的改變、社會經濟水平的提高，乳腺癌發(fā)病率逐年明顯升高。乳腺癌預后和治療受到腫瘤大小、分級以及孕酮受體表達水平等臨床病理因素的影響，尋找有預測價值的分子診斷標志物和有針對性的治療方法是提高乳腺癌的早期診斷和生存率的重要方法。Vodolazhsky等[27]檢測女性乳腺癌組織(不區(qū)分有無轉移)GAGE-1、GAGE-3、GAGE-4的相對表達量，結果顯示，乳腺癌組織GAGE-3基因的轉錄活性明顯升高，且無區(qū)域轉移的乳腺癌組織中GAGE-3表達是正常乳腺組織的5倍。Voels等[28]在研究金屬硫蛋白(metallothionein，MT)3獨特的C端和N端序列對MCF-7細胞表型特性和基因表達譜的影響時發(fā)現(xiàn)，MT3基因在大多數(shù)乳腺導管癌中過表達，且穩(wěn)定轉染MT3基因的MCF-7細胞出現(xiàn)生長抑制，在沒有N端序列的情況下，MT3的C端序列誘導了MCF-7細胞的圓頂形成，體現(xiàn)了細胞的抗腫瘤能力；配對結果表明，GAGE基因家族的表達與MCF-7細胞形成圓頂?shù)哪芰τ泻軓姷南嚓P性，同時C端結構域可誘導GAGE基因的表達，而N端結構域抑制了GAGE基因的表達，且N端結構域的抑制作用強于MT3的C端結構域，MT3和MT對GAGE基因表達的不同影響提示其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中有獨特作用。采用免疫組織化學方法對454例浸潤性導管癌(包括225例雌激素受體/孕激素受體/人類表皮生長因子受體2陰性乳腺癌)中8種CT抗原(MAGEA、CT7、NY-ESO-1、CT10、CT45、GAGE、SAGE1和Nxf2)表達進行檢測的研究顯示，雌激素受體陰性乳腺癌中上述8種CT抗原的表達率均顯著高于雌激素受體陽性乳腺癌[29]。在乳腺癌中，GAGE等CTA的表達水平顯著上調，提示其參與了細胞增殖和細胞凋亡，且增殖細胞核抗原的升高可促進細胞增殖[8]。綜上，GAGE有望在乳腺癌早期聯(lián)合診斷和靶向治療中發(fā)揮重要作用。

2.4GAGE與黑色素瘤 黑色素瘤是起源于黑色素細胞的惡性腫瘤，可發(fā)生于任何有黑色素細胞的器官，皮膚是黑色素瘤最常見的發(fā)生部位。2018年全球新發(fā)黑色素瘤病例近29萬，約6.1萬例黑色素瘤患者死亡[30]。黑色素瘤侵襲性強，早期易發(fā)生淋巴結及血行轉移，臨床預后差，常規(guī)治療(外科手術治療和化療等)效果并不理想。近年發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤對多種免疫治療方法有反應，且免疫療法有了很大的突破，黑色素瘤細胞表達的抗原可以被免疫系統(tǒng)識別，進而誘導對瘤細胞的免疫反應。Bazhin等[31]通過制備針對GAGE家族蛋白的多克隆、單克隆抗體，研究GAGE家族蛋白在黑色素瘤細胞系和腫瘤標本中的表達，對17個黑色素瘤細胞系進行Western blotting分析，結果顯示，其中10個細胞系中存在GAGE蛋白，而正常黑色素細胞和角質形成細胞系HaCat中無GAGE家族蛋白的表達。單獨使用去甲基化藥物以及去甲基化藥物和組蛋白脫乙酰酶抑制劑聯(lián)合使用均可刺激GAGE家族蛋白的表達。Danilova等[32]比較22個黑色素瘤和27個軟組織骨肉瘤細胞系中主要CTA家族基因的表達，結果顯示，95.9%(47/49)的細胞系顯示CTA基因活性，包括GAGE、NY-ESO1、MAGEA1、PRAME基因表達的發(fā)生率有顯著差異，黑色素瘤細胞系中GAGE、NY-ESO1、MAGEA1、PASD1、PRAME的表達水平顯著高于軟組織骨肉瘤細胞系，且黑色素瘤細胞中存在GAGE、SLLP1的基因共表達，骨肉瘤細胞中存在GAGE和NY-ESO1的基因共表達，提示GAGE基因共表達可能與其在腫瘤侵襲和轉移過程中的作用有關，在前瞻性臨床試驗中，CTA的表達模式應作為反應生物標志物進行評估。綜上，黑色素瘤中GAGE存在差異性表達，其成為免疫療法靶標的可能性較大，但相同類型腫瘤患者的CTA表達水平可能存在很大差異，故還需進一步研究。

2.5GAGE與肺癌 目前，肺癌仍是全球癌癥死亡的主要原因，2020年肺癌致死人數(shù)仍較多，約占所有癌癥死亡人數(shù)的18%[15]。過去40年中，大多數(shù)國家的男性肺癌發(fā)病率下降，但女性肺癌發(fā)病率卻持續(xù)上升[30]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的85%，肺腺癌是最常見的NSCLC組織學類型，約占所有肺癌相關死亡的40%[33]。對肺癌中CTA表達的研究主要集中在XAGE、MAGE、GAGE、NY-ESO1等家族，其表達率為10%～60%[34]。Ko等[35]研究CD133和癌癥抗原(GAGE、MAGE-6、SSX等)在NSCLC細胞系中的表達，經過去甲基化試劑處理后，CD133表達消失，但處理前后均未檢測到GAGE(1，2，8，b3-7)的表達，說明GAGE的表達與CD133的表達無關，提示GAGE表達的機制可能并不是去甲基化。Zhang等[36]利用環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)芯片篩選circRNA表達譜的差異發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常組織相比，NSCLC樣本中circ_0016760表達水平最高。Li等[37]采用定量反轉錄聚合酶鏈反應進行研究發(fā)現(xiàn)，circ_0016760在NSCLC組織和細胞中表達上調，而miR-1287負向調節(jié)GAGE-1的表達，circ_0016760作為miR-1287的競爭性內源性RNA促進靶基因GAGE-1的表達，通過海綿化miR-1287上調GAGE-1表達，從而促進NSCLC細胞的增殖和侵襲。Gjerstorff等[38]采用免疫組織化學方法檢測NSCLC組織和正常肺組織中GAGE、NY-ESO1、SP17的表達，結果顯示，GAGE、NY-ESO1和SP17的表達與特定組織類型(腺癌和鱗狀細胞癌)無明顯相關性，但鱗狀細胞癌中GAGE、NY-ESO1和SP17高水平表達的占比更高，GAGE在Ⅱ～Ⅲa期NSCLC中的表達頻率顯著高于Ⅰ期，但未發(fā)現(xiàn)GAGE與生存終點的相關性，NSCLC中GAGE的表達頻率與MAGE-A3相似，目前MAGE-A3已作為疫苗靶點在NSCLC中進行測試，提示GAGE有潛力成為NSCLC免疫治療的候選靶點和多抗原聯(lián)合的疫苗，在腫瘤的免疫靶向治療中有巨大潛力。Du等[39]針對p53、PGP9.5、SOX2、GAGE-7、GBU4-5、MAGEA1和CAGE 7種腫瘤相關抗原檢測腫瘤相關自身抗體水平，結果顯示，腫瘤相關自身抗體能區(qū)分良惡性肺部病變和無肺部結節(jié)肺疾病，靈敏度為56.53%，特異度為91.60%，且其結合CT檢查診斷的特異度可提高至95.80%，表明腫瘤相關自身抗體可用于基于血清的肺癌診斷工具的開發(fā)，特別是與CT聯(lián)合應用，可為肺癌的篩查和早期診斷提供更具臨床價值的檢測方法。

2.6GAGE與其他惡性腫瘤 除上述腫瘤外，目前對GAGE在其他惡性腫瘤(如食管癌、宮頸癌、喉癌、甲狀腺癌)中的表達和作用也有研究。G?tte等[40]評估了晚期糖基化終末產物受體和GAGE家族抗原作為頭頸部腫瘤免疫治療靶標的可能性，GAGE在來源于喉和咽的10個正常黏膜標本中的表達均為陰性，但其在腫瘤樣本中的表達均為陽性。Figueiredo等[41]發(fā)現(xiàn)，喉鱗狀細胞癌中CTA的表達率很高，且與臨床分期有關，包括GAGE在內的CTA可能是有價值的喉腫瘤疫苗靶標，特別是對于預后較差的腫瘤。Chang等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，GAGE基因可能參與宮頸上皮內瘤變向宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，故可能是子宮頸癌的治療靶點。Melo等[43]利用免疫組織化學方法檢測了包括GAGE家族的CTA在正常甲狀腺、甲狀腺腫、甲狀腺癌中的表達，發(fā)現(xiàn)CTA在正常甲狀腺和甲狀腺腫中不表達，而乳頭狀癌和濾泡狀癌中GAGE的陽性表達率為10.8%，髓樣癌中GAGE陽性表達率為92.9%，低分化癌和未分化癌中GAGE陽性表達率為66.7%，且GAGE的表達與性別顯著相關，可見GAGE等抗原在甲狀腺癌中明顯表達，表明該抗原具有作為甲狀腺癌生物標志物的潛力。Iura等[44]采用免疫組織化學實驗檢測GAGE-7在子宮平滑肌肉瘤和非子宮平滑肌肉瘤中蛋白表達情況并比較其表達譜，發(fā)現(xiàn)GAGE-7在子宮平滑肌肉瘤中的陽性表達率明顯高于非子宮平滑肌肉瘤，推測GAGE-7可能是潛在的子宮平滑肌肉瘤免疫治療靶點。

3 小 結

GAGE基因在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用不容忽視，與惡性腫瘤增殖、浸潤、轉移的關系密不可分，有望成為腫瘤早期診斷和預后評估的分子標志物，也是臨床靶向治療的重要方向。進一步研究GAGE基因抗腫瘤藥物的機制對提高個體化免疫靶向治療的有效性有重要意義。目前，不同組織來源的腫瘤中GAGE子成員的表達和程度有所差異，而其在惡性腫瘤中的高表達趨勢是一致的，但具體作用機制和分子通路還需深入研究。隨著未來更多臨床研究和試驗的進展，GAGE基因有望在臨床診斷和治療中發(fā)揮更大的作用。