動(dòng)物Toll樣受體8的免疫學(xué)功能研究進(jìn)展

劉學(xué)良，敖 大，姜 森，李鑫帥，李樹斌，夏能文，朱建中

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際聯(lián)合研究實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是最早發(fā)現(xiàn)的天然免疫受體家族，能夠識(shí)別廣泛的病原相關(guān)分子模式。目前，在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體分別至少有10種和12種，TLR1-9為人和鼠共有，人TLR11-13的基因已經(jīng)從人基因組中丟失，鼠TLR10由于反轉(zhuǎn)錄病毒的插入而失去功能[1]。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10在細(xì)胞表面表達(dá)，TLR3、TLR7、TLR8、TLR9定位于細(xì)胞內(nèi)體，但也有一小部分TLR8在細(xì)胞表面表達(dá)[2]。在人類10個(gè)TLR中，感知核酸僅限于TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，其中TLR7、TLR8、TLR9一起組成TLR7/8/9亞家族。TLR8是哺乳動(dòng)物天然免疫中非常重要的模式識(shí)別受體，在促炎、抗病毒感染、抗細(xì)菌感染等方面發(fā)揮重要作用。但最初人們認(rèn)為鼠TLR8沒有活性，所以相比其他的TLR成員，TLR8的研究相對(duì)滯后，因此TLR8在動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中還具有相當(dāng)大的潛力。

1 TLR8研究歷史與特點(diǎn)

Toll樣蛋白可以影響果蠅幼蟲背腹側(cè)軸體的發(fā)育，隨著對(duì)Toll樣蛋白研究的深入，人們漸漸發(fā)現(xiàn)Toll樣蛋白在成年果蠅中對(duì)抵抗真菌感染、產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)具有關(guān)鍵作用，這確立了果蠅Toll樣蛋白的免疫學(xué)意義，之后人們把在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的果蠅Toll樣蛋白的同源物稱為Toll樣受體[1]。20世紀(jì)初，人們?cè)谌祟惢蚪M數(shù)據(jù)庫中搜索發(fā)現(xiàn)了3種新型人類Toll樣受體(human Toll-like receptors，hTLR)，分別是hTLR7、hTLR8、hTLR9。hTLR 7-9包含具有多個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列的膜外域和與人白介素1(interleukin-1，IL-1)受體同源的胞質(zhì)域。在組織水平上對(duì)hTLR7-9的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與其他TLR具有表達(dá)差異，表明hTLR7-9屬于hTLR當(dāng)中一個(gè)新的亞家族。其中的hTLR8基因全長15 563 bp，定位于X染色體中的Xp22.2-Xp22.3。TLR8由25個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的膜外區(qū)、跨膜區(qū)和TIR區(qū)組成，其功能發(fā)揮需要較低的pH環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，TLR8在動(dòng)物體內(nèi)主要起到抗細(xì)菌、抗感染的作用，是Toll樣受體家族當(dāng)中非常重要的成員[2]。

2 TLR8配體(激活劑)及其種屬特異性

TLR8和TLR7具有很多相似的激活劑，包括單鏈RNA和小分子核苷酸類似物，同時(shí)，TLR7和TLR8對(duì)RNA的序列特異性識(shí)別有一些序列偏好的報(bào)道，例如，富含GU和U的單鏈RNA分別優(yōu)先被TLR7和TLR8識(shí)別[3]。有研究表明，含有GU基序的微核糖核酸可以從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，作為Toll樣受體的配體發(fā)揮作用[8]，其中腫瘤細(xì)胞分泌的miRNA-21和miRNA-29α可被人TLR8或小鼠TLR7識(shí)別。TLR8的小分子激活劑包括咪唑喹啉類化合物 R848和CL097、噻唑并喹諾酮類分子CL075，這些小分子也可以同時(shí)激活TLR7。有些TLR7小分子激活劑，如R837和Loxoribine，并不能激活人和小鼠的TLR8，它們被稱為TLR7特異性激活劑[9]。除識(shí)別病毒RNA外，TLR8也能夠識(shí)別細(xì)菌RNA，這些細(xì)菌包括大腸埃希氏菌、牛分支桿菌、幽門螺桿菌和萊姆病螺旋體等[10]。TLR8識(shí)別配體并被激活具有明顯的種屬特異性，小鼠TLR8不能被上述任何TLR8/7激活劑激活，因此一度被認(rèn)為沒有活性。之后研究表明，TLR8激活劑和多聚胸腺嘧啶脫氧核糖寡核苷酸合并使用時(shí)能夠激活小鼠TLR8。

后續(xù)有研究系統(tǒng)地比較了人、噬齒類(小鼠和大鼠)、家畜類(豬、牛、馬、羊等)的TLR8，證實(shí)噬齒類的TLR8只有在多聚胸腺嘧啶脫氧核糖寡核苷酸存在時(shí)才能被TLR8/7激活劑激活，還發(fā)現(xiàn)小鼠和大鼠TLR8的 LRR14和LRR15之間的功能未知區(qū)域缺少了5個(gè)氨基酸，這一分子差異導(dǎo)致了TLR8的種屬特異性[4]。與人TLR8不同，牛和豬的TLR8都可以被TLR7特異性激活劑R837活化，TLR8的這一種屬特異性的分子基礎(chǔ)目前還不清楚。TLR8的種屬特異性也影響了生物種群的發(fā)展，亞馬遜海牛和西印度海牛是容易滅絕的水生哺乳動(dòng)物，有研究表明兩者在TLR8上單核苷酸多態(tài)性的不同可能與西印度海牛種群減少以及亞馬遜海牛種群擴(kuò)張有關(guān)[5]。TLR8上單核苷酸多態(tài)性的差異導(dǎo)致了不同種群天然免疫的差異，或許隨著對(duì)TLR8種屬特異性的進(jìn)一步探索，人們可以了解到更多動(dòng)物種族滅絕的真相。

3 TLR8的分子結(jié)構(gòu)與活化機(jī)制

TLR8的膜外區(qū)域包含20個(gè)至26個(gè)亮氨酸富集重復(fù)序列(leucine rich repeat，LRR)模塊，并形成具有LRR蛋白特征的馬蹄形右手彎曲螺線管。每個(gè)LRR單元包含了20到30個(gè)氨基酸；前10個(gè)氨基酸形成了一個(gè)在LRR蛋白中高度保守的共有基序。上述共有基序在馬蹄形結(jié)構(gòu)的凹面形成β鏈，而相鄰LRR單元的β鏈相互作用又形成一個(gè)橫跨馬蹄結(jié)構(gòu)凹面的β片。TLR8蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析表明，TLR8的膜外區(qū)為環(huán)形結(jié)構(gòu)，與TLR1-6胞外區(qū)馬蹄狀結(jié)構(gòu)不同[6]。TLR8的膜外區(qū)域還包含幾個(gè)較大的插入序列和一個(gè)位于LRR14和LRR15之間的未知區(qū)域環(huán)。雖然對(duì)特定TLR 未知區(qū)域環(huán)的作用和加工處理過程尚不清楚，但多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，TLR8中的未知區(qū)域環(huán)的蛋白酶裂解是TLR8受體蛋白發(fā)揮信號(hào)功能所必需。

TLR8與單鏈RNA激動(dòng)劑的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析，在此結(jié)構(gòu)中TLR8具有兩個(gè)不同的配體結(jié)合口袋，一個(gè)用于結(jié)合核苷尿苷，與保守的小分子配體結(jié)合位點(diǎn)相同；另一個(gè)用于結(jié)合二核苷酸和三核苷酸(如UG，NUG或UGN)。許多合成的TLR8配體RNA包含全硫代磷酸酯主鏈連接或復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，需要核糖核酸酶(RNase)的作用處理后才具備刺激活性。人類體內(nèi)的RNase包括RNase T2和RNase A家族的轉(zhuǎn)移酶型核酸內(nèi)切酶[7]。當(dāng)TLR8對(duì)合成RNA、細(xì)菌RNA和原生動(dòng)物RNA進(jìn)行免疫識(shí)別時(shí)，需要RNaseT2和RNase2這兩種酶的協(xié)同降解作用[8]。

配體誘導(dǎo)的TLR1-6多聚化的觀點(diǎn)已經(jīng)被人們廣泛接受，這些蛋白質(zhì)的胞外區(qū)在配體刺激下形成了同源或異源的二聚體。與TLR1-6不同的是，無論有無激活劑存在，TLR8膜外區(qū)純化蛋白都會(huì)以相似的二聚體晶體結(jié)構(gòu)形式存在。沒有活化時(shí)，TLR8膜外區(qū)環(huán)形C端側(cè)面上升處通過多個(gè)氫鍵和其他分子間作用力相互結(jié)合形成二聚體。而在TLR8活化過程中，小分子激活劑結(jié)合在TLR8二聚體的聚合界面處，與TLR8 形成2∶2復(fù)合體，單個(gè)小分子激活劑與一個(gè)TLR8膜外區(qū)N-端的LRR11-14結(jié)合，同時(shí)與另一個(gè)TLR8膜外區(qū)的C-端LRR16-18通過多種非共價(jià)分子間作用力結(jié)合，這種結(jié)合引起了TLR8二聚體構(gòu)象的輕微變化，以致引起二聚體膜外區(qū)環(huán)形C端的相互靠近，胞漿區(qū)的聚合及完全活化。

4 TLR8的細(xì)胞分布和信號(hào)通路

TLR8主要在髓系單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，而在漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞和B細(xì)胞中僅有少量表達(dá)。與TLR7主要在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)不同，TLR8則更多在單核細(xì)胞中表達(dá)，并且TLR8對(duì)于人類單核細(xì)胞檢測(cè)革蘭氏陽性菌至關(guān)重要[9]。在人類，中性粒細(xì)胞是血液中最豐富的白細(xì)胞，能迅速遷移到感染部位。但與單核細(xì)胞相比，中性粒細(xì)胞中TLR8的基礎(chǔ)表達(dá)水平卻比較低，而單核細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-12p70來上調(diào)中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞中TLR8的表達(dá)。在很多情況下，不同細(xì)胞內(nèi)TLR8信號(hào)的應(yīng)答會(huì)受到抑制。人被人類免疫缺陷病毒1型(Human immunodificidncy virus-1,HIV-1)感染時(shí)，樹突狀細(xì)胞對(duì)于TLR8激活劑的應(yīng)答會(huì)受到損害。轉(zhuǎn)錄因子p53是一種腫瘤抑制因子，在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程中，p53的激活會(huì)降低巨噬細(xì)胞對(duì)TLR8激動(dòng)劑的反應(yīng)性[10]。

因?yàn)門LR8的研究相對(duì)滯后，而且TLR7和TLR8在識(shí)別配體方面非常相似，所以人們對(duì)TLR8信號(hào)通路的認(rèn)識(shí)主要參照了TLR7信號(hào)通路。TLR8活化后，胞漿內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域聚合，招募具有同源結(jié)構(gòu)域的接頭分子MyD88，后者吸引并活化蛋白激酶IRAK4和IRAK2。上述蛋白激酶激活下游連接分子TRAF6，從而激活I(lǐng)KK復(fù)合體并導(dǎo)致MAP激酶(MAPK，包括ERK1/2、p38和JNK)和NF-κB的激活，另一方面，TLR8的激活也可以激活干擾素調(diào)節(jié)因子來誘導(dǎo)干擾素(IFN)和干擾素刺激基因(IFN stimulated gene,ISG)的產(chǎn)生。

5 TLR8信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的作用

TLR8和TLR7在結(jié)構(gòu)、基因定位和RNA感知方面相似，但它們主要存在于不同的外周血免疫細(xì)胞亞群中，這也同樣突顯了它們不同的生物學(xué)功能。TLR7主要在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞主要產(chǎn)生抗病毒的IFN-α。TLR8則主要在單核-巨噬細(xì)胞中表達(dá)，單核-巨噬細(xì)胞主要產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-12，這些基本都是Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子。由TLR8激動(dòng)劑激活的中性粒細(xì)胞在沒有γ干擾素(IFN-γ)存在時(shí)，依然可以合成和釋放EB病毒誘導(dǎo)基因3，但不能合成IL-12、IL-27、IL-35或IL-39[11]。另外，TLR8的激活可以引起NK細(xì)胞的活化，從而使NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。而IFN-γ可以通過誘導(dǎo)Th2細(xì)胞中的γ干擾素信號(hào)傳導(dǎo)因子來抑制Th2細(xì)胞的增殖，因此TLR8信號(hào)可以通過誘導(dǎo)IFN-γ來實(shí)現(xiàn)對(duì)Th2細(xì)胞的調(diào)節(jié)。TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌參與系統(tǒng)性炎癥的細(xì)胞因子，可以作為一種內(nèi)源性致熱源來抑制病毒的復(fù)制，同時(shí)具有抗腫瘤和促進(jìn)損傷組織愈合的作用。人單核細(xì)胞中TLR8激活后會(huì)促進(jìn)IL-12p70的產(chǎn)生[12]，IL-12p70可以上調(diào)NK細(xì)胞中TLR8的表達(dá)，從而促進(jìn)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。同時(shí)，IL-12p70是一種已知的Th1分化激活劑，由IL-12家族細(xì)胞因子IL-12p35和IL-12p40組成。當(dāng)TLR8和TLR2受到協(xié)同刺激時(shí)，將不再產(chǎn)生IL-12p35，而誘導(dǎo)IL-23p19的產(chǎn)生。IL-12p40和IL-23p19共同組成被稱為IL-23的異源二聚體，它是一種強(qiáng)大的Th17分化增強(qiáng)劑。因此，TLR8和TLR2的共同信號(hào)應(yīng)該會(huì)增加急性炎癥反應(yīng)，并提供從Th1免疫到Th17免疫增強(qiáng)的轉(zhuǎn)變[13]。

6 TLR8信號(hào)與相關(guān)疾病

TLR8在多種類型免疫細(xì)胞中表達(dá)，并產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，這對(duì)系統(tǒng)性紅瘡狼斑和其他自身免疫性疾病的治療至關(guān)重要。TLR8位于X染色體上，主要在Xp22區(qū)域，距TLR7近端16 kb。全基因組掃描研究表明，Xp22號(hào)染色體上的基因變異與哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，同時(shí)，對(duì)哮喘患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TLR8信號(hào)可以抑制Th2的細(xì)胞因子分泌，其誘導(dǎo)的IL-5可以通過促進(jìn)血管活性物質(zhì)的合成和釋放來調(diào)節(jié)哮喘[14]。這些情況都表明，位于人類X染色體上的TLR8與人類過敏性疾病息息相關(guān)，從這一角度也可以解釋女性自身免疫性疾病發(fā)病率高于男性的原因[15]。

在卵巢癌環(huán)境當(dāng)中，CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)通過糖酵解途徑產(chǎn)生更高的葡萄糖消耗，從而比效應(yīng)T細(xì)胞消耗更多的能量，抑制效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮功能，促進(jìn)腫瘤生長[16]。TLR8信號(hào)的激活可以特異性地抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的葡萄糖代謝，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制作用，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫[17]。與之相應(yīng)的，TLR8還廣泛表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上，調(diào)節(jié)腫瘤的生長和功能，不同類型的人類腫瘤細(xì)胞可以通過腫瘤衍生的內(nèi)源性代謝物環(huán)磷酸腺苷誘導(dǎo)T細(xì)胞衰老和功能障礙[18]。通過激活腫瘤細(xì)胞中的TLR8信號(hào)，可以降低腫瘤細(xì)胞中的環(huán)磷酸腺苷水平，顯著提高腫瘤患者身體中腫瘤特異性T細(xì)胞的抗腫瘤療效[19]。值得注意的是，在HIV感染期間，HIV的單鏈RNA暴露于細(xì)胞內(nèi)體當(dāng)中的Toll樣受體，然后以特異性激活TLR8的方式，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，這些可能有助于HIV在淋巴結(jié)中的傳播以及引起HIV患者的輕度炎癥[20]。

在慢性乙型肝炎患者中，TLR8的激活可能會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒免疫力并推動(dòng)機(jī)體的功能性治愈，Selgantolimod是一種新的TLR8激動(dòng)劑，在口服抗病毒治療或病毒抑制治療的慢性乙型肝炎患者中進(jìn)行了評(píng)估，具有一定的療效[21]。

嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019冠狀病毒病自2020年3月以來出現(xiàn)大流行，嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2的確切致病機(jī)理仍然沒有完全清楚，但我們可以從冠狀病毒家族(如SARS-CoV和MERS-CoV)的可用數(shù)據(jù)來更好地理解嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2。TLR在識(shí)別病毒顆粒和激活先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，但TLR7/8激活劑咪喹莫特可促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在感染后期可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴和持續(xù)炎癥等副作用。因此，咪喹莫特適合應(yīng)用于COVID-19感染的早期階段[22]。

三叉神經(jīng)病理性疼痛是非常常見的顱神經(jīng)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在部分眶下神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的小鼠三叉神經(jīng)性疼痛模型中，TLR8在三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中的表達(dá)持續(xù)升高，而TLR8在三叉神經(jīng)節(jié)中的缺失或敲除可減輕部分眶下神經(jīng)結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺異常，減少三叉神經(jīng)節(jié)中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。同時(shí)已經(jīng)證明TLR8通過激活MAPK介導(dǎo)神經(jīng)炎癥參與了三叉神經(jīng)性疼痛的維持，這表明靶向TLR8信號(hào)可能對(duì)治療三叉神經(jīng)性疼痛有效[23]。

TLR8作為天然免疫受體，本身可以進(jìn)行病原體的識(shí)別。并且TLR8主要激活下游的炎癥因子，在部分疾病當(dāng)中，由于TLR8的激活也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生過度損傷和自身免疫。這時(shí)，針對(duì)病情合理地使用TLR8激活劑和抑制劑，往往可以達(dá)到比較良好的治療效果。綜上所述，TLR8與自身免疫性疾病、傳染性疾病、癌癥和其他神經(jīng)性疾病都具有密不可分的聯(lián)系，這對(duì)于動(dòng)物疾病治療來講非常具有借鑒意義。

7 展望

因?yàn)槿狈LR8激動(dòng)劑特異作用效應(yīng)的動(dòng)物模型，所以關(guān)于TLR8及其在疾病中的作用研究仍然受到限制。到目前為止，與TLR8活性遺傳調(diào)節(jié)相關(guān)的研究僅限于靈長類動(dòng)物，然而有證據(jù)表明，TLR8在免疫方面的作用可以使用羊和牛等動(dòng)物模型來進(jìn)行研究[24]。TLR8對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)控作用，也顯露出TLR8在抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵作用。TLR8激動(dòng)劑憑借其誘導(dǎo)IFN-γ/TNF-α的能力，也表現(xiàn)出抗病毒、抗癌癥和作為疫苗佐劑的巨大潛力。相信在未來，人們一定能探究到TLR8更多的功能，從而使TLR8能夠在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)治療疾病中發(fā)揮更多的作用。