草魚(Ctenopharyngodon idellus)出血病二價(jià)細(xì)胞滅活疫苗體液免疫效果及免疫保護(hù)率評(píng)價(jià)研究*

郝貴杰 林 鋒 黃愛(ài)霞 葉 霆 姚嘉赟 潘曉藝袁雪梅 徐 磊 胡金春① 沈錦玉①

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 浙江湖州313001; 2. 衢州市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心 浙江衢州 324000)

草魚(grass carp,Ctenopharyngodon idellus)是我國(guó)傳統(tǒng)的“四大家魚”之一, 因營(yíng)養(yǎng)高、味道鮮美且飼養(yǎng)成本低而廣受歡迎, 根據(jù)2021 年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒, 2020 年草魚產(chǎn)量占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的18%, 依然是中國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量的衛(wèi)冕冠軍, 比2019 年增加0.69%, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但隨著草魚大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的發(fā)展, 草魚病害時(shí)有發(fā)生, 如細(xì)菌性疾病、病毒性出血病、寄生蟲病等, 損失最大的是草魚出血病, 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì), 每年由該病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)20 余億元(陳愛(ài)平等, 2010)。其病原為草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus, GCRV), 該病毒屬于水生呼腸孤病毒屬, 是該屬成員中毒力最強(qiáng)的一種, 也是中國(guó)分離鑒定, 并在國(guó)際上首次完成全基因序列分析的第一株魚類病毒, 可導(dǎo)致草魚在魚種階段發(fā)生出血病, 死亡率一般為30%～50%, 最高可達(dá)60%～80%(Wintonet al, 1987; 柯麗華等, 1990; Rangelet al,1999; 王方華等, 2006)。GCRV 為雙鏈分節(jié)段RNA病毒, 基因組分11 個(gè)節(jié)段, 病毒顆粒為二十面體對(duì)稱的球形顆粒, 病毒粒子平均直徑為 60～70nm, 具有雙層衣殼, 沒(méi)有囊膜, 對(duì)氯仿和乙醚處理不敏感,在pH 3～11 范圍內(nèi)十分穩(wěn)定(Franckiet al, 1991; Fanget al, 2000, 2005; Qiuet al, 2001)。GCRV 病原學(xué)比較復(fù)雜, 目前國(guó)內(nèi)報(bào)道有幾十個(gè)分離株, 但不同分離株產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE), 對(duì)草魚的致病力差異較大, 而且其基因組帶型及序列也存在差異。目前還沒(méi)在血清學(xué)上對(duì)其進(jìn)行分類, 但根據(jù)現(xiàn)有病毒分離株的核苷酸及氨基酸的序列信息, 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行比對(duì)分析, 共有三種基因型 GCRV, 即GCRV Ⅰ型(GCRV-Ⅰ, 代表株為 GCRV-873 與GCRV- ZV8909)、GCRV Ⅱ型(GCRV-Ⅱ, 代表株為GCRV- HZ08 與GCRV-GD108)和GCRV Ⅲ型(GCRV-Ⅲ, 代表株為GCRV-104)。近年來(lái), 國(guó)內(nèi)多家單位包括本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)草魚出血病開(kāi)展的流行病學(xué)研究結(jié)果表明, 臨床流行的毒株主要為GCRV Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅲ型很少(張超等, 2010; Wanget al, 2012; 李永剛等,2013; 楊映等, 2015)。

草魚出血病一直是我國(guó)草魚養(yǎng)殖中最難控制的疾病, 但目前未見(jiàn)病毒病的特效治療藥物, 因此采用疫苗免疫, 再聯(lián)合早期診斷, 可有效降低該病的危害,是控制病毒病最可取也是最有效的方法。傳統(tǒng)的“土法疫苗”組織漿滅活疫苗在20 世紀(jì)70、80 年代時(shí)為各地控制草魚出血病疫情起到了積極成效, 但其需大量魚體擴(kuò)增病毒, 費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 并存在擴(kuò)散病毒的危險(xiǎn)( 劉栭 等, 1977)。目前細(xì)胞培養(yǎng)弱毒疫苗已取得了疫苗生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào), 在多個(gè)地區(qū)進(jìn)行了推廣應(yīng)用, 對(duì)草魚出血病的控制起了很大的作用, 但也存在病毒毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)(許淑英等, 1994); 因此研制細(xì)胞滅活疫苗尤其是二價(jià)細(xì)胞滅活疫苗具有較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。課題組前期研究表明疫苗免疫刺激機(jī)體啟動(dòng)了非特異性和特異性免疫應(yīng)答(奕志娟等, 2015)。本研究從體液免疫及免疫保護(hù)率的角度對(duì)草魚出血病二價(jià)細(xì)胞滅活疫苗進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià), 以表達(dá)純化的GCRV 結(jié)構(gòu)蛋白VP7 作為測(cè)試抗原, 以實(shí)驗(yàn)室自制的草魚 IgM 單抗為一抗, 以商業(yè)化的羊抗鼠HRP 酶標(biāo)抗體為二抗, 建立了測(cè)試未知抗體的三抗體夾心酶聯(lián)免疫方法(TAS-ELISA)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)疫苗特異性體液免疫應(yīng)答的免疫效果, 并在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了二價(jià)疫苗免疫保護(hù)率實(shí)驗(yàn), 為進(jìn)一步開(kāi)展二價(jià)疫苗的免疫示范和新獸藥證書申報(bào)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000); Mx3005P 熒光定量PCR 儀(Stratagene 公司); MIR-154 低溫恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋); 550 型酶標(biāo)儀(Bio-rad); CKX31 倒置顯微鏡(奧林巴斯)。RNA 提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒[FastQuant RT Kit (with gDNase)]、質(zhì)粒小提試劑盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)等購(gòu)自TIANGEN 公司, iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix 購(gòu)自Bio-RAD 公司, SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒, ELISA 相關(guān)試劑等購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司, M199 細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰酶消化液、雙抗(青霉素、鏈霉素)均購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司, 引物合成及序列測(cè)定委托南京金斯瑞生物科技有限公司, 其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒、細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等

pET28a 原核表達(dá)載體由寧波大學(xué)惠贈(zèng), 大腸桿菌DH5α、BL21 (DE3)、草魚IgM 單抗、CIK 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存; 所用GCRV 毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離保存,其中標(biāo)準(zhǔn)參考株GCRV873 細(xì)胞懸液由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚病研究室惠贈(zèng), (20±5) g 的健康草魚購(gòu)自長(zhǎng)興某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.3 兩種基因型 GCRV 的實(shí)時(shí)熒光絕對(duì)定量PCR (AQ-PCR)方法的建立

根據(jù)GenBank 公布的基因Ⅰ型和Ⅱ型GCRV 第六基因序列設(shè)計(jì)絕對(duì)熒光定量PCR 特異性擴(kuò)增引物,目的片段大小分別為102 bp 和169 bp。上游和下游引物序列分別為F1: 5′-CCCA CATCCTCCTCCAAT-3′,R1: 5′-AACGACTTCGCCCTTGTA-3′; F2: 5′-GGACG GCGGCTGC TATGAT-3′, R2: 5′-GCCCGTAACGCAG GGTAT-3′。

按常規(guī)方法構(gòu)建含上述目的基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒。用NanoDrop2000 測(cè)定所制備的基因Ⅰ型、Ⅱ型GCRV 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度和純度, 根據(jù)公式: 質(zhì)?？截悢?shù)(單位: copies/μL)=6.02×1023(單位: copies/mol)×質(zhì)粒濃度(單位: g/μL)/質(zhì)粒分子量(單位: g/mol), 得出質(zhì)?？截悢?shù)(李麗等, 2011)。基因Ⅰ型、Ⅱ型GCRV的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度分別為157.1、118.8 ng/μL, 按公式得拷貝數(shù)分別為1.4×1012、6.4×1011copies/μL。將基因Ⅰ型、Ⅱ型GCRV 質(zhì)粒分別用ddH2O 進(jìn)行10 倍梯度稀釋, 稀釋成1×108～1×102copies/μL 的7 個(gè)梯度,將其分別作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng), 每個(gè)模板重復(fù)做3 次, 采用20 μL PCR 反應(yīng)體系: iQ SYBR?Green SuperMix 10 μL, 熒光定量PCR 引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 模板2 μL, ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)程序:95 °C 預(yù)變性10 min; 95 °C 變性30 s, 58 °C 退火20 s,72 °C 延伸30 s, 40 個(gè)循環(huán)。

1.4 細(xì)胞病毒液培養(yǎng)及其病毒含量測(cè)定

兩種基因型GCRV (GCRV-ZV8909 及GCRV-HZ13)分別利用細(xì)胞瓶培養(yǎng)的方法進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng), 待基因Ⅰ型GCRV 產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變及基因Ⅱ型GCRV病毒復(fù)制達(dá)到一定的拷貝數(shù)后收獲細(xì)胞病毒懸液,經(jīng)反復(fù)凍融3 次后將其分別合并備用。

分別提取上述兩種基因型 GCRV 細(xì)胞病毒液RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 按照1.3 中方法進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增, 根據(jù)系統(tǒng)給出的結(jié)果計(jì)算兩種細(xì)胞病毒液的病毒拷貝數(shù)。

1.5 草魚出血病二價(jià)細(xì)胞滅活疫苗的制備

按相同病毒拷貝數(shù)將GCRV-ZV8909 和GCRV-HZ13細(xì)胞病毒懸液混合作為病毒原液, 按照體積加入終濃度為3.75 mL/L 福爾馬林溶液(含40%甲醛), 用恒溫水浴鍋65 °C 滅活2 h, 滅活后的病毒液重接CIK細(xì)胞, 培養(yǎng)7 d 后觀察細(xì)胞病變。經(jīng)滅活檢驗(yàn)后, 將疫苗原液用生理鹽水進(jìn)行稀釋, 分別進(jìn)行50 倍、100倍稀釋備用。

1.6 草魚免疫及血清樣品制備

草魚在恒溫循環(huán)系統(tǒng)中充氧飼育, 水溫24～26 °C。試驗(yàn)共分4 個(gè)組: 疫苗原液組、50 倍稀釋組、100 倍稀釋組、生理鹽水對(duì)照組, 每組50 尾, 分別為腹腔注射, 劑量均為0.2 mL/尾。各組在免疫后的3、5、7、14、21、28、42、56、70、84 d 各取3 尾魚, 每尾魚采集血液, 4 °C 冰箱過(guò)夜放置后2 500 r/min, 離心10 min收集血清置于–80 °C 的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 兩種基因型GCRV S10 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

分別根據(jù)GCRV-Ⅰ及GCRV-Ⅱ第10 基因片段序列(Ⅰ型S10 909 bp, Ⅱ型1 124 bp)和pET-28a 表達(dá)序列的特征, 設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物F3:

該兩對(duì)引物上下游引物5′端分別含NdeⅠ及XhoⅠ酶切位點(diǎn), 擴(kuò)增片段分別為840 bp 和1 050 bp。PCR 反應(yīng)體系按試劑盒配制, cDNA 模板為各病毒懸液提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄獲得, 純化回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物后, 將其分別克隆至pMD19-T 載體, 進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選并測(cè)序。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-S10 的構(gòu)建采用常規(guī)酶切連接方法, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選并測(cè)序, 同時(shí)進(jìn)行重組菌保種待用。

1.8 重組蛋白的表達(dá)純化與鑒定

1.8.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取上述保存的菌液30 μL, 接種至3 mL 含有100 μg/mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中, 置速度為250 r/min 的37 °C 搖床過(guò)夜培養(yǎng)。第2 天分管培養(yǎng)新鮮菌液, 同樣條件恒溫?fù)u至OD600結(jié)果為0.6～0.8 時(shí), 加入IPTG 誘導(dǎo), 其終濃度為1 mmol/L, 同時(shí)設(shè)置未誘導(dǎo)組, 分別放至兩種溫度的搖床進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng), 37 °C 搖床培養(yǎng)4 h, 15 °C 搖床培養(yǎng)16 h, 然后收集菌液, 8 000 r/min 離心10 min 后收集菌體, 加入2 倍體積的PBS 重懸菌體, 再加入溶菌酶進(jìn)行超聲破碎, 其終濃度為1 mg/mL, 最后, 分別取全細(xì)胞裂解液以及經(jīng)離心處理的沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.8.2 表達(dá)蛋白純化與Western blot 鑒定 重組菌液經(jīng)37 °C 搖床擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600結(jié)果為0.6～0.8 時(shí),如上加入IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h 后收集菌體。按照Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行重組蛋白純化, 依次進(jìn)行裝柱、平衡、菌體裂解、離心、上柱、沖洗、洗脫等。分別收集蛋白洗脫液, SDS-PAGE電泳分析, 并進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western blot)鑒定。

1.9 受免草魚體液免疫效果評(píng)價(jià)

免疫草魚不同時(shí)間血清抗體水平測(cè)試: 用實(shí)驗(yàn)室前期建立的TAS-ELISA 方法進(jìn)行測(cè)定, 首先用pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液即包被液CBS 稀釋上述純化的VP7 融合蛋白至終濃度為50 μg/mL, 按照100 μL/孔的量加入96 孔酶標(biāo)板, 置4 °C 冰箱過(guò)夜包被, 用PBST 洗液充分洗滌包被板, 洗滌 3～4 次, 每次3～5 min; 用含8%脫脂奶粉的PBS 封閉, 200 μL/孔,37 °C 封閉2 h, 同上洗滌。將草魚血清分別進(jìn)行1∶80 稀釋, 每孔加入100 μL, 37 °C 孵育1h, 同上洗滌。然后每孔加入100 μL 1∶1 000 稀釋的草魚IgM 單抗腹水(本室制備), 37 °C 孵育1h, 同上洗滌。每孔加入50 μL 1∶2 000 稀釋的羊抗鼠IgG 酶標(biāo)抗體, 37 °C 孵育1h, 同上洗滌。每孔加入200 μL TMB 37 °C 避光孵育顯色10 min, 用50 μL 2mol/L 濃硫酸終止反應(yīng)后,于酶標(biāo)儀上讀取 OD450值。P/N≥2.1 者判為陽(yáng)性,P/N＜2.1 者判為陰性(P代表TAS-ELISA 所測(cè)受免草魚血清中抗體的OD 值,N代表所測(cè)健康草魚的相應(yīng)血清中抗體的OD 值)。

受免草魚血清抗體效價(jià)測(cè)定: 根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果, 分別取與兩種基因型病毒抗原結(jié)合抗體水平達(dá)到高峰時(shí)的草魚血清, 進(jìn)行1∶50, 1∶100, 1∶200,1∶400, 1∶600, 1∶800, 1∶1 200 梯度稀釋, 按照上述方法分別測(cè)定抗兩種基因型GCRV 抗原的血清抗體效價(jià), 未免疫草魚血清分別做同比例稀釋進(jìn)行對(duì)照。

1.10 相對(duì)免疫保護(hù)率測(cè)定

草魚免疫按照1.6 中方法進(jìn)行, 0.2 mL/尾, 每組免疫30 尾, 注射同樣劑量的PBS 作為對(duì)照組。攻毒所用GCRV 為實(shí)驗(yàn)室自行分離保存的毒株即江西株JX2008, 其半數(shù)致死量為107.5LD50/mL, 半數(shù)組織細(xì)胞感染量為109.0TCID50/mL, 攻毒注射在草魚免疫后35 d 進(jìn)行, 腹腔注射劑量為0.2 mL。水溫28 °C 左右飼養(yǎng), 觀察15 d 并記錄死亡情況, 計(jì)算對(duì)照組和試驗(yàn)組死亡率, 并按下列公式進(jìn)行計(jì)算:

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)兩種基因型GCRV

正常生長(zhǎng)的 CIK 細(xì)胞接種 GCRV-ZV8909 和GCRV-HZ13 后, 用倒置熒光顯微鏡觀察其病變情況如圖1, GCRV-HZ13 株可見(jiàn)部分細(xì)胞脫落死亡, 但不表現(xiàn)出明顯的破魚網(wǎng)狀, 而GCRV-ZV8909 株則出現(xiàn)邊緣不整齊的空洞, 少許細(xì)胞脫落, 隨著病變發(fā)展, 最后呈現(xiàn)典型破魚網(wǎng)狀, 與GCRV-Ⅰ型代表株GCRV-873的細(xì)胞病變一致, 而對(duì)照細(xì)胞未出現(xiàn)任何病變。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察GCRV 感染細(xì)胞后的病變(400×)Fig.1 Fluorescent microscopic observation of the CPE of GCRV cultured with the cells (400×)

2.2 兩種基因型GCRV 的AQ-PCR 方法的建立

將基因Ⅰ型、Ⅱ型GCRV 質(zhì)粒梯度稀釋后選取1×108～1×102copies/μL 的7 個(gè)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增后, 由系統(tǒng)自動(dòng)生成的基因Ⅰ型、Ⅱ型GCRV 的熔解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線可知, 基因Ⅰ型、Ⅱ型GCRV 質(zhì)粒在梯度稀釋濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系, 顯示本研究建立的基因Ⅰ型、Ⅱ型GCRV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確地反映目的基因的擴(kuò)增。由熔解曲線可知產(chǎn)物的Tm(DNA 熔解溫度)值均一, 熔解曲線表現(xiàn)為單一的峰, 說(shuō)明引物的特異性較好。

2.3 兩種基因型GCRV 在細(xì)胞病毒懸液中拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)1.3 中AQ-PCR 方法測(cè)定1.4 中病毒懸液RNA 得出的Ct 值(循環(huán)閾值), 再由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的公式及試驗(yàn)過(guò)程中的稀釋情況, 計(jì)算GCRV-ZV8909病毒液和GCRV-HZ13 病毒液的拷貝數(shù)分別為2.0×109copies/mL 和1.5×106copies/mL。

2.4 草魚出血病二價(jià)細(xì)胞滅活疫苗的制備

將GCRV-ZV8909 和GCRV-HZ13 按病毒拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果等比例混合, 均含病毒拷貝數(shù)約 1.5×106copies/mL, 即每 mL 混合病毒液中含有 0.75 μL GCRV-ZV8909 和999.25 μL GCRV-HZ13, 并以此作為原液?；旌喜《驹喊凑?.5 中方法進(jìn)行滅活, 滅活檢驗(yàn)結(jié)果表明合格, 將該疫苗原液用生理鹽水進(jìn)行稀釋, 分別進(jìn)行50 倍、100 倍稀釋備用。

2.5 兩種基因型GCRV S10 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

2.5.1兩種基因型GCRV S10 基因編碼區(qū)PCR 擴(kuò)增兩種基因型GCRV 目的基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增后電泳, 結(jié)果顯示目的條帶大小與預(yù)期一致, 分別為840 bp 和1 050 bp, 測(cè)序?yàn)檎_序列, 如圖2 所示。

圖2 兩種基因型GCRV S10 目的基因PCR 擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 PCR amplification of S10 gene of genotype Ⅰ and ⅡGCRV

2.5.2重組質(zhì)粒pET28a-S10 的鑒定 將上述目的條帶克隆于原核表達(dá)載體pET28a 載體中, 構(gòu)建了表達(dá)目的蛋白的原核表達(dá)載體pET28a-S10, 小量提取重組質(zhì)粒, 進(jìn)行雙酶切鑒定, 結(jié)果表明: S10 基因片段已成功克隆入pET28a 中(圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒PET-S10 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Restriction of recombinant plasmid PET-S10

2.6 兩種基因型GCRV S10 基因原核表達(dá)蛋白的純化及鑒定

2.6.1誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白 將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)表達(dá), 分別于20 °C 誘導(dǎo)過(guò)夜; 37 °C 誘導(dǎo)4 h, 收集菌體, 超聲破碎, 分別離心收集上清和沉淀, 沉淀用500 μL 包涵體溶解液溶解, 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白的表達(dá)情況, 結(jié)果表明, 兩種融合蛋白均能在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá), 分子量分別為32 kDa 和41 kDa, 如圖4 所示。

圖4 GCRV-S10 融合蛋白SDS-PAGE 分析結(jié)果圖Fig.4 Analysis results of the expression of PET-S10 by SDS-PAGE

2.6.2表達(dá)蛋白純化鑒定及濃度測(cè)定 大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白, 超聲破碎菌體, 鎳瓊脂糖親和層析純化, 進(jìn)行SDS-PAGE 及Western blot 檢測(cè), 見(jiàn)圖5、圖6, 表明兩個(gè)蛋白均獲得了較好的純化, 測(cè)定結(jié)果表明兩個(gè)純化蛋白的濃度分別為0.70 和0.72 mg/mL;蛋白純度檢測(cè)采用SDS-PAGE, 通過(guò)軟件掃描測(cè)定,純度均大于 80%。兩個(gè)蛋白的表達(dá)純化為進(jìn)一步ELISA 評(píng)價(jià)疫苗免疫效果提供了有用的試劑。

圖5 GCRV-Ⅰ純化蛋白SDS-PAGE 及Western blotting分析Fig.5 Analysis results of the purified protein of GCRV-Ⅰ by SDS-PAGE and the Western blotting

圖6 GCRV-Ⅱ純化蛋白SDS-PAGE 及Western blotting分析Fig.6 Analysis results of the purified protein of GCRV-Ⅰ by SDS-PAGE and the Western blotting

2.7 免疫草魚的抗體水平測(cè)定

草魚腹腔注射不同劑量的細(xì)胞滅活疫苗后, 血清中出現(xiàn)了抗GCRV 抗體的變化(如圖7, 圖8), 抗基因Ⅰ型GCRV 抗體的變化與對(duì)照組相比, 三種不同免疫劑量在接種疫苗5 d 后, 草魚血清抗GCRV 的抗體稍有增加, 接種7 d 后, 抗GCRV 抗體均有明顯增加, 28 d 后增加更為顯著, 達(dá)到最高峰, 但42 d 后開(kāi)始下降, 且一直持續(xù)到第84 d?？够颌蛐虶CRV 抗體的變化與對(duì)照組相比, 三種不同免疫劑量在接種疫苗5 d 后, 草魚血清抗GCRV 的抗體稍有增加, 14 d后增加更為顯著, 達(dá)到最高峰, 但21 d 后開(kāi)始下降,且一直持續(xù)到第84 d。由圖可以看出, 原液組與50倍稀釋組產(chǎn)生的抗體水平基本相同, 且都高于100 倍稀釋組。

圖7 草魚腹腔注射疫苗不同時(shí)間后血清中抗Ⅰ型GCRV抗體水平Fig.7 The serum antibody levels of anti-GCRV-Ⅰ on different times post intraperitoneal injection of vaccine

圖8 草魚腹腔注射疫苗不同時(shí)間后血清中抗Ⅱ型GCRV抗體水平Fig.8 The serum antibody levels of anti-GCRV-Ⅱ on different times post intraperitoneal injection of vaccine

2.8 免疫草魚的抗體效價(jià)測(cè)定

TAS-ELISA 法測(cè)定血清效價(jià), 結(jié)果表明, 抗基因Ⅰ型GCRV 的血清效價(jià)是1∶800, 抗基因Ⅱ型GCRV 的血清效價(jià)是1∶600。

2.9 相對(duì)免疫保護(hù)率測(cè)定

按照1.8 中方法測(cè)定核酸疫苗免疫草魚的相對(duì)免疫保護(hù)率, 結(jié)果表明, 核酸疫苗pEGFP-N1-VP7 以0.5 μg/尾注射免疫草魚, 其相對(duì)免疫保護(hù)率為67%,而對(duì)照組為30%, 顯示出較好的免疫效果。

3 討論

2019 年我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)了關(guān)于加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見(jiàn), 提出了三個(gè)方面的措施, 其中最重要的就是加強(qiáng)疫病防控, 全面實(shí)施苗種檢疫及疫苗的推廣, 因此, 在“減抗替抗”及綠色養(yǎng)殖的大環(huán)境下, 水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗的推廣勢(shì)在必行。

草魚是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類, “四大家魚”之一, 產(chǎn)量約占我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量的1/5, 連續(xù)多年單個(gè)魚類產(chǎn)量排名第一。但在養(yǎng)殖過(guò)程中病害也較多, 危害較大的疾病俗稱草魚“四病”, 即草魚出血病、爛鰓病、腸炎病、赤皮病, 其中每年引起草魚損失最嚴(yán)重的為草魚出血病, 病原為草魚呼腸孤病毒,目前公認(rèn)的該病毒有三個(gè)基因型, 最早于1980 年分離和研究的GCRV 屬于基因Ⅰ型(如GCRV-873 株等);張超等(2010)首次報(bào)道了基因Ⅱ型 GCRV, 如GCRV-HZ08 株; Fan 等(2013)在國(guó)內(nèi)首次分離并報(bào)道了基因Ⅲ型GCRV, 即HGDRV (GCRV-104)。不同基因型毒株各階段序列同源性相似性為15.1%～ 46.1%不等, 各基因型之間交叉保護(hù)較低, 這也意味著即使免疫過(guò)單種疫苗, 仍然會(huì)有被其他基因型病毒感染的風(fēng)險(xiǎn), 目前臨床上流行的GCRV 主要為基因Ⅰ型和Ⅱ型。

草魚出血病疫苗的研究起步于20 世紀(jì)70 年代,歷經(jīng)了組織獎(jiǎng)滅活疫苗即“土法疫苗”、細(xì)胞滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗等。多年來(lái), 許多科學(xué)家致力于該病毒的研究, 全國(guó)各地相繼應(yīng)用組織漿滅活疫苗和細(xì)胞滅活疫苗進(jìn)行免疫防治, 使得出血病在一定程度上得到了控制。而目前代表最高研究水平的是草魚出血病活疫苗(GCRV-892 株), 2012 年,中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所將該活疫苗轉(zhuǎn)讓給大華農(nóng)公司且重新獲得了該產(chǎn)品的獸藥生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào): 獸藥生字(2014)190026013, 至此, 我國(guó)水產(chǎn)疫苗開(kāi)始進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)階段, 該疫苗自上市以來(lái),逐漸在各草魚主養(yǎng)區(qū)推廣, 免疫草魚的平均成活率為65%～90%, 比未免疫草魚的成活率要高15%～20%,顯示出了較好的效果(吉華松等, 2019)。但該疫苗僅僅對(duì)基因Ⅰ型草魚出血病有較好的保護(hù)。

本研究通過(guò)研制針對(duì)基因Ⅰ型和Ⅱ型GCRV 的草魚出血病二價(jià)細(xì)胞滅活疫苗, 通過(guò)絕對(duì)定量的方法, 測(cè)定基因Ⅰ型和Ⅱ型的病毒含量分別為2.0×109及1.5×106copies/mL。用生理鹽水將其分別進(jìn)行50倍稀釋和100 倍稀釋, 包括原液及生理鹽水對(duì)照共4組, 通過(guò)腹腔注射免疫(20±5) g 健康草魚, 并開(kāi)展了免疫效果評(píng)價(jià)。眾所周知, 魚類作為特異性與非特異性免疫并存的脊椎動(dòng)物, 在病原微生物侵襲或疫苗免疫后都會(huì)產(chǎn)生非特異性免疫或特異性的體液免疫應(yīng)答, 課題組之前從免疫基因及小分子的轉(zhuǎn)錄水平做過(guò)免疫效果評(píng)價(jià), 與對(duì)照組相比, 注射免疫不同劑量的草魚出血病滅活疫苗均能刺激草魚脾臟中主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)、干擾素Ⅰ(IFNⅠ)、補(bǔ)體3 (C3)等6 種主要免疫基因不同程度的上調(diào)表達(dá), 說(shuō)明疫苗刺激機(jī)體啟動(dòng)了非特異性和特異性免疫應(yīng)答(奕志娟等, 2015)。本研究利用原核重組系統(tǒng)成功表達(dá)出兩種基因型GCRV 的VP7 蛋白,并進(jìn)行了純化制備和鑒定, 利用實(shí)驗(yàn)室保存的草魚IgM 單抗, 建立了三抗體夾心ELISA 分析評(píng)價(jià)疫苗體液免疫效果。結(jié)果表明, 草魚經(jīng)腹腔注射不同劑量的細(xì)胞滅活疫苗后, 與對(duì)照組相比, 各免疫組血清抗體均有不同程度的提高, 且原液組與50 倍稀釋組基本持平, 但都高于100 倍稀釋組, 各免疫組在免疫后5 d 即可檢測(cè)到兩種基因型GCRV 抗體, 且抗體水平持續(xù)到84 d, 但兩種基因型抗體水平達(dá)到高峰的時(shí)間不一致, 抗基因Ⅰ型GCRV 抗體達(dá)到高峰是在28 d, 抗基因Ⅱ型GCRV 抗體是在14 d 達(dá)到高峰。兩種基因型抗體水平達(dá)到高峰時(shí)的血清效價(jià)分別為1∶800、1∶600。

目前, 全球已經(jīng)有很多商品化的魚類病毒滅活疫苗,有美國(guó)、荷蘭等國(guó)的針對(duì)鮭的傳染性胰腺壞死病毒滅活疫苗, 有日本的針對(duì)長(zhǎng)吻鲹(Caranx delicatissimus)、點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)的虹彩病毒滅活疫苗, 有捷克的針對(duì)鯉的鯉春病毒滅活疫苗等等(吳淑勤等, 2014), 這些疫苗具有較高的免疫保護(hù)率, 如Fan 等(2012)研制的針對(duì)大菱鲆紅體病虹彩病毒研制的滅活疫苗通過(guò)皮下注射其免疫保護(hù)率達(dá)到83%以上。本研究利用實(shí)驗(yàn)室自行分離的當(dāng)前流行強(qiáng)毒株GCRV-HZ13 進(jìn)行草魚出血病二價(jià)細(xì)胞滅活疫苗免疫保護(hù)率實(shí)驗(yàn), 結(jié)果表明, 原液組保護(hù)率最高, 為67%,50 倍稀釋組為60%, 100 倍稀釋組只有33%, 因此實(shí)際應(yīng)用中可考慮用50 倍稀釋的劑量進(jìn)行草魚免疫,下一步將進(jìn)行免疫中試實(shí)驗(yàn)。

目前國(guó)外魚用疫苗自動(dòng)注射裝置較為完備, 為疫苗的推廣使用奠定了重要基礎(chǔ), 朱燁等(2020)研制的魚用疫苗自動(dòng)注射裝置, 以10～12 cm 長(zhǎng)的草魚苗作為自動(dòng)注射對(duì)象, 開(kāi)展活魚注射試驗(yàn), 并將注射生理鹽水的育苗暫養(yǎng)3 周, 發(fā)現(xiàn)存活率為98.8%, 自動(dòng)注射裝置的研發(fā), 成功解決了人工注射效率低、損傷大的問(wèn)題, 有望為今后魚用疫苗的推廣應(yīng)用提供有力的保障。

4 結(jié)論

本研究從體液免疫及免疫保護(hù)率的角度出發(fā),對(duì)草魚出血病二價(jià)細(xì)胞滅活疫苗進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià),建立了測(cè)試未知抗體的三抗體夾心酶聯(lián)免疫方法(TAS-ELISA), 評(píng)價(jià)疫苗特異性體液免疫應(yīng)答的免疫效果, 并在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了二價(jià)疫苗免疫保護(hù)率實(shí)驗(yàn)。免疫保護(hù)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原液組保護(hù)率最高, 為67%, 50 倍稀釋組為60%, 100 倍稀釋組為33%, 可為進(jìn)一步開(kāi)展二價(jià)疫苗的免疫示范和新獸藥證書申報(bào)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。