線粒體自噬信號(hào)通路在年齡相關(guān)性眼病中的研究進(jìn)展△

魏 苗 黃澤宇 李鵬飛 管懷進(jìn) 季 敏

線粒體自噬是一種通過特殊自噬-溶酶體降解途徑清除功能障礙和受損的線粒體的過程，其主要類型有泛素依賴性、非泛素依賴性以及脂質(zhì)介導(dǎo)的線粒體自噬。線粒體自噬能阻止活性氧(ROS)的產(chǎn)生，并抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如氧氣)的無效消耗，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生存[1]。目前，線粒體自噬在腫瘤、細(xì)胞衰老、代謝性疾病等眾多疾病研究中已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展[2-3]。

線粒體功能障礙伴隨著大量與年齡相關(guān)的病理?xiàng)l件，因此，研究線粒體與年齡相關(guān)性疾病的關(guān)系十分必要[4-5]。線粒體能量代謝受損與年齡相關(guān)性疾病具有共同的病理特征，包括線粒體DNA(mtDNA)突變率增加，電子傳遞鏈功能減弱，ROS水平升高，促凋亡因子釋放增強(qiáng)等[6]。既往大量研究表明，線粒體活性下降在年齡相關(guān)性疾病中起重要作用[7-8]。在衰老過程中，由于自噬的年齡依賴性衰退或自噬的嚴(yán)重缺陷，細(xì)胞和組織中功能失調(diào)的細(xì)胞器不斷積累，使機(jī)體能量失衡[9]。有研究報(bào)道，衰老小鼠心肌細(xì)胞、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞線粒體自噬通量下降。老年人體肌肉衛(wèi)星細(xì)胞和心肌細(xì)胞同樣顯示線粒體自噬清除減少[10]。在老年人肌肉中，線粒體自噬相關(guān)基因BCL2/腺病毒E1B蛋白相互作用蛋白3(BNIP3L)和細(xì)胞質(zhì)E3-泛素連接酶(Parkin)表達(dá)下調(diào)[11]。這些結(jié)果表明，線粒體自噬的缺陷與衰老和年齡相關(guān)性疾病密切相關(guān)。然而，線粒體自噬在年齡相關(guān)性眼病發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制尚未明確，本文將對(duì)近年來線粒體自噬調(diào)控途徑以及在年齡相關(guān)性眼病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 線粒體自噬調(diào)控途徑

1.1 泛素依賴性線粒體自噬第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)誘導(dǎo)的激酶1(PINK1)/Parkin信號(hào)軸是目前研究最為廣泛的線粒體自噬途徑。在正常生理情況下，PINK1和Parkin通過線粒體靶向序列持續(xù)靶向正常的線粒體[12]。在病理情況下，線粒體膜電位去極化阻止PINK1進(jìn)入內(nèi)膜，在線粒體外膜(OMM)大量聚集磷酸化泛素，促進(jìn)Parkin由胞漿向線粒體膜轉(zhuǎn)位，激活線粒體自噬[13]。泛素化標(biāo)記的OMM蛋白結(jié)合不同的LC3相互作用區(qū)(LIR)，包括泛素結(jié)合蛋白p62、視神經(jīng)蛋白(OPTN)、核點(diǎn)蛋白質(zhì)52(NDP52)，降解受損的線粒體[14]。此外，PINK1還通過產(chǎn)生磷酸化泛素(pUb)直接招募OPTN、NDP52等受體啟動(dòng)線粒體自噬[15-16]。這些線粒體自噬過程都是依賴Parkin的存在。

1.2 非泛素依賴性線粒體自噬BCL2相互作用蛋白3(BNIP3)和BNIP3L是與線粒體抗凋亡蛋白BCL2 BH3結(jié)構(gòu)域同源的蛋白質(zhì)，通過LIR基序與LC3家族蛋白相互作用[17]。BNIP3 LIR基序周圍的Ser17和Ser24位點(diǎn)磷酸化有助于其與LC3B結(jié)合[18]，BNIP3L在Ser34和Ser35位點(diǎn)的磷酸化也增強(qiáng)了其與LC3B的相互作用[19]，誘導(dǎo)線粒體自噬。除了與LC3B直接相互作用外，BNIP3還從以下三個(gè)途徑間接誘導(dǎo)線粒體自噬：(1)BNIP3與PINK1相互作用，促進(jìn)其在OMM上的積累，從而促進(jìn)PINK1/Parkin依賴的自噬[20]。(2)BNIP3通過誘導(dǎo)線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1(DRP1)易位，促進(jìn)線粒體裂解、Parkin募集，激活線粒體自噬。(3)泛素化BNIP3L作用于PINK1/Parkin的下游，將NBR1招募至線粒體，從而靶向線粒體降解。綜上所述，BNIP3誘導(dǎo)的線粒體自噬和PINK1/Parkin自噬之間可能存在協(xié)調(diào)作用[21]。

FUNDC1是OMM的自噬受體。正常情況下，F(xiàn)UNDC1分別被Src蛋白激酶和CK2蛋白激酶在Tyr18和Ser13上磷酸化，減少與LC3的相互作用。在缺氧或羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)處理時(shí)，線粒體磷酸酶(PGAM5)與FUNDC1的Ser13位點(diǎn)結(jié)合并去磷酸化，增強(qiáng)與LC3的相互作用，促進(jìn)線粒體自噬[22]。此外，F(xiàn)UNDC1在缺氧初期被MARCH5在Lys119處泛素化降解，剩余的FUNDC1在長(zhǎng)時(shí)間缺氧條件下參與線粒體自噬[4]。

BCL2樣蛋白13(BCL2L13)是酵母自噬蛋白Atg32的哺乳動(dòng)物同源物，在OMM中廣泛表達(dá)并定位，其N端暴露于細(xì)胞質(zhì)中。它是一個(gè)非典型的BCL2家族蛋白，包含四個(gè)BH基序。這些BH結(jié)構(gòu)域參與線粒體碎裂和靶向線粒體至自噬體。BCL2L13誘導(dǎo)的線粒體自噬不依賴DRP1和Parkin途徑。它的LIR區(qū)域直接與LC3相互作用，使線粒體被吞噬膜識(shí)別，啟動(dòng)線粒體降解途徑[23]。

1.3 脂質(zhì)介導(dǎo)的線粒體自噬最近研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)可作為一種消除信號(hào)，介導(dǎo)損傷線粒體向自噬途徑的募集。神經(jīng)酰胺和心磷脂是參與線粒體自噬啟動(dòng)的線粒體脂質(zhì)。在線粒體應(yīng)激條件下，主要位于OMM的線粒體神經(jīng)酰胺合成酶1(CerS1)合成神經(jīng)酰胺，與LC3相互作用，誘導(dǎo)線粒體自噬。同樣，心磷脂通常存在于線粒體內(nèi)膜(IMM)磷脂中，向OMM轉(zhuǎn)移是脂質(zhì)介導(dǎo)線粒體自噬的獨(dú)特機(jī)制。心磷脂通過與LC3直接相互作用導(dǎo)致自噬。

2 線粒體自噬與年齡相關(guān)性眼病

年齡是導(dǎo)致年齡相關(guān)性眼病不可改變的危險(xiǎn)因素，包括年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、原發(fā)性開角型青光眼(POAG)和糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)等。Wang等[24]使用靶向代謝組學(xué)分析6周和73周齡C57BL6/J小鼠的眼部代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，老年小鼠視網(wǎng)膜電圖反應(yīng)減弱，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞數(shù)量減少，視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和視神經(jīng)的線粒體和葡萄糖代謝失調(diào)。

2.1 Fuchs內(nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良Fuchs內(nèi)皮角膜營(yíng)養(yǎng)不良(FECD)是一種年齡相關(guān)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)退行性疾病，好發(fā)于50歲以上的女性。在FECD中，CECs表現(xiàn)出應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老、氧化應(yīng)激、DNA損傷、線粒體功能障礙以及持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激。其中，涉及線粒體動(dòng)力學(xué)改變的線粒體自噬在FECD發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

Benischke等[25]最先在FECD患者組織中發(fā)現(xiàn)自噬小體囊泡吞噬腫脹的線粒體。在紫外線(UVA)誘導(dǎo)的FECD小鼠模型[26]和早發(fā)FECD小鼠模型[27]中也報(bào)道了線粒體異常積累，線粒體自噬啟動(dòng)。早發(fā)性FECD小鼠模型以及UVA誘導(dǎo)的FECD小鼠模型中的線粒體自噬機(jī)制尚不清楚，體外研究也較少，需進(jìn)一步探究[28]。Miyai等[28]研究表明，人類FECD樣本顯示PINK1、磷酸化Parkin的表達(dá)上調(diào)，總Parkin降低，線粒體自噬增強(qiáng)。FECD細(xì)胞系也顯示出總Parkin顯著降低，CCCP處理時(shí)，磷酸化Parkin(Ser65)表達(dá)上調(diào)。為了研究Parkin募集后線粒體的泛素化和蛋白酶體降解情況，研究者使用環(huán)氧霉素后發(fā)現(xiàn)Fuchs細(xì)胞系在CCCP治療后總Parkin增加。為了進(jìn)一步研究，使用自噬抑制劑后內(nèi)源性PINK1和總Parkin減少，隨后逆轉(zhuǎn)了Ser65的增加[29]。這些結(jié)果表明，Parkin依賴的線粒體降解參與了FECD的發(fā)生發(fā)展。

2.2 年齡相關(guān)性白內(nèi)障

2.2.1 BNIP3/BNIP3L信號(hào)通路在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中的作用年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是世界范圍內(nèi)失明的首要原因，其基本病理改變是晶狀體透明度下降，由透明變混濁。晶狀體的成熟依賴于晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)向晶狀體纖維細(xì)胞的不斷分化。新形成的晶狀體纖維細(xì)胞為了實(shí)現(xiàn)其成熟的結(jié)構(gòu)和透明的功能，經(jīng)歷了一系列的細(xì)胞重塑事件，包括細(xì)胞器完全消失和晶狀體無細(xì)胞器區(qū)(OFZ)的形成[30]。Brennan等[31]在人和雞胚的自噬溶酶體中檢測(cè)到線粒體的存在，并且發(fā)現(xiàn)BNIP3L蛋白表達(dá)在OFZ形成過程中達(dá)到峰值。并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠晶狀體纖維分化區(qū)域的BNIP3L蛋白表達(dá)較高；然而，BNIP3L-/-小鼠在晶狀體的相同區(qū)域保留了線粒體[31]。如果在纖維細(xì)胞分化過程中，晶狀體中功能失調(diào)的線粒體成分和其他自噬相關(guān)的小泡沒有被清除，它們就會(huì)在OFZ積聚，最終導(dǎo)致白內(nèi)障，這是視力喪失的主要原因之一。

2.2.2 PINK1/Parkin信號(hào)通路在ARC中的作用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的LEC線粒體去極化/損傷會(huì)導(dǎo)致ROS水平的增加和細(xì)胞死亡，氧化和破壞晶狀體的穩(wěn)定和白內(nèi)障的形成。研究表明，在氧化應(yīng)激條件下，Parkin可轉(zhuǎn)運(yùn)到去極化的LEC線粒體膜上，招募p62清除損傷的線粒體。另外，研究發(fā)現(xiàn)Parkin消除受損的LEC線粒體會(huì)降低ROS水平，并且對(duì)氧化應(yīng)激暴露后LEC的穩(wěn)態(tài)和存活至關(guān)重要[32]。因此，線粒體自噬參與了晶狀體細(xì)胞器的降解，為白內(nèi)障的病理機(jī)制提供了新的見解。

2.3 青光眼

2.3.1 PINK1/Parkin信號(hào)通路在青光眼中的作用青光眼是由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的進(jìn)行性損傷引起的，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的、不可逆的失明，預(yù)計(jì)到2040年將有1.118億人受到青光眼的影響[33]。原發(fā)性青光眼的發(fā)生發(fā)展被公認(rèn)為具有顯著的年齡相關(guān)性，年齡是原發(fā)性青光眼發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，50歲以上人群原發(fā)性青光眼患病率顯著增加[34]。

谷氨酸興奮性毒性是青光眼性神經(jīng)退行性變的一種病理生理機(jī)制，可導(dǎo)致線粒體動(dòng)力學(xué)改變，導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡[35]。過表達(dá)Parkin可保護(hù)RGCs免受谷氨酸興奮性毒性損傷[36]。此外，在慢性高血壓青光眼大鼠模型中，過表達(dá)Parkin后LC3-Ⅱ/Ⅰ和溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP2)的水平隨眼壓的升高而增加，線粒體自噬激活，RGCs死亡率降低。此外，研究發(fā)現(xiàn)高眼壓大鼠線粒體自噬相關(guān)Parkin基因表達(dá)增加，這為線粒體自噬參與青光眼性RGCs損傷提供了新證據(jù)[37]。Hu等[38]通過慢性高眼壓性青光眼模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)視神經(jīng)萎縮蛋白1(OPA1)和Parkin導(dǎo)致RGCs死亡減少，這表明清除受損的線粒體具有RGCs保護(hù)作用。OPTN不僅與POAG有關(guān)，而且具有泛素和LC3的結(jié)合域，是Parkin依賴性線粒體自噬通路的受體。但Chernyshova等[39]利用自噬受損的HeLa細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，青光眼突變OPTN蛋白保持了其線粒體自噬受體的正常特性，提示青光眼OPTN基因突變可能與線粒體自噬無關(guān)?？傊m然有證據(jù)表明自噬不平衡損害了RGCs的存活率，但其精確機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

2.3.2 BNIP3/BNIP3L信號(hào)通路在青光眼中的作用線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)被發(fā)現(xiàn)在多種神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型中減輕氧化應(yīng)激和神經(jīng)損傷[40]。Hass等[41]在UCP2敲除的小鼠前房注射微珠建立高眼壓模型，他們發(fā)現(xiàn)，RGCs特異性的UCP2缺失減少了ROS介導(dǎo)的蛋白修飾數(shù)量和RGCs死亡。UCP2的缺失促進(jìn)了線粒體自噬，在受損的線粒體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害之前清除線粒體，并為RGCs提供保護(hù)。通過測(cè)量LC3B和線粒體特異蛋白(TOM20)的共定位、線粒體表面積以及BNIP3L蛋白的表達(dá)，可以定量觀察線粒體自噬水平。UCP2的發(fā)現(xiàn)可能為青光眼線粒體自噬提供了新的治療靶點(diǎn)，以預(yù)防高眼壓下的RGCs死亡。

2.4 AMDAMD是一種復(fù)雜的視網(wǎng)膜疾病，是導(dǎo)致老年人失明的主要原因，由環(huán)境和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素共同導(dǎo)致[42]。在AMD中，視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞表現(xiàn)出IMM和OMM結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重破壞，線粒體大小的改變和動(dòng)態(tài)細(xì)胞質(zhì)組織的變化。氧化應(yīng)激的增加和RPE細(xì)胞損傷在AMD的進(jìn)展中起著關(guān)鍵的作用[43]。

Lee等[44]發(fā)現(xiàn)，RPE 細(xì)胞受到病理刺激后，PINK1積聚在線粒體膜表面啟動(dòng)線粒體自噬，預(yù)防RPE細(xì)胞進(jìn)一步受損。Sridevi等[45]用核因子紅細(xì)胞-2相關(guān)因子2和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1-α雙敲除(NFE2L2/PGC-1α-/-)的小鼠建立干性AMD小鼠模型，該模型具有線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激等特征。Nrf2主要參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)，而PGC-1α參與線粒體生物發(fā)生和抗氧化防御系統(tǒng)。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)這種模型小鼠的RPE細(xì)胞進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1和Parkin的共定位增加，而溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP2和ATP合酶表達(dá)并未明顯改變。此外，Stenirri等[46]的一項(xiàng)研究顯示，線粒體鐵蛋白(FtMt)突變與AMD密切相關(guān)，該研究涉及50例不同疾病階段的AMD患者，包括滲出性、非滲出性和早期AMD患者。FtMt是一種含鐵的抗氧化蛋白，研究表明，鐵螯合通過PINK1/Parkin信號(hào)通路減少胞質(zhì)鐵誘導(dǎo)自噬[47]。RPE中FtMt的增加可能通過觸發(fā)線粒體自噬而起到保護(hù)作用，但由于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌增加而誘導(dǎo)新生血管形成，從而導(dǎo)致濕性AMD。然而，低氧狀態(tài)下RPE細(xì)胞中功能性FtMt水平的降低可能導(dǎo)致年齡相關(guān)應(yīng)激引起的干性AMD[48]，這為AMD提供了另一種潛在的治療策略。此外，在一個(gè)鈣細(xì)胞毒性的果蠅模型中，活性瞬時(shí)受體電位TRPP3365通道導(dǎo)致視網(wǎng)膜退化，在光感受器中發(fā)現(xiàn)線粒體形態(tài)和功能異常，過表達(dá)PINK1和Parkin能阻止瞬時(shí)受體電位TRPP3365誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞變性[49]?？傊?，PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬障礙是導(dǎo)致AMD的重要原因，通過線粒體自噬增加受損線粒體的清除率可增加RPE細(xì)胞活力，靶向線粒體自噬相關(guān)蛋白(如FtMt)可能是預(yù)防AMD進(jìn)展的治療方法。

2.5 DRDR是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致24至64歲人群視力損害和失明的主要原因,其最重要的病理特征是血-視網(wǎng)膜屏障缺損。其中，RPE和Müller細(xì)胞在維持血-視網(wǎng)膜屏障的完整性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[50]。目前研究者在糖尿病體內(nèi)外模型中發(fā)現(xiàn)，糖尿病可導(dǎo)致RPE和Müller細(xì)胞中線粒體自噬減少，并導(dǎo)致其死亡。

Devi等[51]觀察到高糖培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞可發(fā)生線粒體功能障礙，線粒體受損率增加，線粒體自噬通量減少。Zhang等[52]通過高糖刺激RPE細(xì)胞發(fā)現(xiàn)ROS產(chǎn)生增加，細(xì)胞自噬減少，細(xì)胞凋亡增加。同時(shí)證明高糖狀態(tài)下的線粒體自噬減少是通過ROS的積累抑制PINK1和Parkin基因的表達(dá)。過表達(dá)PINK1基因可減輕高血糖對(duì)RPE細(xì)胞的毒性作用。這說明在高血糖環(huán)境中，DR患者ROS升高、線粒體自噬減少和細(xì)胞死亡增加之間存在密切關(guān)系，并且促進(jìn)線粒體自噬可能是延緩DR發(fā)展的有效靶點(diǎn)。

db/db小鼠是目前研究DR較為成熟的動(dòng)物模型，具有RGCs、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞凋亡增加，基底膜增厚，視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞激活等特點(diǎn)[53]。三七皂苷R1(NGR1)是一種具有抗炎特性和清除ROS的中藥。Zhou等[54]通過對(duì)db/db小鼠玻璃體內(nèi)注射NGR1后發(fā)現(xiàn)，PINK1和Parkin表達(dá)增強(qiáng)、LC3II/I比值增加、透射電子顯微鏡下可見自噬體增加以及GFP-LC3同線粒體標(biāo)記物共定位增加。而沉默PINK1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LC3II/I的比值，減輕了DR的進(jìn)展。這項(xiàng)研究支持了抗氧化治療通過靶向PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在預(yù)防DR中的作用[53]。

3 總結(jié)

線粒體是細(xì)胞能量的發(fā)生器，其正常運(yùn)轉(zhuǎn)可維持細(xì)胞活力。線粒體自噬作為清除和修復(fù)損傷線粒體的過程，在線粒體功能調(diào)節(jié)和損傷后修復(fù)中起重要作用。許多研究表明，年齡相關(guān)性眼病中存在線粒體自噬通量的降低，適當(dāng)?shù)木€粒體自噬有助于保護(hù)視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞，而線粒體自噬不足或過度是有害的，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，加重年齡相關(guān)性眼病的發(fā)展。進(jìn)一步研究線粒體能量代謝和自噬與衰老之間的調(diào)控機(jī)制，針對(duì)線粒體自噬相關(guān)的小分子或蛋白質(zhì)干預(yù)可能為治療年齡相關(guān)性眼病提供新的靶點(diǎn)。