干眼患者淚液中Nod樣受體1表達(dá)水平及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

王曉偉 李正日 金 花 賈寓潔 趙景華 趙 健 黃 旭 吳成哲

干眼是最常見(jiàn)的眼表疾病之一，被認(rèn)為是一種多因素疾病，雖然其發(fā)病機(jī)制尚未確定，但越來(lái)越多的證據(jù)表明眼表炎癥在干眼的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能起關(guān)鍵作用[1-4]。

相關(guān)研究已確定核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRs)是一種炎癥和炎癥后續(xù)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)。在NLRs中，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體1(Nod-1)和受體2(Nod-2)在受到特征微生物產(chǎn)物和危險(xiǎn)信號(hào)等刺激后激活核因子kappa B(NF-κB)免疫通路，誘導(dǎo)促炎介質(zhì)轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，進(jìn)而激活促炎反應(yīng)[5]。已有研究表明，在干眼患者眼表中，同為NLRs家族成員的NLR pyrin結(jié)構(gòu)域3(NLRP3)炎癥小體的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均上調(diào)，這提示NLRP3炎癥小體參與了炎癥性干眼的發(fā)生和發(fā)展[6-7]。但是，目前有關(guān)Nod-1受體蛋白是否也參與干眼的炎癥發(fā)生研究尚少。因此，本研究的目的是通過(guò)研究干眼患者Nod-1受體蛋白與眼表參數(shù)的相關(guān)性，明確Nod-1受體蛋白是否與干眼的炎癥發(fā)展有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2021年1月至6月就診于延邊大學(xué)附屬醫(yī)院眼科門診的受試者50例(右眼)，其中干眼患者27眼(男11眼、女16眼)為干眼組，非干眼的健康人23眼(男13眼、女10眼)為對(duì)照組。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有受試者及家屬均簽署知情同意書。所有受試者年齡均為18～70歲。干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)干眼專家共識(shí)：檢查和診斷(2020版)》[8]：(1)具有干澀感、眼疲勞、視力波動(dòng)、異物感等主觀癥狀；(2)淚膜破裂時(shí)間(BUT)≤5 s或淚液分泌實(shí)驗(yàn)(SⅠT)≤5 mm;(3)BUT為>5～≤10 s或SⅠT為>5～10 mm，并伴有角膜熒光素染色(FL)陽(yáng)性。符合(1)+(2)或(1)+(3)項(xiàng)即可診斷。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18歲或>70歲；(2)嚴(yán)重全身疾病，如癡呆、腦梗死、干燥綜合征、Stevens-Johnson綜合征等；(3)近4周使用過(guò)全身抗生素或眼部滴眼液;(4)1個(gè)月內(nèi)配戴角結(jié)膜接觸鏡；(5)3個(gè)月內(nèi)眼部手術(shù)史，如白內(nèi)障、近視、翼狀胬肉手術(shù)等；(6)眼部外傷或化學(xué)燒傷史；(7)感染性角膜結(jié)膜炎、急性淚囊炎、淚點(diǎn)阻塞、急性青光眼等其他眼部疾病。

1.2 評(píng)估指標(biāo)評(píng)估指標(biāo)包括眼表疾病指數(shù)(OSDI)評(píng)分、FL評(píng)分、BUT、SⅠT、淚液中蛋白質(zhì)檢測(cè)和炎癥因子檢測(cè)，并按此順序?qū)γ课皇茉囌哌M(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1 OSDI評(píng)分OSDI問(wèn)卷用于量化詳細(xì)的干眼狀評(píng)分，包括以下子量表：(1)眼部癥狀(OSDI癥狀)；(2)日常生活中的視覺(jué)相關(guān)活動(dòng)(OSDI視覺(jué)功能)；(3)環(huán)境觸發(fā)因素(OSDI觸發(fā)因素)[9-10]。通過(guò)這項(xiàng)問(wèn)卷調(diào)查，分析受試者OSDI總分，分值范圍為0～100分。

1.2.2 FL評(píng)分用1滴奧布卡因滴眼液濕潤(rùn)熒光素鈉眼科檢測(cè)試紙(天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，放置在受檢者下穹隆處，叮囑患者數(shù)次眨眼后平視前方，用鈷藍(lán)光16倍鏡下觀察患者全角膜染色情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：采用 0～12 分制記錄染色結(jié)果，即將角膜劃分為4個(gè)象限，每一象限根據(jù)染色程度和面積評(píng) 0～3 分，其中，0分為無(wú)染色，1分為輕度染色和少量散亂的斑點(diǎn)，2分為在1～3分之間的中度染色，3分為嚴(yán)重的染色和匯合的染色或角膜細(xì)絲。

1.2.3 BUT囑患者瞬目3～5次后平視前方，用鈷藍(lán)光在16倍鏡下觀察患者末次瞬目至第一次出現(xiàn)淚膜破裂點(diǎn)的時(shí)間，重復(fù)檢查3次，取平均值進(jìn)行分析。

1.2.4 SⅠT將校準(zhǔn)的淚液檢測(cè)濾紙條(天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)置入患者下結(jié)膜囊的中外1/3交界處，囑患者向下看或輕輕閉眼，5 min后取出濾紙，測(cè)量濾紙濕潤(rùn)長(zhǎng)度，連續(xù)測(cè)量3次取平均值。

1.2.5 蛋白質(zhì)和炎癥因子檢測(cè)用毛細(xì)管收集患者20 μL非刺激性淚液，用ELISA檢測(cè)淚液中Nod-1受體、NF-κB p65和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的表達(dá)水平。向預(yù)先包被抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的識(shí)別抗原，37 ℃下孵育1 h，兩者與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)加入Tween-20的磷酸緩沖液洗滌后，結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶催化四甲基聯(lián)苯胺成藍(lán)色，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化變成黃色，在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度與樣本中抗原的濃度成負(fù)相關(guān)[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 24.0和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，除性別外，所有數(shù)據(jù)均符合連續(xù)變量的正態(tài)分布，且采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組受試者年齡、眼表參數(shù)、淚液中蛋白質(zhì)和炎癥因子比較行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，受試者性別進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析Nod-1受體蛋白、NF-κB p65蛋白、IL-1β水平與眼表參數(shù)的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者一般資料本研究共納入50名受試者。干眼組和對(duì)照組受試者的OSDI評(píng)分、BUT、SⅠT、FL評(píng)分組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)；兩組受試者年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 兩組受試者一般資料

2.2 受試者淚液中蛋白質(zhì)和炎癥因子表達(dá)水平干眼組患者淚液中Nod-1受體蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)(表2)。

表2 兩組受試者淚液中蛋白質(zhì)炎癥因子表達(dá)水平

2.3 干眼組患者淚液中蛋白質(zhì)和炎癥因子表達(dá)與眼表參數(shù)的相關(guān)性

2.3.1 Nod-1受體蛋白表達(dá)與眼表參數(shù)的相關(guān)性干眼組患者中，Nod-1受體蛋白的表達(dá)水平與 OSDI 評(píng)分、FL評(píng)分均呈強(qiáng)正相關(guān)性，與SⅠT呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)性(rOSDI=0.669，rFL=0.643，rSⅠT=-0.661；POSDI<0.001，PFL=0.002，PSⅠT<0.001)，與BUT無(wú)顯著相關(guān)性(r=-0.002，P=0.991)(圖1)。

圖1 干眼組患者淚液中Nod-1受體蛋白表達(dá)與眼表參數(shù)之間的相關(guān)性

2.3.2 NF-κB p65蛋白表達(dá)與眼表參數(shù)的相關(guān)性在干眼組患者中，NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平與OSDI評(píng)分、FL評(píng)分均呈中等強(qiáng)度正相關(guān)性，與SⅠT呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(rOSDI=0.482，rFL=0.599，rSⅠT=-0.452；PDSDI=0.011，PFL=0.010，PSⅠT=0.018)，與BUT無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.101，P=0.617)(圖2)。

圖2 干眼組患者淚液中NF-κB p65蛋白表達(dá)與眼表參數(shù)之間的相關(guān)性

2.3.3 IL-1β表達(dá)與眼表參數(shù)的相關(guān)性干眼組患者中，IL-1β的表達(dá)水平與OSDI評(píng)分和FL評(píng)分均呈強(qiáng)正相關(guān)性(rOSDI=0.713，rFL=0.472；POSDI<0.001，PFL=0.013)，與SⅠT呈中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)性(r=-0.614，P=0.010)，與BUT無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.153，P=0.446)(圖3)。

圖3 干眼組患者淚液中IL-1β表達(dá)與眼表參數(shù)之間的相關(guān)性

3 討論

眼表炎癥現(xiàn)在被認(rèn)為是誘導(dǎo)干眼發(fā)生的主要因素。已有研究明確，在干眼患者的眼表中可以觀察到許多炎癥標(biāo)志物的改變[12-13]。近年來(lái)，不斷有研究表明先天性免疫和適應(yīng)性免疫的平衡在干眼發(fā)病機(jī)制中有非常重要的作用。當(dāng)受到損傷因子刺激后，在NLRs的作用下，活化的胱天蛋白酶-1(caspase-1)參與到IL-1β的成熟,并啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答清除病原體[14]。在NLRs中，Nod-1受體蛋白是通過(guò)“數(shù)量”和“時(shí)間”兩種因素來(lái)促進(jìn)眼部炎癥發(fā)生[15]，同樣，眼表上皮細(xì)胞中的NF-κB也是多種眼表疾病的下游免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[16-17]，這說(shuō)明Nod-1受體蛋白和NF-κB都參與了眼部的炎癥反應(yīng)。此外，Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在干眼小鼠模型中，Nod-2受體通過(guò)激活小鼠眼表的NF-κB通路誘導(dǎo)炎癥發(fā)展和細(xì)胞凋亡，從而減少小鼠淚液分泌，這表明Nod-2受體相關(guān)通路參與了干眼的發(fā)展。然而，Nod-1受體蛋白相關(guān)的免疫通路是否也參與了干眼的發(fā)展現(xiàn)在尚未完全清楚。

本研究旨在通過(guò)評(píng)估Nod-1受體蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β在干眼患者淚液中的表達(dá)，確定Nod-1受體蛋白與干眼患者眼表參數(shù)的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，干眼組患者淚液中的Nod-1受體蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β表達(dá)水平均顯著增高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些結(jié)果提示Nod-1受體蛋白可能與干眼發(fā)生過(guò)程中的眼表炎癥有關(guān)。Niu等[6]研究表明，NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β、IL-18在干眼患者的淚液和眼表中表達(dá)增高，這些發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果一致，即在干眼患者眼表中NLRs的表達(dá)增加。

本研究結(jié)果顯示，干眼組患者的OSDI評(píng)分和FL評(píng)分與Nod-1受體蛋白的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)，SⅠT 與Nod-1受體蛋白的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，且NF-κB p65蛋白和IL-1β也呈現(xiàn)類似的結(jié)果。這表明Nod-1受體蛋白的表達(dá)水平與眼部炎癥的嚴(yán)重程度和干眼癥狀的分級(jí)有關(guān)。此外，本研究結(jié)果還表明，干眼組患者Nod-1受體蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β表達(dá)水平與BUT之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。國(guó)際淚膜與眼表協(xié)會(huì)(TFOS)[19]在其報(bào)告中闡明，淚膜的不穩(wěn)定性是影響干眼患者BUT的主要原因。同時(shí)Kim等[20]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)淚膜穩(wěn)定性的靶向治療可以有效延長(zhǎng)干眼患者的BUT以及改善患者的主觀癥狀。結(jié)合本研究的結(jié)果，提示在干眼發(fā)展過(guò)程中除炎癥作用之外，還存在另一條作用途徑，即淚膜的不穩(wěn)定性。

根據(jù)以上結(jié)果，我們可以大膽推測(cè)Nod-1受體蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β共同參與了干眼炎癥反應(yīng)的發(fā)展。因此，了解包括Nod-1受體蛋白在內(nèi)的NLRs與干眼的關(guān)系，特別是在干眼中的表達(dá)模式并盡可能闡明其病理生理學(xué)，對(duì)干眼的NLRs靶向治療的發(fā)展有深遠(yuǎn)的啟發(fā)意義。