RIN1表達上調(diào)對腎透明細胞癌診斷及預后的影響

劉 宇，王涌泉，李丹濱

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全世界每年約有超過140 000人死于ccRCC[1]。ccRCC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，因其對化療藥物不敏感，臨床上常見的治療方法主要為手術治療及免疫治療[2-4]。

Ras和Rab相互作用因子1(Ras and Rab interactor 1，RIN1)位于染色體11q13.2處，為Ras效應蛋白，且該基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與激活的H-Ras具有高親和力和高度特異性[5]。最近的研究證明了RIN1在介導信號轉(zhuǎn)導中具有重要作用。除了活化Ras蛋白外，還可激活Rab5、ABL酪氨酸激酶以及表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)，從而調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導和細胞遷移[6]。已有研究證實RIN1在多種腫瘤中異常表達并與腫瘤患者的預后相關，可能成為腫瘤診斷和治療的標記物[7]。本文分析了RIN1的表達與ccRCC患者發(fā)生、發(fā)展的關系。此外，利用基因富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)從功能角度探討了RIN1差異與ccRCC不良預后的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)下載TCGA-KIRC數(shù)據(jù)從TCGA官方網(wǎng)站下載(https://cancergenome.nih.gov/)，包括mRNA表達數(shù)據(jù)和臨床資料。共獲得72例正常腎臟組織和539例ccRCC組織，并整合ccRCC患者的臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、生存狀態(tài)、總生存期、分級、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和遠處轉(zhuǎn)移。

1.2 RIN1的蛋白表達分析UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)整合了來自CPTAC數(shù)據(jù)庫的蛋白表達數(shù)據(jù)[8]，使用UALCAN數(shù)據(jù)庫查詢并分析RIN1蛋白在正常腎臟組織和ccRCC組織中的相對表達。人蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/，HPA)包含正常腎臟組織和腫瘤組織的免疫組化信息[9]，利用本數(shù)據(jù)庫查詢RIN1在正常腎臟組織和ccRCC組織的免疫組化染色結(jié)果。

1.3 GSEA分析為了研究RIN1在ccRCC中的潛在功能，根據(jù)RIN1表達中位數(shù)分為高低兩組，針對兩組的差異基因依據(jù)表達情況對基因進行排序，然后利用c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt數(shù)據(jù)集對兩組進行富集。每次分析的基因集排列數(shù)設為1 000，表型標記為RIN1的表達水平。P<0.05和FDRq<0.05的基因集被視為顯著富集。

1.4 統(tǒng)計學分析所有統(tǒng)計分析均采用R軟件(3.6.3)進行。采用非參數(shù)檢驗(Wilcoxon test)對正常腎臟組織和ccRCC組織進行差異表達分析。為了檢驗RIN1的表達與相關臨床特征的關系，使用Mann-WhitneyU檢驗進行兩組比較，采用Kruskal Wallis秩和檢驗和Bonferroni校正檢驗進行多組比較。用Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗比較RIN1高表達組和低表達組的總體生存率。采用單因素和多因素Cox回歸分析評價RIN1的表達在ccRCC中的獨立預后價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 RIN1在ccRCC中表達上調(diào)并與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展相關與72例正常腎臟組織相比，539例ccRCC組織中RIN1表達顯著上調(diào)(P<0.001，圖 1A)。其中在72例ccRCC配對樣本組織中RIN1的表達也顯著高于正常組織(P<0.001，圖1B)。RIN1上調(diào)對ccRCC的診斷價值也通過受試者操作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線得到證實，曲線下面積(area under curve，AUC)為0.916，P<0.001(圖1C)。Kaplan-Meier曲線顯示RIN1高表達的ccRCC患者的預后比RIN1低表達的ccRCC患者差(圖1D)。

A： RIN1在ccRCC和正常腎臟組織的表達情況；B： 在72對配對組織中，ccRCC組織RIN1表達顯著上調(diào)；C：RIN1上調(diào)對ccRCC診斷價值的ROC曲線；D：RIN1高表達與低表達的ccRCC患者預后的Kaplan-Meier曲線。

2.2 RIN1蛋白在ccRCC組織中表達上調(diào)分析UALCAN數(shù)據(jù)庫顯示ccRCC組織中RIN1蛋白表達顯著高于正常組織(P<0.001，圖 2A)。此外，從HPA數(shù)據(jù)庫中檢索免疫組化染色數(shù)據(jù)，研究RIN1在蛋白質(zhì)水平上的表達，結(jié)果顯示正常腎臟組織中腎小管細胞和腎小球細胞抗體染色程度均為低水平，而ccRCC組織中呈中等水平(圖 2B)。由此進一步證實，在ccRCC組織中RIN1蛋白表達上調(diào)。

A：UALCAN數(shù)據(jù)庫中RIN1蛋白的表達情況；B：HPA數(shù)據(jù)庫中RIN1的免疫組化情況。

2.3 RIN1表達與ccRCC患者臨床特征的關系對TCGA-KIRC的臨床特征進行了整合并統(tǒng)計TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和遠處轉(zhuǎn)移(表1)。對TCGA數(shù)據(jù)庫的ccRCC患者進行了RIN1表達與臨床特征相關性分析。如圖3A～E所示，RIN1表達上調(diào)與臨床分級(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、腫瘤大小(P<0.001)、淋巴結(jié)狀態(tài)(P<0.001)和遠處轉(zhuǎn)移(P<0.001)顯著相關。

表1 來自TCGA中腎透明細胞腎癌患者的臨床特征

2.4 RIN1表達是ccRCC患者的獨立預后因子以RIN1表達中位數(shù)為準進行高、低表達分組，Kaplan-Meier生存分析表明，高表達RIN1的ccRCC患者總生存率較低表達RIN1的ccRCC患者差(P<0.001，圖1D)。單因素Cox回歸分析顯示RIN1的表達上調(diào)及年齡、分級、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠處轉(zhuǎn)移等臨床特征均與ccRCC預后不良密切相關。此外，多因素Cox回歸分析顯示RIN1表達上調(diào)、年齡與ccRCC預后不良獨立密切相關(表2)，因此RIN1可能作為ccRCC患者的獨立預后標志物。

2.5 RIN1在影響ccRCC預后中的作用機制鑒于RIN1可能作為ccRCC的獨立預后標志物，我們依據(jù)RIN1表達進行高低風險分組，組間差異分析獲得差異基因，采用GSEA方法進行KEGG功能富集分析，結(jié)果顯示高表達RIN1組主要富集并上調(diào)了DNA復制、細胞外基質(zhì)受體相互作用、NOTCH信號通路和P53信號通路等相關途徑(圖4)，這為揭示ccRCC患者預后不良的潛在機制提供了有效的研究途徑。

A：分級；B：TNM分期；C： 腫瘤大?。籇：淋巴結(jié)狀態(tài)；E：遠處轉(zhuǎn)移。

表2 使用單因素及多因素Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)庫中ccRCC患者總生存率相關的臨床特征

圖4 GSEA顯示的KEGG通路富集圖

3 討 論

RIN1為蛋白質(zhì)編碼基因，作為Ras效應蛋白在不同水平影響Ras信號。首先，可通過與RAF1蛋白競爭結(jié)合激活的Ras。第二，通過增強來自ABL酪氨酸激酶1和酪氨酸激酶2的信號來調(diào)節(jié)細胞骨架重塑。第三，通過激活Rab5A，充當Rab5A的鳥嘌呤核苷酸交換因子，將結(jié)合的GDP交換為游離的GTP，并促進Ras激活受體胞吞作用[10]。研究表明，RIN1可與Rab25(關鍵GTP酶)相互作用，激活ccRCC中的EGFR信號傳導，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[11]。本研究發(fā)現(xiàn)RIN1的mRNA水平在ccRCC中表達顯著上調(diào)，且UALCAN和HPA在線數(shù)據(jù)庫驗證RIN1在蛋白水平的表達方面也顯著上調(diào)。RIN1的表達上調(diào)與腫瘤分級、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠處轉(zhuǎn)移以及總生存率均顯著相關。單因素和多因素回歸分析也驗證了其可作為ccRCC患者的獨立預后因素。本研究利用高通量、多組學數(shù)據(jù)，探討研究了RIN1在ccRCC組織中的表達和預后關系，經(jīng)生物信息學精準分析表明RIN1可以作為ccRCC新的診斷、預后標記物。

最后利用GSEA分析，預測RIN1與ccRCC發(fā)生、發(fā)展及預后中起重要作用的途徑。結(jié)果表明RIN1參與了多種與腫瘤進展相關的途徑，如DNA復制、細胞外基質(zhì)受體相互作用、NOTCH信號通路和P53信號通路。已有研究證實以上信號通路與ccRCC的生物學行為密切相關，特別是NOTCH信號通路在ccRCC中廣泛激活，并介導腫瘤細胞的惡性增殖，抑制NOTCH信號通路激活可能成為ccRCC的治療靶點[12]。DNA復制、細胞外基質(zhì)受體相互作用和P53信號通路也與ccRCC的發(fā)生、增殖與轉(zhuǎn)移密切相關[13-14]，但RIN1是如何通過以上信號通路影響ccRCC的生物學行為需要深入研究。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)RIN1在ccRCC中表達上調(diào)與臨床特征密切相關，并能夠獨立預測預后不良，這表明RIN1有望成為ccRCC的診斷標志物和潛在的治療靶點。然而，具體的機制研究有待進一步開展。