大鼠磨牙牙髓血運(yùn)重建術(shù)后血管內(nèi)皮生長因子的 表達(dá)及意義

王 芹 李立恒 王鐘華 楊永超 馮建梅 胥愛文 安 峰 申葉春

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，張家口 075000）

牙髓血運(yùn)重建技術(shù)通過徹底有效的根管消毒，盡量保護(hù)殘留牙髓組織、牙髓干細(xì)胞和根尖乳頭干細(xì)胞等，形成以血凝塊為主的再生支架并提供生長因子，最后進(jìn)行嚴(yán)密的冠方封閉，為干細(xì)胞增殖和分化提供良好的環(huán)境，從而促使牙根繼續(xù)發(fā)育[1]。血管生成是從已有的毛細(xì)血管發(fā)展成新血管的過程。它是一個(gè)基本的生理過程，對胚胎發(fā)育、排卵和傷口修復(fù)至關(guān)重要，與關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變和腫瘤生長等病理?xiàng)l件有關(guān)[2]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在血管生成中起著中心作用，促進(jìn)新毛細(xì)血管的形成，對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和存活至關(guān)重要[3]。在生理和病理?xiàng)l件下，VEGF的調(diào)節(jié)對許多組織的新生血管形成至關(guān)重要[3]。研究表明，VEGF在牙髓干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵作用，可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的存活，分化內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的出芽以及通透性[4]，但VEGF在牙髓血運(yùn)重建后的表達(dá)及其分子機(jī)制仍不明確。為了更好地了解牙髓血運(yùn)重建術(shù)后VEGF在根尖周組織中的表達(dá)規(guī)律，本研究擬通過建立大鼠磨牙牙髓血運(yùn)重建術(shù)動(dòng)物模型，觀察牙髓血運(yùn)重建術(shù)對VEGF的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型建立

30只6 ～ 8 周齡健康的 SPF 級雌性 SD 大鼠，體重 （177.83±11.04） g，由廣東醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將30只SD大鼠隨機(jī)編號分成實(shí)驗(yàn)組、對照組及空白組，各組具體操作如下：

（1）實(shí)驗(yàn)組：水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，牙科顯微鏡下對術(shù)區(qū)消毒和清理（圖1A）。利用無菌手術(shù)器械將第一磨牙開髓，沿近遠(yuǎn)中方向去髓，生理鹽水和1.25%NaClO交替沖根管內(nèi)洗殘留牙髓組織，用針損傷根尖刺激出血（圖1B），用生理鹽水棉簽止血，待其凝固后使用三氧化物多聚體（MTA）覆蓋血凝塊面，以流動(dòng)樹脂進(jìn)行填充（圖1C）。（2）對照組：將下頜第一磨牙開髓，牙髓腔直接開放于口腔環(huán)境3周形成根尖周炎。（3）空白組：大鼠牙齒不做任何處理。

圖1 牙科顯微鏡下磨牙牙髓血運(yùn)重建動(dòng)物模型建立

術(shù)后每日觀察下頜第一磨牙填充物情況，如若脫落則需重新進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建。

1.2 標(biāo)本采集

在牙髓血運(yùn)重建術(shù)后3周麻醉處死大鼠，剝離下頜第一磨牙及其周圍組織，一部分用100%甲醇或4%多聚甲醛在4℃下固定24 h，經(jīng)脫鈣、脫水、透明、浸蠟后包埋；另一部分組織置于液氮中保存。

1.3 HE染色

包埋的石蠟標(biāo)本沿著牙齒頰舌面做連續(xù)切片（厚度為5 μm），經(jīng)脫蠟復(fù)水后用蘇木精-伊紅進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4 VEGF基因表達(dá)檢測

將置于液氮中的磨牙組織研磨至粉末狀后，使用Trizol試劑（Invitrogen，美國）按照說明書提取總RNA。采用iScript-cDNA合成試劑盒（Bio-Rad，美國）合成cDNA。用SYBR-Green PCR試劑盒（Bio-Rad公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并使用CFX-96快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）進(jìn)行檢測大鼠源性VEGF基因的表達(dá)，引物序列見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)熔融曲線分析驗(yàn)證。使用2-ΔΔct方法，通過管家基因Actin-β值計(jì)算靶基因的相對表達(dá)水平。

表1 RT-PCR引物序列信息

1.5 VEGF免疫組化染色

石蠟切片放置在載玻片上，在60℃培養(yǎng)箱中過夜，在二甲苯中脫蠟并通過分級醇（100%，95%，75%）再水化。將抗大鼠VEGF一抗（Cell Signaling Technology ，美國）以1∶100稀釋后滴加在組織切片上孵育，4℃過夜。孵育完畢后TBST洗去一抗，用過氧化物酶偶聯(lián)二抗在室溫下避光孵育1 h后與3， 3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物-染色原反應(yīng)孵育2 min。孵育好的切片用蘇木精復(fù)染3 min，通過分級醇脫水。最后在切片上滴加中性樹脂，用蓋玻片封片，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察組織中VEGF蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用±s表示，實(shí)驗(yàn)樣本間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物進(jìn)食、活動(dòng)情況良好，未觀察到實(shí)驗(yàn)?zāi)パ姥荔w斷裂或填充物脫落。

2.1 HE染色結(jié)果

術(shù)后3周的HE染色結(jié)果顯示：空白組的牙髓為松散的結(jié)締組織，內(nèi)含血管、纖維等其他細(xì)胞外基質(zhì)，膠原纖維有序排列，根尖孔未完全閉合，呈開放狀。對照組壞死的牙髓組織充滿整個(gè)組織髓腔和根管，根管內(nèi)有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，根管內(nèi)未見新生組織形成。與對照組相比，進(jìn)行了牙髓血運(yùn)重建術(shù)的實(shí)驗(yàn)組大鼠磨牙根管內(nèi)未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，根管內(nèi)長滿新生組織，內(nèi)含血管樣結(jié)構(gòu)，組織結(jié)構(gòu)上更接近正常牙髓結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖2 3組大鼠下頜第一磨牙HE染色（100×）

2.2 VEGF基因表達(dá)水平結(jié)果

如圖3所示，在3組大鼠磨牙組織樣本中觀察到，VEGFmRNA在牙髓血運(yùn)重建術(shù)后中的表達(dá)水平顯著提高（P＜0.01），而VEGFmRNA在對照組中的表達(dá)水平下調(diào)明顯（P＜0.01）。

圖3 各組VEGF的基因表達(dá)情況

2.3 VEGF免疫組化染色結(jié)果

石蠟切片VEGF免疫組化染色顯示：部分細(xì)胞呈褐色（如圖4），VEGF在空白組、實(shí)驗(yàn)組、對照組中均呈有表達(dá)，與空白組和對照組相比， 實(shí)驗(yàn)組牙髓組織內(nèi)腔周圍觀察到一些VEGF強(qiáng)陽性細(xì)胞，表明新生血管形成；與空白組相比，對照組中VEGF陽性較弱。按VEGF陽性率從高到低的排序是實(shí)驗(yàn)組＞空白組＞對照 組。

圖4 3組大鼠下頜第一磨牙VEGF免疫組化染色（200×）

3 討論

顯微牙髓血運(yùn)重建術(shù)是用于治療年輕恒牙牙髓壞死的方法。通過在顯微數(shù)字技術(shù)下操作，徹底有效地根管消毒后，盡量地保護(hù)牙髓干細(xì)胞、牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞和牙周韌帶干細(xì)胞。然后利用根管內(nèi)血凝塊，提供良好的干細(xì)胞增殖和分化微環(huán)境，達(dá)到促進(jìn)牙根繼續(xù)發(fā)育的目的[5]。牙髓血運(yùn)重建的種子細(xì)胞來源主要為牙髓干細(xì)胞、根尖乳頭干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[6]。這些干細(xì)胞在信號分子、蓋髓劑MTA等誘導(dǎo)下?lián)碛胁煌姆只瘽撃?，可以形成牙髓、牙本質(zhì)和牙周韌帶[7]。Stambolsky等人發(fā)現(xiàn)對犬類進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建術(shù)后，未成熟犬齒牙髓顯示出血管再生[8]。成牙本質(zhì)細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞，能產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)，為此，持續(xù)需要大量的氧氣和營養(yǎng)，因而牙髓細(xì)胞對血管破裂導(dǎo)致的血液供應(yīng)中斷反應(yīng)靈敏，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死[9-10]。

在本研究中，對照組大鼠磨牙經(jīng)過開髓暴露牙髓后，石蠟切片HE染色發(fā)現(xiàn)髓腔內(nèi)產(chǎn)生大量壞死細(xì)胞以及根尖周出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，而進(jìn)行了牙髓血運(yùn)重建術(shù)的實(shí)驗(yàn)組大鼠則可看到根管內(nèi)有豐富的血管新生，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，在組織結(jié)構(gòu)上更接近正常牙髓結(jié)構(gòu)，表明牙髓血運(yùn)重建術(shù)促進(jìn)了牙髓內(nèi)血管的新生并且減少了炎癥細(xì)胞的浸潤。牙髓血運(yùn)重建術(shù)后3周的RT-PCR結(jié)果顯示：大鼠磨牙組織中VEGF基因表達(dá)水平顯著提高，磨牙組織免疫組化染色結(jié)果也證明牙髓腔內(nèi)出現(xiàn)了比空白組和對照組更大量的VEGF陽性細(xì)胞，證實(shí)了血管的新生。VEGF可促進(jìn)牙髓內(nèi)血管生成，增加牙髓內(nèi)微血管密度。VEGF可能是在牙髓組織破壞時(shí)產(chǎn)生的缺氧條件下分泌的[11-12]。眾所周知，缺氧刺激的HIF-1α是VEGF的有效轉(zhuǎn)錄因子[13]。VEGF可能在牙髓血運(yùn)重建術(shù)后被牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)分泌，從而觸發(fā)局部牙髓血管生成[14]。

4 結(jié)論

本文初步證明，牙髓血運(yùn)重建術(shù)可顯著促進(jìn)大鼠磨牙中VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)牙髓中血管的生成和牙髓組織的修復(fù)，由此提示：VEGF在臨床牙髓壞死和根尖周炎治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià) 值。