五種中草藥復(fù)方體外激活花鰻鱺(Anguilla marmorata)外周血白細(xì)胞活性的評(píng)價(jià)*

李忠琴 張新艷 楊求華 林 茂 江興龍 翟少偉①

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 福建廈門(mén) 361021; 2. 福建省淡水水產(chǎn)研究所 福建福州 350002; 3. 福建省水產(chǎn)研究所 福建廈門(mén)361012; 4. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心 福建廈門(mén) 361021)

花鰻鱺(Anguilla marmorata)為典型的降河洄游魚(yú)類(lèi), 隸屬于硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)、鰻鱺目(Anguilliformes)、鰻鱺科(Anguillidae)、鰻鱺屬(Anguilla), 俗名又稱(chēng)花鰻、鱸鰻、雪鰻、鱔王、烏爾鰻等(Wanget al, 2016), 主要生活在西太平洋和印度洋的熱帶、亞熱帶的近海淡水區(qū)域(Huanget al,2016)。中國(guó)本土野生花鰻鱺受到水資源污染, 過(guò)度捕撈等危害, 苗種資源日漸枯竭, 于1988 年被中國(guó)列為瀕危物種, 是國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物(陳健榮等,2018)。目前中國(guó)推廣養(yǎng)殖的花鰻鱺魚(yú)苗主要來(lái)自菲律賓等東南亞海域。相對(duì)于日本鰻鱺等傳統(tǒng)鰻鱺品種,花鰻鱺的苗種儲(chǔ)備豐富, 價(jià)格低, 養(yǎng)殖利潤(rùn)較高, 有助于應(yīng)對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖品種單一的難題, 填補(bǔ)鰻苗市場(chǎng)空缺?；狑~的養(yǎng)殖勢(shì)頭良好, 但由于集約化養(yǎng)殖的弊端和養(yǎng)殖技術(shù)的局限, 養(yǎng)殖過(guò)程中容易受到環(huán)境、管理、營(yíng)養(yǎng)、疾病等因素的影響而感染疾病(于海振,2014)。防治花鰻鱺疾病一般使用抗生素類(lèi)化學(xué)藥物,這類(lèi)藥物抑菌效果顯著, 但是如果使用不當(dāng), 會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)抗藥菌株的增加、細(xì)菌耐藥性增強(qiáng), 而抗生素殘留問(wèn)題導(dǎo)致的水產(chǎn)品安全性問(wèn)題也對(duì)鰻鱺出口有著嚴(yán)重影響, 危害食用人群的身體健康。

中草藥作為漁用合成藥物、抗生素等藥用添加劑的安全有效的替代品, 對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)具有免疫增強(qiáng)、抗炎、誘食、促消化和促生長(zhǎng)等功效(路晶晶等, 2018; Huet al, 2019)。其配制形式可分為兩種, 一種是以單味中藥的形式添加到飼料中, 該形式對(duì)動(dòng)物的作用具有偏向性, 只能發(fā)揮部分功效; 另一種是配伍多種具有不同功效的中草藥, 以復(fù)方的形式添加到飼料中,該形式能同時(shí)兼顧多種功效, 比單味中藥更高效、更全面。目前, 中草藥復(fù)方在漁業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越常見(jiàn),而評(píng)價(jià)中草藥復(fù)方的藥效是中草藥應(yīng)用推廣過(guò)程中不可缺少的環(huán)節(jié)。

魚(yú)類(lèi)白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)是指白細(xì)胞吞噬病原微生物后的一種氧依賴(lài)的殺傷機(jī)制, 可以作為評(píng)價(jià)機(jī)體殺滅被吞噬進(jìn)白細(xì)胞的有害物質(zhì)能力的指標(biāo)(程鎮(zhèn)燕等, 2017)。血細(xì)胞中的嗜中性顆粒白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞擁有著強(qiáng)大的吞噬作用, 在機(jī)體非特異性免疫機(jī)制中有必不可少的作用(王曉雯等, 2017)。本實(shí)驗(yàn)使用非連續(xù)性密度梯度離心法優(yōu)化花鰻鱺外周血白細(xì)胞的分離體系, 采用染色觀察法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各分離液中白細(xì)胞濃度。采用NBT 法和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)活性和吞噬能力, 旨在評(píng)價(jià)五種中草藥復(fù)方對(duì)花鰻鱺外周血白細(xì)胞的激活作用,明確中草藥復(fù)方對(duì)花鰻鱺的白細(xì)胞是否具有免疫促進(jìn)作用, 為中草藥復(fù)方在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研制與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

五種中草藥復(fù)方為鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心自主研制, 均以主成分命名, 分別為多糖(Dt)復(fù)方、白頭翁(Btw)復(fù)方、板藍(lán)根(Blg)復(fù)方、大黃(Dh)復(fù)方、百里酚(Blf)復(fù)方, 分別用5%二甲基亞砜溶解成1.0 mg/mL, 3 000 r/min 離心5 min, 取上清備用?；狑~(200 g±9.7 g), 購(gòu)自福建省龍巖大泉鰻魚(yú)養(yǎng)殖有限公司。

1.2 花鰻鱺外周血白細(xì)胞的分離

1.2.1 花鰻鱺血樣制備 丁香油麻醉花鰻鱺, 用經(jīng)3 000 U/mL 肝素鈉浸潤(rùn)的注射器從花鰻鱺尾靜脈取血1 mL, 加入兩倍體積的細(xì)胞培養(yǎng)基, 混勻, 4 °C保存待用。

1.2.2 花鰻鱺外周血白細(xì)胞的分離 用生理鹽水將 Percoll 分離液配制成 20% (1.031 g/mL)、30%(1.043 g/mL)、40% (1.056 g/mL)、50% (1.067 g/mL)、60% (1.090 g/mL) 5 個(gè)不連續(xù)密度梯度, 分別取0.5 mL 各密度的分離液于不同的1.5 mL 離心管中,沿管壁小心緩慢加入上述血液樣品1 mL, 每個(gè)密度重復(fù)三管, 室溫400g離心20 min。取上清, 等體積加入細(xì)胞培養(yǎng)基, 混勻制成白細(xì)胞懸液。

1.2.3 白細(xì)胞計(jì)數(shù) 取20 μL 上述白細(xì)胞懸液于血球計(jì)數(shù)板中, 加入20 μL 吉姆薩(Giemsa)染色液,顯微鏡上計(jì)數(shù)每個(gè)密度梯度分離液中白細(xì)胞; 另取100 μL 白細(xì)胞懸液, 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)白細(xì)胞濃度, 綜合分析并選擇最適密度的分離液分離花鰻鱺外周血白細(xì)胞。

1.3 白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

在96 孔板中, 每一行為一組, 每組分為兩個(gè)亞組(L, N), 每個(gè)亞組3 個(gè)孔, 第一行(A 行)作為空白組,其余各行(B～F 行)為實(shí)驗(yàn)組。96 孔板每孔加入100 μL 1.0×105cell/mL 白細(xì)胞懸液, A 行加入100 μL PBS 緩沖液, B～F 行分別加入Dt、Btw、Blg、Dh 和Blf 共5種1.0 mg/mL 中草藥復(fù)方, 每孔用PBS 緩沖液補(bǔ)齊到300 μL。室溫孵育2 h 后去上清100 μL, 用細(xì)胞培養(yǎng)基100 μL 清洗三次。L 亞組每孔加50 μL 細(xì)胞培養(yǎng)基和50 μL PBS 緩沖液, N 亞組每孔加入50 μL 0.2%NBT 溶液和50 μL 細(xì)胞培養(yǎng)基, 室溫孵育1 h。每孔去上清100 μL, 加入100 μL 甲醇固定3 min, 去上清100 μL, 再用100 μL 70%甲醇清洗3 次, 小心吸走孔內(nèi)所有液體, 室溫風(fēng)干, 每孔加入100 μL 2 mol/L 氫氧化鉀和200 μL 二甲基亞砜, 酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD630nm值。

分別計(jì)算每組的相對(duì)呼吸暴發(fā)活性(SPO)、實(shí)驗(yàn)組相較于空白組的呼吸暴發(fā)提高率NBT%。

式中, ODN: 使用酶標(biāo)儀檢測(cè)N 亞組在波長(zhǎng)630 nm 處的 OD 值; ODL: 使用酶標(biāo)儀檢測(cè) L 亞組在波長(zhǎng)630 nm 處的OD 值。

1.4 白細(xì)胞的吞噬活性測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定白細(xì)胞的吞噬活性: 分別取5 種1.0 mg/mL 中草藥復(fù)方藥液100 μL 于不同的離心管中,每種藥液設(shè)置3 個(gè)重復(fù), 作為5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 另取100 μL 5%二甲基亞砜于另外3 個(gè)離心管中, 作為空白對(duì)照。每管加入200 μL 1.0×105cell/mL 白細(xì)胞懸液, 孵育2 h,每管加入20 μL 用生理鹽水100 倍稀釋的熒光微球溶液,避光孵育1 h, 依次使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

圖1 為以參數(shù)前向散射角(forward scatter, FSC)為x軸, 側(cè)向散射角(side scatter, SSC)為y軸建立的散點(diǎn)圖, 分別代表細(xì)胞的復(fù)雜程度和大小, 圖2 為FITC直方圖(橫坐標(biāo)代表細(xì)胞的大小, 縱坐標(biāo)代表細(xì)胞的豐富度)。分別計(jì)算白細(xì)胞吞噬率、發(fā)生吞噬白細(xì)胞率, 公式如下:

圖1 花鰻鱺白細(xì)胞吞噬反應(yīng)的SSC/FSC 二維散點(diǎn)圖Fig.1 SSC/FSC two-dimensional scatter plot of phagocytosis in A. marmorata

圖2 花鰻鱺白細(xì)胞吞噬反應(yīng)的FITC 直方圖Fig.2 FITC histogram of phagocytosis in A. marmorata

式中,M1、M2: 未被吞噬的熒光微球顆粒數(shù),M1中的每個(gè)顆粒包含1 個(gè)熒光微球,M2中每個(gè)顆粒包含2 個(gè)熒光微球;N: 所有發(fā)出熒光的顆粒數(shù);N1: 檢測(cè)得到的顆粒總數(shù);N2: 熒光微球顆?？倲?shù);P1～P5: 分別表示發(fā)出單個(gè)、2 個(gè)、3 個(gè)、4 個(gè)和5 個(gè)熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù), 一個(gè)熒光強(qiáng)度代表一個(gè)熒光微球顆粒。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析處理, Duncan 法進(jìn)行多重比較, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 花鰻鱺外周血白細(xì)胞的分離

兩種測(cè)定白細(xì)胞濃度方法的結(jié)果如圖3, 花鰻鱺外周血在20%、30%、40%、50%、60%這5 個(gè)密度梯度的Percoll 分離液的作用下, 分離獲得的白細(xì)胞的數(shù)量隨著Percoll 分離液的密度下降而不斷減少,即20%＜30%＜40%＜50%＜60%, 其中, 30%和40%的密度獲得的白細(xì)胞數(shù)量都是在105cell/mL 左右, 而流式細(xì)胞儀要求上機(jī)顆粒濃度在105cell/mL 左右更具精確性, 因此, 30%和40%的兩個(gè)分離液密度更加適合本實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)比兩種計(jì)數(shù)方法, 可以看到, 染色法計(jì)算得出的白細(xì)胞數(shù)量普遍小于流式細(xì)胞術(shù), 但是相差不超過(guò)10%, 隨著分離液梯度變化的規(guī)律也一致, 重復(fù)性良好, 符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 各比例梯度的Percoll 分離液分離花鰻鱺外周血白細(xì)胞的效果Fig.3 Separation of leukocyte from A. marmorata peripheral blood by Percoll separation solution in different density gradients

2.2 五種中草藥復(fù)方對(duì)花鰻鱺白細(xì)胞氧呼吸暴發(fā)活性的影響

5 種中草藥復(fù)方對(duì)花鰻鱺白細(xì)胞的氧呼吸暴發(fā)活性的影響結(jié)果如圖4, NBT%為各中草藥復(fù)方與空白組比較的相對(duì)呼吸暴發(fā)活性提高率。5 種中草藥復(fù)方皆在不同程度上提高了花鰻鱺外周血白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)活性, 呼吸暴發(fā)活性大小依次為Blg＞Dt＞Btw＞Blf＞Dh, 其中 Blg 組和 Dt 組的 NBT%分別高達(dá)1 030.00%和728.57%, 約為空白組的10 倍和7 倍, 均極顯著高于Dh 和Blf 組(P＜0.01)。Btw 組的NBT%為413.00%, 是空白組的 4 倍, 并顯著高于 Dh 組(P＜0.05), 與Blf 組差異不顯著(P＞0.05), 在該實(shí)驗(yàn)中,Dt 組、Btw 組和Blg 組對(duì)花鰻鱺白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)活性的促進(jìn)效果最佳。

圖4 五種中草藥復(fù)方與花鰻鱺白細(xì)胞孵育后的呼吸暴發(fā)活性Fig.4 Respiratory burst activity of A. marmorata leukocyteafter incubation with five Chinese herbal compounds

2.3 五種中草藥復(fù)方對(duì)花鰻鱺白細(xì)胞吞噬能力的影響

從兩個(gè)方面評(píng)價(jià)5 種中草藥復(fù)方對(duì)花鰻鱺外周血白細(xì)胞的吞噬能力, 結(jié)果如圖5 所示, 發(fā)生吞噬白細(xì)胞率代表發(fā)生吞噬活動(dòng)的白細(xì)胞的百分?jǐn)?shù), 花鰻鱺白細(xì)胞經(jīng)過(guò)藥液的孵育后, 發(fā)生吞噬白細(xì)胞率均有提高, 大小依次為Dt＞Btw＞Blg＞Dh＞Blf ＞空白, 但每組間的差異不顯著(P＞0.05)。白細(xì)胞吞噬率代表白細(xì)胞在同樣微球濃度的溶液體系中吞噬微球總量的百分?jǐn)?shù), 可以看出, 5 種中草藥復(fù)方均較大程度上提高了白細(xì)胞吞噬率, 由大到小依次為Dt＞Blg＞Btw＞Dh＞Blf ＞空白, 其中Dt 組的白細(xì)胞吞噬率與空白組的差異極顯著(P＜0.01), Blg 組顯著高于空白組(P＜0.05), Btw、Dh 和Blf 組的白細(xì)胞吞噬率雖然高于空白組, 但差異不顯著(P＞0.05)。

圖5 五種中草藥復(fù)方對(duì)花鰻鱺白細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.5 Effects of five Chinese herbal compounds on the phagocytosis of leukocyte from A. marmorata

3 討論

3.1 Percoll 細(xì)胞分離液分離花鰻鱺外周血白細(xì)胞的條件優(yōu)化

生物種類(lèi)不同, 血細(xì)胞組成和每種血細(xì)胞含量也有所不同, 因此針對(duì)不同的生物類(lèi)型, 應(yīng)選擇適合的血細(xì)胞分離條件。國(guó)內(nèi)外有許多學(xué)者對(duì)不同魚(yú)類(lèi)的白細(xì)胞分離條件進(jìn)行了調(diào)整與優(yōu)化, 如半滑舌鰨(郝爽等, 2018)、鯉魚(yú)(豐培金等, 2004)和真鯛(孫修勤,2000)等。測(cè)定白細(xì)胞呼吸暴發(fā)活性和吞噬活性要求實(shí)驗(yàn)白細(xì)胞濃度在105cell/mL 左右, 濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀檢測(cè)的精確性和準(zhǔn)確性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證, 30%和40%的密度獲得的花鰻鱺外周血白細(xì)胞數(shù)量在105cell/mL 左右, 符合實(shí)驗(yàn)要求。因此在正式的白細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)中, 采取40%和30%分離液上下層疊加的體系。白細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞種類(lèi)應(yīng)為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等具有吞噬作用的白細(xì)胞。而該體系下得到的白細(xì)胞除了這類(lèi)吞噬細(xì)胞外還存在血小板等其他不具有吞噬作用的血細(xì)胞, 使得實(shí)驗(yàn)獲得的發(fā)生吞噬白細(xì)胞率偏低。這一點(diǎn)在豐培金等(2004)的研究中得到證實(shí), 在同一離心管中疊加不同密度的細(xì)胞分離液分離鯉魚(yú)外周血白細(xì)胞, 并鑒定了各液層分離出來(lái)的白細(xì)胞種類(lèi), 發(fā)現(xiàn)每種血細(xì)胞(紅細(xì)胞除外)在各個(gè)液層皆有分布, 但濃度比例各異。因此, 在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中, 應(yīng)尋求能更準(zhǔn)確分離具有吞噬作用白細(xì)胞的方法, 以提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精確度。

3.2 白細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)方法的比較

本研究在對(duì)Percoll 分離液密度優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)中,使用了兩種方法計(jì)數(shù)白細(xì)胞濃度, 分別為染色觀察法和流式細(xì)胞術(shù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 流式細(xì)胞術(shù)比染色觀察法計(jì)算得出的白細(xì)胞數(shù)量多。究其原因是使用血涂片在顯微鏡下計(jì)數(shù), 準(zhǔn)確性不高, 誤差大, 且費(fèi)時(shí)費(fèi)力; 再者, 染色劑本身的局限性使得著色的白細(xì)胞種類(lèi)不完全, 而流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于儀器的檢測(cè)通道僅允許顆粒依次通過(guò), 不但能快速而準(zhǔn)確地定量, 還能根據(jù)顆粒的各種屬性進(jìn)行分選分析, 因此能捕捉到常規(guī)染色法中未能被染色劑著色的白細(xì)胞, 既有準(zhǔn)確性又有針對(duì)性, 還省時(shí)省力,檢測(cè)更全面。

由于流式細(xì)胞術(shù)有強(qiáng)大的分選功能, 近些年來(lái),國(guó)內(nèi)外許多科學(xué)家應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)精確區(qū)分了許多類(lèi)型的白細(xì)胞。Faucher 等(2007)使用流式細(xì)胞術(shù)成功區(qū)分了中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞等白細(xì)胞類(lèi)型, 但未能完全識(shí)別淋巴細(xì)胞亞群。Van De Geijn等(2011)同樣采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出漿細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群等, 分類(lèi)更加全面。陽(yáng)晶等(2015)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)從混合細(xì)胞群中分選活的衰老細(xì)胞。王新等(2013)發(fā)展并優(yōu)化了一套操作簡(jiǎn)便、效率較高的流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)分選轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的熒光標(biāo)記細(xì)胞。在今后的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中, 可研究使用流式細(xì)胞儀有效分選出具有吞噬作用的花鰻鱺白細(xì)胞, 省去體外分離白細(xì)胞的繁瑣步驟, 直接在儀器上選擇特定細(xì)胞群, 并分析細(xì)胞群的特定功能; 還可以研究選用微流控芯片全自動(dòng)裝置來(lái)檢測(cè)和分選白細(xì)胞(宋振玉等, 2015)。

3.3 五種中草藥復(fù)方對(duì)激活白細(xì)胞免疫作用的影響

本實(shí)驗(yàn)中用于篩選的五種中草藥復(fù)方分別由多糖、白頭翁、板藍(lán)根、大黃、百里酚為主要成分, 配伍多種中藥免疫活性物質(zhì)制作而成。多糖主要具有抗氧化、抗病毒、提高免疫力等活性(孟祥云等, 2018),在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治研究中的用途非常廣泛, 如當(dāng)歸多糖(譚連杰等, 2018)、海帶多糖(林建斌等,2017)、黃芪多糖(章燕鈴等, 2021) 分 別對(duì)卵形鯧 鲹、大黃魚(yú)、黃鱔等都有免疫增強(qiáng)的作用。白頭翁中的五環(huán)三萜皂苷類(lèi)化合物是影響其藥理學(xué)活性的主要成分, 具有抗菌、抗炎、促進(jìn)免疫以及抗血吸蟲(chóng)病等作用(李春曉等, 2018); 夏與晴等(2019)研究表明白頭翁針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的5 種致病菌有良好的抑菌效果。板藍(lán)根具有清熱解毒、抗病毒和涼血利咽等功效,彭翔等(2013)用不同濃度的板藍(lán)根濃縮液拌料投喂施氏鱘幼魚(yú), 發(fā)現(xiàn)其抗氧化酶活性、補(bǔ)體C3 和抗體IgM有一定的提高。大黃以清熱、延緩衰老成分和消炎抑菌等功效著稱(chēng)于世, 李忠琴等(2012)檢測(cè)大黃對(duì)5 株從病鰻中分離出來(lái)的氣單胞菌的最低抑菌濃度, 有很好的抑菌效果, 最低抑菌濃度僅為0.75～1.50 mg/mL。百里酚來(lái)源于百里香、麝香草等植物, 該成分具有抗氧化、抑菌抗炎和防腐等功效, 百里酚目前應(yīng)用于水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)疾病的研究較少。在食品研究中, 裴海閏等(2011)發(fā)現(xiàn)百里酚對(duì)大豆油有較強(qiáng)的抗氧化作用, 且對(duì)金黃色葡萄球菌等四株細(xì)菌均有不同程度的抑菌效果。上述5 種復(fù)方主要成分一般有其偏好的功效,與具有其他作用的中藥活性物質(zhì)配伍后, 在一定程度上能擴(kuò)大作用范圍和補(bǔ)充更多的功效。

魚(yú)類(lèi)白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)是指白細(xì)胞吞噬病原微生物后的一種氧依賴(lài)的殺傷機(jī)制, 生成的OCl–具有殺菌效果, 可以殺滅被吞噬進(jìn)白細(xì)胞的有害物質(zhì)。NBT 能與O2-相互作用產(chǎn)生藍(lán)色的甲腙, 甲腙在560 nm 處有最大的峰值。血細(xì)胞中的嗜中性顆粒白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞擁有著強(qiáng)大的吞噬作用, 在機(jī)體非特異性免疫機(jī)制中有必不可少的作用。本實(shí)驗(yàn)研究花鰻鱺白細(xì)胞的免疫活性, 在熒光微球的脅迫下, 白細(xì)胞被藥物激活產(chǎn)生吞噬作用, 分別以發(fā)生吞噬白細(xì)胞率和白細(xì)胞吞噬率來(lái)評(píng)價(jià)。孫曉飛(2014)檢測(cè)了39種單味中藥對(duì)棕點(diǎn)石斑魚(yú)血白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)和吞噬作用, 結(jié)果顯示, 大部分中草藥對(duì)石斑魚(yú)白細(xì)胞免疫作用有增強(qiáng)效果。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 五種復(fù)方均促進(jìn)了花鰻鱺白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)活性, 其中多糖復(fù)方、白頭翁復(fù)方、板藍(lán)根復(fù)方的促進(jìn)效果優(yōu)于大黃復(fù)方和百里酚復(fù)方。五種中草藥復(fù)方影響花鰻鱺白細(xì)胞吞噬率的差異性表現(xiàn)比發(fā)生吞噬白細(xì)胞率突出,其中多糖、白頭翁、板藍(lán)根復(fù)方組的白細(xì)胞吞噬率顯著高于空白組, 且高于大黃復(fù)方和百里酚復(fù)方。在發(fā)生吞噬白細(xì)胞率中, 五種中草藥復(fù)方均高于空白組,但差異并非十分明顯, 原因可能是白細(xì)胞懸液中含有大量不具有吞噬作用的血細(xì)胞, 懸液中細(xì)胞基數(shù)增大, 有吞噬作用的白細(xì)胞比率大大降低, 導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的各復(fù)方之間發(fā)生吞噬白細(xì)胞率差異不顯著。

4 結(jié)論

中草藥免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)的研究已有多年的歷史, 本研究綜合白細(xì)胞的呼吸暴發(fā)和吞噬能力的結(jié)果, 分析五種中草藥復(fù)方對(duì)花鰻鱺白細(xì)胞免疫活性的影響, 其中多糖復(fù)方、白頭翁復(fù)方、板藍(lán)根復(fù)方的體外激活白細(xì)胞免疫活性的效應(yīng)更突出, 作為花鰻鱺免疫增強(qiáng)劑具有良好的推廣應(yīng)用前景, 有助于擴(kuò)大水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)漁藥研制與應(yīng)用的選擇。