RP-HPLC法測定克咳膠囊中嗎啡含量

文鑫鑫，楊 鑫

(黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556000)

貴州益佰制藥的獨家產(chǎn)品克咳膠囊處方中包括以下藥材：麻黃、罌粟殼、甘草等。以上藥材經(jīng)過酸水煎煮、濃縮浸膏、與細粉混勻等工藝精制而成，具有止咳、定喘、祛痰的功效，臨床用于咳嗽、喘急氣粗。處方中的罌粟殼的主要有效成分為生物堿嗎啡，具有成癮性?，F(xiàn)標準WS3-B-3215-98收載于衛(wèi)生部藥品標準《中藥成方制劑》第十七冊[1]，其先行質(zhì)量標準中無含量測定項，質(zhì)量可控性差，無法滿足生產(chǎn)質(zhì)控要求。本次實驗首次以嗎啡為檢測指標對克咳膠囊建立高效液相色譜法測定含量，測定15批次止咳膠囊嗎啡含量，擬定合理限度范圍。按照《中國藥典》2020版四部通則[2]進行方法學驗證，結(jié)果顯示該方法操作簡單快速，精密度高、重復性好、結(jié)果準確，能夠有效控制止咳膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量。為止咳膠囊質(zhì)量標準的提升提供了科學數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，2998 PDA檢測器，工作站(Empower3)；梅特勒XPE205，XPR36電子天平；SK8200HP型數(shù)控超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇、磷酸(重慶川東化工)，1-庚烷磺酸鈉(廣東翁江試劑)，磷酸二氫鉀(天津科密歐試劑)均為分析純試劑試藥，乙腈為Fisher色譜純；嗎啡對照品購于中檢院，批號為171201-201825，供HPLC含量測定時含量為93.6%)，15批樣品及缺罌粟殼的陰性樣品由貴州益佰制藥有限公司提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

以辛烷基鍵合硅膠柱為分析色譜柱，本實驗選用Agilent ZORBAX SB-C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液進行等量混合(用磷酸溶液調(diào)pH至2.8)87 mL與乙腈13 mL混合；210 nm檢測；進樣10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取供試品10粒的內(nèi)容物，混勻，精密稱取約0.5 g，置25 mL容量瓶中，加含5%醋酸的20%甲醇溶液約15 mL，搖勻，超聲處理30 min(53 kHz，500 W)，放冷至室溫，用含5%醋酸的20%甲醇溶液稀釋到刻度，搖勻，離心，過濾即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取嗎啡對照品適量，加“2.3”項下溶劑溶解并稀釋制成最終濃度為每1 mL約含38 μg嗎啡的溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

取由貴州益佰制藥制備的缺罌粟殼的陰性樣品按照“2.2”項下方法制備即得。

2.5 專屬性實驗

分別取上述三種溶液，按照“2.1”項下測定，結(jié)果見圖1，表明本方法專屬性良好，嗎啡出峰處無其他峰干擾。

圖1 專屬性色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱取嗎啡適量(5.232 mg)，置50 mL量瓶中，加“2.2”項下溶劑溶解并稀釋至刻度，制得嗎啡對照品貯備液(0.097943 mg/mL)。吸取該儲備溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL至10 mL容量瓶，用上面相同的溶劑稀釋至刻度即得。按照“2.1”項下測定，以峰面積A為縱坐標，嗎啡濃度(μg/mL)為橫坐標，進行線性回歸計算，線性范圍為9.7943～58.7658 μg/mL，線性回歸方程為：

A=47793.61674C-894.57560，R2=0.99993

將第二點及最后一點的峰面積代入上述回歸方程所得濃度與配制濃度相比，相對標準偏差分別為0.00545、0.22%，均相當小，故可認為過原點?？捎猛鈽艘稽c法進行含量測定計算。

2.7 精密度試驗

取“2.3”項下制備的對照品溶液(濃度為0.039177 mg/mL)，吸取10 μL按照“2.1”下方法重復進樣6次，嗎啡的平均峰面積RSD為0.26%(遠小于2.0%)，說明精密度符合要求。

2.8 重復性試驗

分別取克咳膠囊(批號：210212)約0.5 g各6份，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，按照“2.2”項下方法平行制備得到供試品溶液6份，在“2.1”條件測定，得到6份的平均值為0.505 mg/粒，RSD為1.34%(小于2.0%)，說明重復性符合要求。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取6份已知含量的樣品(該批次樣品嗎啡含量為1.16 mg/g)0.25 g，置25 mL容量瓶中，精密加入對照品溶液(嗎啡為0.2109 mg/mL)2 mL，按“2.2”項下方法制備，吸取10 μL在“2.1”條件下進行測定，6份回收率平均值為100.9%，RSD為0.57%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.10 穩(wěn)定性試驗

取2.8項下的供試品溶液，分別于0 h、1 h、2 h、8 h、16 h、32 h、48 h進樣測定嗎啡峰面積，RSD為0.16%，說明供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 耐用性試驗

取同一份對照和供試品溶液在不同儀器不同柱子上進行考察：柱子1：色譜柱，Agilent ZORBAX SB-C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，使用儀器：Waters e2695高效液相色譜儀。柱子2：資生堂色譜柱C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，儀器：賽默飛U3000高效液相色譜儀。柱子3：普寧科技色譜柱C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，使用儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀，結(jié)果RSD為1.86%，說明該方法耐用性好。

2.12 樣品測定

取15批克咳膠囊，按《中國藥典》2020版四部通則得到平均裝量，按上述方法制備供試品溶液及測定，結(jié)果15批樣品平均含量為0.516 mg/粒。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

吸取對照和供試品溶液分別注入液相色譜儀，按照上述條件測定。結(jié)果表明：對照品嗎啡峰的光譜圖與供試品中嗎啡峰的光譜掃描圖基本一致。對照品與供試品嗎啡峰的掃描圖均在209.6 nm處有最大吸收，且兩者峰形也幾乎一致，并且達到純度要求。

3.2 提取方法選擇

嘗試3種提取方式，分別是方法1：用氨水飽和的氯仿提取，水浴蒸干，甲醇溶解；方法2：含5%醋酸的20%甲醇溶劑超聲30 min提取[2]；方法3：含5%醋酸的20%甲醇溶劑水浴回流提取1 h；結(jié)果方法1含量0.163 mg/粒，方法2含量0.511 mg/粒，方法3含量為0.524。方法2和方法3含量差不多，但是方法2簡單、易操作，故采用方法2。

3.3 流動相及色譜柱的確定

嗎啡等生物堿類物質(zhì)為了能夠使其在色譜柱中保留更好，流動相一般要加入離子對試劑，故嗎啡HPLC含量測定的流動相從以下3種選擇[3]：0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液等量混合(磷酸溶液調(diào)pH至2.8)87 mL與乙腈13 mL混合，乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸鈉-0.02 mol/L磷酸氫二鉀溶(20∶40∶40)，乙腈-0.1%磷酸(12∶88)(含0.1%庚烷磺酸鈉)[3]等，經(jīng)過摸索，3種流動相比例樣品的分離效果都可以，第一種流動相比例下嗎啡峰保留時間合適(14 min左右)，色譜峰形好，對稱因子合適(0.95～1.05)，故選第一種流動相。

3.4 小結(jié)

處方中的罌粟殼所含有效成分嗎啡是止咳的有效成分，但是具有成癮性，該方法操作簡便，節(jié)約了提取溶劑消耗，加快了提取時間，方法重復性好，結(jié)果準確可靠，可用于克咳膠囊中嗎啡含量的測定。