香魚(Plecoglossus altivelis)致病性類志賀鄰單胞菌的分離與生化藥敏鑒定*

闞宏玉 苗 亮① 杜 楊① 李明云 鞏曉琳李文雅 孫振南 石海瑞 張立寧

(1. 寧波大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室 浙江寧波 315211; 2. 寧波大學(xué) 水產(chǎn)生物技術(shù)教育部重點實驗室 浙江寧波 315832; 3. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江溫州 325005)

香魚(Plecoglossus altivelis) 隸屬胡瓜魚目(Osmeriformes)、香魚科(Plecoglossidae)、香魚屬(Plecoglossus), 為一年生小型洄游性魚類, 又名油香魚、八月香等, 因肉質(zhì)細嫩, 散發(fā)獨特清香, 被譽為“淡水魚之王”。香魚野生種群主要生活在我國、朝鮮半島、日本等地的沿海溪流中, 從我國遼寧的鴨綠江至廣西的北侖河皆有分布, 但因人工水利工程建設(shè)、棲息地退化等原因, 我國香魚野生種質(zhì)資源已逐漸退化。我國在20 世紀(jì)90 年代已實現(xiàn)香魚的全人工育苗和養(yǎng)殖(李明云等, 1995), 浙江和福建兩省為主養(yǎng)殖區(qū)。

香魚對水質(zhì)非常敏感, 近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大、養(yǎng)殖密度增加、氣候惡劣等因素的影響導(dǎo)致香魚養(yǎng)殖水環(huán)境惡化, 病害頻繁暴發(fā), 給香魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前對香魚病害已有部分研究報道, 日本的香魚養(yǎng)殖業(yè)中常見病害為由嗜冷黃桿菌(Kimet al, 2010a, 2010b; Nakayamaet al, 2016;Shimizuet al, 2016)引起的細菌性冷水病(bacterial cold water disease, BCWD), 患病癥狀為鰓、肝、腎的貧血, 吻部、體側(cè)或尾部組織糜爛和潰瘍, 嚴(yán)重時可見穿孔(Iidaet al, 1996; Okamura, 2013; Kumagai,2016)。我國香魚養(yǎng)殖業(yè)常見病癥為弧菌病(謝鴻偉,2021), 病原為鰻弧菌(李長紅等, 2009), 該病在日本的香魚中偶爾也有發(fā)生(Kannoet al, 1990), 癥狀以體表潰瘍?yōu)橹饕? 其他的癥狀為食欲減退, 浮頭, 離群游動, 腎臟、脾臟腫大等。其他主要病原還有殺香魚假單胞菌(Nishimoriet al, 2000; Kobayashiet al, 2006)、佩魯蘭新副變形蟲(Crosbieet al, 2010)、嗜冷黃桿菌(Dykováet al, 1980)、香魚格留蟲(Zhouet al, 2018)、鲇愛德華氏菌(Nagaiet al, 2008; Sakaiet al, 2008;Hassanet al, 2010)、嗜水氣單胞菌(張呈念等, 2009)等,但對病原感染的致病機理等研究皆不夠深入。

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)是腸桿菌科鄰單胞菌屬的唯一種, 已有該菌造成鯽(Carassius auratus) 、 大 口 黑 鱸 (Micropterus salmoides)、斑點叉尾(Ietalurus punetaus)、江鱈(Lota lota)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、太平洋雙色鰻鱺(Anguilla bicolor pacifica)等多種養(yǎng)殖魚類病害的報道(賴曉健等, 2016; 張效平等, 2018; 傅芳等,2019; 呂小燕等, 2020; 溫周瑞等, 2021; 慶輝等,2022)。類志賀鄰單胞菌在自然界、尤其是養(yǎng)殖水環(huán)境中廣泛存在, 屬于機會性致病菌, 養(yǎng)殖魚一旦發(fā)病將造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失(陳美群等, 2020), 并且該菌可感染畜禽和人(Salernoet al, 2010; 李君萍等,2020)。類志賀鄰單胞菌引起養(yǎng)殖魚類病害通常發(fā)生在夏秋季水溫較高時, 特點是初期感染魚癥狀通常不明顯, 從發(fā)病到出現(xiàn)死亡有較長的潛伏期(數(shù)天至1 個月), 暴發(fā)后的死亡率可達60%～100% (陳美群等,2020)。之前未見該菌引起養(yǎng)殖香魚病害的報道。

2021 年7 月下旬, 第6 號強臺風(fēng)“煙花”過境后,浙江省寧?？h的養(yǎng)殖香魚暴發(fā)病害, 病魚體表潰爛,死亡嚴(yán)重。為了探明本次香魚病害的病原, 我們對病魚進行了組織病理切片觀察和菌株分離, 分離菌株經(jīng)生化特性和分子生物學(xué)鑒定為類志賀鄰單胞菌,回歸感染實驗確認了該菌株為本次香魚病害的病原菌, 隨后對該菌株進行了藥物敏感性實驗和毒力基因、耐藥基因的檢測, 研究結(jié)果可為香魚養(yǎng)殖中病原鑒定及病害防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

患病香魚于2021 年8 月中旬取自寧?？h某養(yǎng)殖場, 為人工養(yǎng)殖的8 月齡香魚[體質(zhì)量(86.9±14.1) g],當(dāng)時正值發(fā)病死亡高峰期, 從養(yǎng)殖水泥池中撈取癥狀明顯的瀕死病魚, 用氧氣包運回實驗室進行取樣。作為對照及用于回歸感染的魚為本實驗室循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖的健康香魚[體質(zhì)量(22.4±1.7) g]。

1.2 組織病理學(xué)觀察

對病魚進行無菌解剖, 剪取鰓、肝、脾、腸、肌肉組織(約5 mm×5 mm×3 mm), 置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h, 之后進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟等步驟, 再進行H.E 染色, 用中性樹脂封片后, 與健康香魚的組織切片一同觀察, 并進行組織病理學(xué)比較。

1.3 菌株分離與保存

以無菌操作取病魚中腸置于滅菌EP 管中, 加入pH=7.0 的滅菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS) 0.5 mL, 將腸組織充分剪碎并震蕩混勻,2 000g離心5 min, 取上清液0.1 mL 涂布在TSA 平板(杭州微生物試劑有限公司)上。將平板置于培養(yǎng)箱中28 °C 培養(yǎng)12 h, 再用劃線法進行分離純化, 然后將單菌落接種在TSB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng), 后將菌液分裝至無菌凍存管中、加入等體積的20%無菌甘油置于–80 °C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離菌株的生化鑒定

使用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)(bioMérieux 公司, 法國)和 VITEK 2 GN 鑒定卡(bioMérieux 公司, 法國)對分離菌株做生化鑒定, 步驟如下: 用無菌棒將菌落從培養(yǎng)基接種至裝有3 mL 無菌0.9%生理鹽水的清潔塑料管中并搖勻, 用比濁儀將菌懸液濃度調(diào)整至0.50～0.63 麥?zhǔn)蠁挝环秶鷥?nèi), 然后將菌懸液管及GN 鑒定卡置于載卡臺上進行檢測。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定與分析

用細菌基因組DNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取分離菌株的基因組DNA, 并將提取后的DNA 濃度調(diào)整至100 ng/μL 作為PCR 模板。用16S rDNA 引物27F/1492R (Edwardset al, 1989)進行PCR擴增。反應(yīng)體系為: 2×Es Taq MasterMix (Dye) (江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司) 10 μL, 上、下游引物各1 μL, DNA 模板0.5 μL, 用無菌水補齊至20 μL。擴增程序為: 95 °C 熱啟動5 min; 95 °C 變性30 s、58 °C 退火30 s、72 °C 延伸90 s, 循環(huán)30 次; 72 °C后延伸10 min。

用 E.Z.N.A Gel Extraction Kit 試劑盒(Omega Bio-tek 公司, 美國)純化PCR 產(chǎn)物后送至由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。對測得序列進行校準(zhǔn)后在NCBI 網(wǎng)站進行BLAST 比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 選取同源性較高的同種菌株的16S rDNA 和同科其他菌種16S rDNA、并以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的16S rDNA 序列作為外群, 用MEGA11 軟件以近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 步長檢驗次數(shù)設(shè)為1 000。

1.6 回歸感染實驗

將純化后的分離菌株接種于TSB 液體培養(yǎng)基中,28 °C 培養(yǎng)18 h。用無菌PBS 沖洗培養(yǎng)物, 計數(shù)后經(jīng)梯度稀釋制成4 個濃度的菌懸液: 1×109、1×108、1×107、1×106CFU/mL。隨機取50 尾健康香魚并按每組10 尾分為5 組, 其中4 組分別腹腔注射不同濃度的菌懸液100 μL, 另1 組作為對照注射PBS 溶液100 μL。每組均設(shè)施3 個重復(fù)。感染實驗共進行7 d,每天觀察記錄各組魚的存活情況。使用改良寇式法(孫瑞元, 1963)計算半致死劑量LD50, 公式為

式中,xmax為最大劑量的對數(shù)值,i為相鄰兩組劑量對數(shù)值的差值, ∑p為各組死亡率總和。

1.7 藥物敏感性試驗

采用紙片擴散法(K-B 法)對分離菌株進行細菌藥敏檢測。將菌液濃度調(diào)整至1×107CFU/mL, 涂布在TSA 平板上。用無菌鑷子夾取抗生素紙片(杭州微生物試劑有限公司)貼在培養(yǎng)基上, 28 °C 培養(yǎng)24 h 后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。共檢測了25 種抗生素藥物的敏感性, 根據(jù)CLSI 發(fā)布的腸桿菌科藥敏試驗判讀標(biāo)準(zhǔn)(CLSI, 2018)和試劑盒說明書中的說明進行藥敏性判讀。

1.8 毒力基因與耐藥基因的檢測

根據(jù)Ekundayo 等(2018)報道的類志賀鄰單胞菌的毒力基因和耐藥基因, 從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲取相關(guān)序列, 用Primer-BLAST 工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計用于擴增毒力基因和耐藥基因的引物(引物信息見表3、表4), 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為: 2×Es Taq MasterMix (Dye) 10 μL, 上、下游引物各1 μL, 菌株DNA 模板0.5 μL, 用無菌水補齊至20 μL。PCR 擴增程序為: 95 °C 熱啟動5 min; 95 °C變性30 s, 55 °C 退火30 s, 72 °C 延伸1 min, 循環(huán)30次; 72 °C 后延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 凝膠成像后根據(jù)各引物擴增條帶的有無判定菌株是否具有該基因。

2 結(jié)果

2.1 病魚解剖和組織病理學(xué)觀察

患病香魚癥狀表現(xiàn)為: 皮膚和肌肉組織潰爛, 潰爛處鱗片和皮膚脫落, 周圍皮膚充血, 肌肉組織突出,肛門紅腫。解剖后可見腸道腫脹, 腸壁變薄、出血, 腸腔內(nèi)有淡黃色炎性黏液(圖1)。切片觀察顯示: 健康香魚肌肉結(jié)構(gòu)完整、肌纖維排列規(guī)則(圖2a), 病魚突出的肌肉中肌纖維斷裂、肌纖維周圍可見紅細胞和炎性細胞浸潤, 呈壞死性肌炎表現(xiàn)(圖2b); 病魚的鰓絲和鰓小片中紅細胞增多、鰓絲間細胞和黏液細胞增多、細胞邊界不明顯并有淋巴細胞浸潤, 部分鰓絲上皮細胞瓦解(圖2d); 健康香魚肝臟細胞邊界清晰, 血紅細胞均勻而隨機分布(圖2e), 病魚肝細胞的細胞核呈空泡樣, 部分肝細胞與周圍肝細胞之間產(chǎn)生縫隙而被“隔離”, 核內(nèi)染色質(zhì)邊集, 部分細胞凋亡、溶解(圖2f); 健康香魚的脾臟紅細胞區(qū)和白細胞區(qū)邊界明顯(圖2g), 患病香魚脾臟內(nèi)紅細胞數(shù)量減少, 細胞排列不規(guī)則, 白細胞聚集, 核深染, 細胞之間出現(xiàn)空泡(圖2h); 健康香魚腸組織中上皮細胞排列緊密, 可見明顯毛細血管和腸腺(圖2i), 病魚腸道內(nèi)黏膜上皮細胞脫落、溶解(圖2j)。

圖1 患病香魚皮膚、肌肉、腸道和肛門的病理學(xué)癥狀Fig.1 Pathological symptoms at skin, muscle, intestine, and anus of diseased P. altivelis

2.2 分離菌株形態(tài)

將分離菌株編號為NH21, 該菌株經(jīng)培養(yǎng)12 h 后形成的菌落低凸、圓形, 直徑1～2 mm, 邊緣光滑, 表面濕潤(圖 3a)。染色顯示該菌株為革蘭氏陰性菌,100×油鏡觀察菌體呈桿狀、端圓(圖3b)。

2.3 分離菌株的生化鑒定

根據(jù) VITEK 2 GN 鑒定卡的結(jié)果, VITEK 2 Compact 生化鑒定系統(tǒng)分析本實驗分離到的NH21 菌株為類志賀鄰單胞菌(準(zhǔn)確率99.9%), 各項鑒定結(jié)果見表1。

表1 NH21 菌株的生化鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemical identification of NH21 strain

2.4 分離菌株的16S rDNA 序列測定與進化樹分析

在以金黃色葡萄球菌為外群構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹(圖4)中, 分離菌株NH21 和9 株類志賀鄰單胞菌聚為一個緊密的大簇, NH21 菌株與這9 株類志賀鄰單胞菌的同源性都＞99% (99.23%～99.93%); 腸桿菌科的另外8 種細菌(鼠疫耶爾森氏桿菌、遲緩愛德華氏菌、黏質(zhì)沙雷氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、腸炎沙門氏菌、宋內(nèi)志賀菌、大腸桿菌)聚為另一個大簇。

圖4 NH21 菌株16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences of strain NH21

2.5 回歸感染實驗

回歸感染后的香魚出現(xiàn)腹部充血、肛門紅腫的癥狀, 與自然感染香魚的病理癥狀相似?；貧w感染實驗存活率見圖5。各個感染組香魚出現(xiàn)死亡的時間與感染劑量呈正相關(guān), 即感染劑量越大出現(xiàn)死亡的時間越早。感染劑量由高到低的4 個實驗組中香魚死亡時間分別出現(xiàn)在感染后第1 天、第2 天、第3 天和第6天, 至感染實驗結(jié)束時(第7 天)各組存活率分別為0%、20%、80%和90%。對照組香魚全程無死亡。經(jīng)計算, NH21 菌株對香魚的半致死劑量LD50=2.51×107CFU/mL。

圖5 回歸感染生存曲線Fig.5 The survival curve of artificial infection

2.6 藥物敏感性

藥物敏感性試驗結(jié)果(表2)顯示: NH21 菌株對阿奇霉素、頭孢氨芐、新生霉素、多黏菌素B、頭孢西丁、呋喃唑酮6 種藥物敏感, 對麥迪霉素、氨芐西林、羧芐西林、阿莫西林、鏈霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、磺胺異唑、氧氟沙星13 種藥物具有耐藥性, 對紅霉素、克拉霉素、慶大霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明6 種藥物為中介狀態(tài)。

表2 藥物敏感性試驗Tab.2 Results of test for antibiotic susceptibility

2.7 毒力基因與耐藥基因檢測

11 個細菌毒力基因的檢測結(jié)果中(表 3)顯示:NH21 菌株存在9 個毒力基因, 分別為feoB、csrA、ssb、phoP、csgG、waaA、panD、sodB、clpP; 未檢測到毒力基因nanE和hsdM。所檢測的8 個耐藥基因emrD、catB、macB、ksgA、tolC、ampE、bacA、acrA均在NH21 菌株中被檢測到(表4)。

表3 毒力基因檢測引物信息和結(jié)果Tab.3 Virulence gene primer information and results

表4 耐藥基因檢測的引物信息和結(jié)果Tab.4 Information and results of the antibiotic resistance gene primer

3 討論

我國開展香魚人工養(yǎng)殖已有近30 年, 近年來病害頻發(fā)給香魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。香魚養(yǎng)殖中常見細菌性疾病有弧菌病、假單胞菌病、氣單胞菌病、鏈球菌病、柱形病、冷水病、類結(jié)節(jié)病等, 分別由弧菌、殺香魚假單胞菌、氣單胞菌、β 溶血型鏈球菌、柱狀黃桿菌、嗜冷黃桿菌、殺魚巴斯德菌等引起(葉巖豹,2004)。本實驗中對患皮膚潰爛病的病魚進行優(yōu)勢菌分離純化, 通過革蘭氏染色、生化和分子鑒定分離的菌株NH21 為類志賀鄰單胞菌, 并通過回歸感染實驗證實其為本次寧?？h香魚體表潰爛病的病原菌。

續(xù)表

類志賀鄰單胞菌是一種革蘭氏陰性的兼性厭氧菌, 腸桿菌科(Enterobacteriaceae) 鄰單胞菌屬(Plesiomonas)只有類志賀鄰單胞菌一個種。類志賀鄰單胞菌在自然界中廣泛存在, 可感染的宿主多樣, 例如: 鐘震宇等(2018)報道了鹿茸部位出血繼而引發(fā)敗血癥的雄性麋鹿脾臟病變, 在病灶分離到類志賀鄰單胞菌; 李富祥等(2012)報道了從昆明某地患敗血癥的病死成年犬中分離到該菌; 另外也有大量的流行病學(xué)調(diào)查顯示類志賀鄰單胞菌也可引起人的腹瀉(竇雪如, 2017; 李君萍等, 2020; 王小龍等, 2020)。在魚類中, 類志賀鄰單胞菌可感染太平洋雙色鰻鱺(賴曉健等, 2016)、江鱈(張效平等, 2018)、鯽(傅芳等,2019)、雜交鱘(張明洋等, 2019)、黃鱔(陳志勇等,2020)、斑點叉尾(呂小燕等, 2020)、黃顙魚(溫周瑞等, 2021)、大口黑鱸(慶輝等, 2022)等, 主要病理癥狀表現(xiàn)為皮下充血、鰭部潰爛、肛門紅腫并有黃色液體流出; 解剖可觀察到腹水、腸道充血等。本次寧海縣暴發(fā)體表潰爛病的患病香魚癥狀與上述的病理癥狀相似。類志賀鄰單胞菌對溫度、pH、鹽度均有較廣的適應(yīng)范圍, 海水和淡水養(yǎng)殖魚類均可患病。半致死劑量分析顯示對從不同魚類種分離到的類志賀鄰單胞菌致病株毒力差別較大, 本研究所獲得的NH21 菌株對香魚的半致死劑量為2.51×107CFU/mL, 這與傅芳等(2019)從鯽體內(nèi)分離到的類志賀鄰單胞菌的半致死劑量(2.09×107CFU/mL)相似, 而賴曉健等(2016)從太平洋雙色鰻鱺中分離到的類志賀鄰單胞菌株的致病性更強、半致死劑量僅為3.2×105CFU/mL。

由于抗生素在人類生活和漁業(yè)生產(chǎn)上的廣泛及不規(guī)范使用, 許多致病菌對一些常見的抗生素都產(chǎn)生了耐受性。藥物敏感性實驗顯示, 本次分離到的香魚致病性類志賀鄰單胞菌NH21 菌株對阿奇霉素、頭孢氨芐、新生霉素、多黏菌素B、頭孢西丁、呋喃唑酮敏感, 而對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、氧氟沙星等耐受。從其他魚類中分離到的類志賀鄰單胞菌也對一些常見的抗生素呈耐藥性,如張培等(2015)分離得到的ZP-1 菌株對氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、替考拉寧等12 種抗生素耐受; 分離自斑點叉尾 鮰的YZ1010 菌株對環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、羧芐西林、氨芐西林等14 種抗生素耐受(呂小燕等, 2020)。鑒于目前在多種魚類中分離到的致病性類志賀鄰單胞菌對多種常用抗生素都具有抗藥性并存在多種耐藥基因, 今后對該病原菌的防治也應(yīng)考慮多種方法, 例如賴曉健等(2016)發(fā)現(xiàn)五倍子、丁香、生地榆等中藥對引起太平洋雙色鰻鱺發(fā)病的類志賀鄰單胞菌都有很好的抑菌效果, 何洋等(2022)分離到了一株類志賀鄰單胞菌噬菌體, 這些研究都為今后該病的防治提供了新的思路。

根據(jù)上述研究, 類志賀鄰單胞菌在不同的魚類和不同地區(qū)內(nèi)分離的菌株產(chǎn)生了不同的藥敏試驗結(jié)果, 同時也存在著不同程度的混合感染。在之后的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)活動中, 需要各地政府應(yīng)依托水產(chǎn)推廣站、養(yǎng)殖研究所等社會機構(gòu), 設(shè)立魚病疫情的協(xié)調(diào)機制, 加強管理, 在技術(shù)人員的指導(dǎo)下科學(xué)用藥, 本研究結(jié)果可為今后制定統(tǒng)一的檢測和治療標(biāo)準(zhǔn)提供參考資料。

4 結(jié)論

本研究從2021 年8 月浙江省寧?？h某養(yǎng)殖場暴發(fā)體表潰爛病的香魚病魚體中分離到一株疑似病原菌NH21, 根據(jù)生化分析和分子生物學(xué)方法鑒定其為類志賀鄰單胞菌。藥敏試驗表明NH21 菌株對阿奇霉素等6 種抗生素敏感, 對麥迪霉素等13 種抗生素耐藥。經(jīng)PCR 檢測NH21 菌株具有feoB等9 個毒力基因9 個和emrD等8 個耐藥基因。根據(jù)回歸感染實驗確定了NH21 菌株的半致死劑量(LD50)值為2.51×107CFU/mL。