夜光藻配子細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用*

張櫻馨 宋書(shū)群 李才文

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 4. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 山東青島 266071)

夜光藻(Noctiluca scintillans)是我國(guó)重要的赤潮生物, 在近海海域廣泛分布(Harrisonet al, 2011)。1992～2020 年間, 《中國(guó)海洋災(zāi)害公報(bào)》共報(bào)道了28次面積超過(guò)100 km2的夜光藻赤潮, 單次赤潮最大面積達(dá)到4 000 km2。赤潮期間, 暴發(fā)性增殖的夜光藻細(xì)胞引起海水變紅, 并堵塞魚(yú)、蝦、貝類(lèi)等經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)生物的呼吸器官, 導(dǎo)致其大量窒息死亡(Huanget al,1997; Shunmugarajet al, 2020); 赤潮消亡過(guò)程會(huì)過(guò)度消耗溶解氧, 并釋放胞內(nèi)積累的銨、硫化氫等有毒物質(zhì)(岡市友利等, 1976; Huanget al, 1997; Smayda,1997; Baliarsinghet al, 2016), 對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成極大的危害。

夜光藻可以通過(guò)二分裂的方式進(jìn)行無(wú)性繁殖(杞桑等, 1994; 周成旭等, 1994), 也可通過(guò)配子結(jié)合形成合子的方式進(jìn)行有性繁殖(Elbr?chteret al, 1998;宋書(shū)群等, 2016)。隨著研究的不斷深入, 發(fā)現(xiàn)有性繁殖可能在夜光藻種群增長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用(Fukudaet al, 2006)。研究自然水體中夜光藻配子細(xì)胞的豐度及其時(shí)空分布特征對(duì)了解夜光藻的有性繁殖過(guò)程, 明確其種群增長(zhǎng)模式及控制因素具有重要意義, 將有助于夜光藻赤潮的預(yù)警、預(yù)測(cè)和防治。然而, 夜光藻配子細(xì)胞較為脆弱, 不易長(zhǎng)期保存, 且直徑僅有10～15 μm, 形態(tài)類(lèi)似裸甲藻, 在光學(xué)顯微鏡下不易鑒別(Elbr?chteret al, 1998; Fukudaet al, 2006), 因此難以通過(guò)鏡檢進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

近年來(lái), 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術(shù)被廣泛用于海洋藻類(lèi)的定量檢測(cè),目前已經(jīng)在銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi) 、 多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides) 、 圓 海 鏈 藻(Thalassiosira rotula)等微藻及石莼屬(Ulva)、萱藻屬(Scytosiphon)等大型藻的生殖細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用(Heet al, 2007; Yuanet al, 2012; 徐恒省等, 2013; 繆棟等,2018; Huet al, 2022)。與傳統(tǒng)的鏡檢方法相比,qRT-PCR 技術(shù)具有樣品易保存, 檢測(cè)耗時(shí)少、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì), 非常適用于大面調(diào)查或長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。核糖體RNA (ribosomal RNA, rRNA)基因具有高拷貝數(shù), Godhe 等(2008)估算9 種甲藻的拷貝數(shù)在9×105～100×105之間, 基于 rRNA 基因序列設(shè)計(jì)的qRT-PCR 引物的檢測(cè)下限可以低至個(gè)位數(shù)細(xì)胞(Yuanet al, 2012; 高巖等, 2013)。其中核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)是常用的分子標(biāo)記之一, 在rRNA 基因中有更快的進(jìn)化速度, 具有豐富的遺傳變異信息?；诖诵蛄性O(shè)計(jì)的引物具有種特異性,能區(qū)分同一屬內(nèi)的不同物種(Blomsteret al, 2000;Yuanet al, 2012)。

本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)靶區(qū)域?yàn)橐构庠?8S-ITS1 的物種特異性引物, 建立了qRT-PCR 定量檢測(cè)水體中夜光藻配子細(xì)胞的方法, 并應(yīng)用于2015 年膠州灣逐月調(diào)查, 研究了夜光藻配子細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的月度動(dòng)態(tài), 以評(píng)估本方法檢測(cè)環(huán)境樣品的可靠性和效果,為深入研究夜光藻有性繁殖及其在種群增長(zhǎng)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 夜光藻的培養(yǎng)及配子基因組DNA 的獲取

實(shí)驗(yàn)所用夜光藻通過(guò)垂直拖曳淺水II 型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)口面積: 0.08 m2, 網(wǎng)長(zhǎng): 140 cm, 孔徑: 160 μm)的方式采自膠州灣, 經(jīng)分離、純化后, 培養(yǎng)于經(jīng)0.22 μm混合纖維膜過(guò)濾的滅菌海水中, 每?jī)商焱段挂淮吻鄭u大扁藻(Tetraselmis helgolandicavar. tsingtaoensis)至餌料終濃度不低于 1×104cells/mL, 培養(yǎng)溫度(20.0±0.5) °C, 平均光照強(qiáng)度55.0 μmol/(m2·s), 光暗比為14h : 10h。

配子母細(xì)胞的識(shí)別及其發(fā)育階段的判斷參考Fukuda 等(2006)。使用毛細(xì)管挑取即將釋放配子的母細(xì)胞, 并在滅菌海水中沖洗三次以去除餌料藻, 在×200 倍下鏡檢確認(rèn)沒(méi)有餌料藻殘留后, 將其轉(zhuǎn)移至2 mL EP 管中孵育24 h。孵育完成后, 先取500 μL 含有配子細(xì)胞的水樣, 加入魯哥氏液固定(終濃度1%),迅速在×200 倍下鏡檢計(jì)數(shù); 剩余水樣濾至3 μm 孔徑的核孔濾膜上(Millipore, USA), 以收集夜光藻配子細(xì)胞。使用 DNeasy PowerSoil 試劑盒(QIAGEN,Germany)提取配子細(xì)胞的基因組DNA。

1.2 引物設(shè)計(jì)與特異性驗(yàn)證

基于 GeneBank 中已知夜光藻 rRNA 基因的18S-ITS1 序列信息(GQ380592.1), 使用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì), 經(jīng)比對(duì)篩選, 獲得了一對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物為167 bp 的引物(表1)。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 基于夜光藻18S rDNA 和ITS1 區(qū)域設(shè)計(jì)的qRT-PCR 正、反向引物Tab.1 Forward and reverse primers designed for qRT-PCR assay of N. scintillans 18S rDNA and ITS1 region

用于引物特異性驗(yàn)證的11 種海洋微藻來(lái)自中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù), 于指數(shù)生長(zhǎng)期各取50 mL 藻液, 濾至3 μm孔徑的核孔濾膜上(Millipore, USA), 使用 DNeasy PowerSoil 試劑盒提取其基因組DNA。以夜光藻配子基因組DNA 為陽(yáng)性對(duì)照, 無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照,采用Labcycler PCR 儀(SensoQuest, Germany)對(duì)11 種微藻的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(表2), 實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)平行。反應(yīng)體系為2×PCR Mix 10 μL (東盛生物,中國(guó)), 正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL, DNA 模板1 μL, 無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 °C預(yù)變性5 min; 95 °C 變性30 s, 60 °C 退火30 s, 72 °C延伸30 s, 共38 個(gè)循環(huán); 72 °C 終延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(重量體積比1.2%)電泳, 使用Azure 200 凝膠成像系統(tǒng)(Azure Biosystems, Inc., USA), 于365 nm 波長(zhǎng)紫外線(xiàn)下成像。

表2 實(shí)驗(yàn)中用于qRT-PCR 引物特異性驗(yàn)證的微藻Tab.2 Microalgal species used for specific test of qRT-PCR primer design

1.3 qRT-PCR 擴(kuò)增與檢測(cè)

采用Rotor-Gene Q 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析儀(QIAGEN, Germany)進(jìn)行兩步法qRT-PCR 反應(yīng), 反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq II (2×) (TaKaRa, Japan)10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA 模板1 μL, 無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至20 μL。qRT-PCR 程序?yàn)?5 °C 預(yù)變性30 s; 95 °C 變性5 s, 60 °C 退火30 s, 共40 個(gè)循環(huán); 反應(yīng)結(jié)束后在50 °C 預(yù)熔解90 s, 自50 °C至99 °C 以0.2 °C/s 的熔解速率進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的建立與驗(yàn)證

以1.1 節(jié)所述方法獲得10000 個(gè)夜光藻配子細(xì)胞的基因組DNA 并洗脫為30 μL, 使用洗脫液稀釋2、10、20、100、200、1 000、2 000、10 000、100 000倍, 各取1 μL 進(jìn)行qRT-PCR 分析, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。所得定量循環(huán)值(quantification cycle,Cq)與每反應(yīng)細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)值通過(guò)線(xiàn)性回歸擬合為細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 以線(xiàn)性響應(yīng)的最低細(xì)胞數(shù)代表其檢出限。

依據(jù)1.2 節(jié)所述方法, 以夜光藻配子細(xì)胞基因組DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增, 使用 E.Z.N.A?Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒(OMEGA, USA)回收長(zhǎng)度在 100～250 bp 間的目的條帶。膠回收產(chǎn)物連接pMD18-T 載體(TaKaRa), 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa), 涂布于每100 mL 含有48 μL IPTG(50 mg/mL)、200 μL X-Gal (20 mg/mL)和100 μL 氨芐青霉素(100 mg/mL)的LB 平板上。挑取白色單菌落進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證, 選取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并測(cè)序,BLAST 對(duì)比確認(rèn)是否為目的片段。使用E.Z.N.A?Plasmid Mini Kit I 質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA)提取含有目的片段的質(zhì)粒, 質(zhì)粒經(jīng)十倍梯度稀釋為100～109copies/μL 后, 取1 μL 進(jìn)行qRT-PCR 分析, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。所得Cq值與每反應(yīng)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值通過(guò)線(xiàn)性回歸擬合為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 以線(xiàn)性響應(yīng)的最低拷貝數(shù)代表其檢出限。

實(shí)驗(yàn)用天然海水采集自膠州灣, 經(jīng)20 μm 篩絹過(guò)濾處理, 且 qRT-PCR 檢驗(yàn)無(wú)夜光藻配子細(xì)胞存在(Cq=35.43±0.17)。將10 000、1 000、100 個(gè)配子細(xì)胞分別接種至100 mL 海水中, 抽濾至3 μm 孔徑的核孔濾膜上, 提取其基因組DNA 并洗脫為30 μL。各取1 μL 進(jìn)行qRT-PCR 分析, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。

1.5 膠州灣現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查

1.5.1 航次信息 于2015 年1 月至12 月, 搭載中國(guó)科學(xué)院海洋研究所“創(chuàng)新”號(hào)在膠州灣開(kāi)展月度調(diào)查, 通常在每月上旬進(jìn)行, 持續(xù)2～3 天。在調(diào)查海域布設(shè)12 個(gè)站位(圖1), 其中A3、A5、B2、C1、C4站位于灣內(nèi)近岸, C3 站位于灣中心, D1、D3、D5 站位于灣口, D6、D7、D8 站位于灣外, 每個(gè)站位的水深示于表3。

表3 各調(diào)查站位水深Tab.3 Depths of sampling stations

圖1 膠州灣調(diào)查站位Fig.1 Deployment of stations in Jiaozhou Bay

1.5.2 樣品采集與處理 夜光藻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞: 通過(guò)由底至表垂直拖拽淺水II 型浮游生物網(wǎng)采集夜光藻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞, 置于廣口塑料瓶中, 加入中性福爾馬林溶液固定(終濃度5%)。將樣品濃縮定容至50 mL, 取10 mL 子樣品置于體式顯微鏡(SZ61, Olympus, Japan)下進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。夜光藻配子細(xì)胞: 使用Niskin 采水器采集表層、中層和底層海水。每層取500 mL 海水, 先用200 μm 孔徑篩絹濾去中型浮游動(dòng)物和夜光藻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞, 再用20 μm 篩絹濾去小型浮游動(dòng)物和較大的浮游植物, 最后抽濾至3 μm 孔徑的核孔濾膜上,并立即液氮保存。對(duì)濾膜進(jìn)行預(yù)破碎處理后, 采用DNeasy PowerSoil 試劑盒提取樣品中的DNA。隨機(jī)挑取 3 份環(huán)境 DNA 樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增, 回收100～250 bp間的條帶并測(cè)序, BLAST 對(duì)比確認(rèn)是否為目的片段, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。依據(jù)1.3 節(jié)所述方法,對(duì)所有DNA 樣品進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR 擴(kuò)增效率(E)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率(s)的關(guān)系為:

夜光藻配子細(xì)胞的水柱平均豐度通過(guò)梯形法計(jì)算, 將配子豐度的垂直分布視為深度的函數(shù), 對(duì)各水層的豐度進(jìn)行積分后再除以水深得來(lái)。使用 SPSS 19.0 軟件對(duì)配子細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度進(jìn)行t-test、Kruskal-Wallis One-Way ANOVA、Mann-WhitneyUtest、Spearman 秩相關(guān)分析, 顯著性水平P均設(shè)為0.05。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的擬合, 配子細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度月度變化圖及其他柱形圖、箱線(xiàn)圖均采用Origin 2019b 軟件繪制; 站位圖采用Golden Software Surfer 17.0 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR 方法引物特異性的驗(yàn)證

使用本研究設(shè)計(jì)的引物對(duì)夜光藻配子及其他11種海洋微藻的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。如圖2 所示, 僅在夜光藻配子DNA 樣品中擴(kuò)增到了長(zhǎng)度在100～250 bp 間的片段, 對(duì)片段進(jìn)行測(cè)序并與目的序列進(jìn)行BLAST 對(duì)比發(fā)現(xiàn), 相似性達(dá)到100%; 在其他微藻DNA 樣品中均未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 應(yīng)用qRT-PCR 引物對(duì)不同微藻基因組DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of the amplified products of different microalgal species using a primer pair designed for the qRT-PCR assay

2.2 qRT-PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)與驗(yàn)證

以梯度稀釋細(xì)胞的DNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 分析, 熔解曲線(xiàn)在86.3～86.7 °C 顯示單峰(圖3a)。以Cq值為縱坐標(biāo), 細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo), 通過(guò)線(xiàn)性回歸擬合為細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。如圖4a 所示, 以稀釋倍數(shù)2 000, 即每反應(yīng)0.17 個(gè)細(xì)胞為節(jié)點(diǎn), 更低的稀釋倍數(shù)與Cq值不再具有線(xiàn)性關(guān)系, 將該值視為qRT-PCR 方法可檢出的最低細(xì)胞數(shù), 回歸方程為y=－3.4373x+29.045 8, 回歸系數(shù)R2=0.993 7, 擴(kuò)增效率為95.40%。

以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 分析, 熔解曲線(xiàn)同上(圖3b)。以Cq值為縱坐標(biāo), 拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo), 通過(guò)線(xiàn)性回歸擬合為拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。如圖4b 所示, 當(dāng)每反應(yīng)的質(zhì)?？截悢?shù)高于102時(shí), 其對(duì)數(shù)值與Cq值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系, 回歸方程為y=－3.441 6x+37.979 2, 回歸系數(shù)R2=0.999 6,擴(kuò)增效率為95.23%。

圖3 qRT-PCR 方法的熔解曲線(xiàn)分析Fig.3 Curves of melting in the qRT-PCR assay

圖4 qRT-PCR 方法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)Fig.4 Standard curves of the qRT-PCR assay

qRT-PCR 方法的驗(yàn)證如表4 所示, 接種至天然海水中的10 000、1 000、100 個(gè)夜光藻配子細(xì)胞的計(jì)算值與實(shí)際值無(wú)顯著性差異(n=6,P=0.085, 0.838, 0.150,t-test)。

表4 qRT-PCR 方法的驗(yàn)證Tab.4 validation of the qRT-PCR assay

2.3 應(yīng)用qRT-PCR 定量檢測(cè)膠州灣的夜光藻配子

采用本研究設(shè)計(jì)的引物對(duì)隨機(jī)挑選的3 個(gè)膠州灣環(huán)境DNA 樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增與qRT-PCR 分析, 每組實(shí)驗(yàn)均只在100～250 bp 間檢測(cè)到擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物(圖5)。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序并與目的序列進(jìn)行BLAST對(duì)比, 序列相似性達(dá)到100 %, 且qRT-PCR 熔解曲線(xiàn)同樣在86.3～86.7 °C顯示單峰(圖3c), 說(shuō)明該引物能夠在環(huán)境DNA 樣品中特異性地?cái)U(kuò)增目的片段。

圖5 應(yīng)用qRT-PCR 引物對(duì)2015 年膠州灣環(huán)境DNA 樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析Fig.5 Electrophoresis analysis of the amplified products of environmental samples in Jiaozhou Bay, 2015

應(yīng)用本方法定量檢測(cè)了2015 年1 月至12 月間在膠州灣采集的環(huán)境DNA 樣品, 夜光藻配子細(xì)胞在全年均有檢出, 其豐度呈現(xiàn)顯著的季節(jié)變化(P＜0.01,Kruskal-Wallis One-Way ANOVA); 對(duì)各月份間進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn), 在冬末春初的2～3 月和夏季的7 月出現(xiàn)兩個(gè)顯著的高峰(P＜0.05), 冬季的12 月顯著低于其他月份(P＜0.05)。1～5 月, 配子豐度呈先升高后降低的趨勢(shì), 于 2 月達(dá)到全年最高水平, 其豐度范圍為0.11×105～9.70×105cells/L, 年最高值出現(xiàn)在D5 站的表層; 6～9 月, 配子豐度再次先升后降, 并于7 月出現(xiàn)次高峰, 其豐度范圍為0.07×105～1.20×105cells/L, 最高值同樣出現(xiàn)在D5 站的表層; 此后, 配子豐度在11月略有回升后, 至12 月降至全年最低, 此時(shí)除D8 站外, 所有站位配子豐度都在100 cells/L 以下, 在D3站的表層出現(xiàn)全年最低值, 為18.12 cells/L (圖6a)。

圖6 膠州灣夜光藻配子細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度的周年變化Fig.6 Annual variation in abundances of N. scintillans gametes and of vegetative cells in Jiaozhou Bay

選取灣內(nèi)近岸的A5 站、灣中心的C3 站、灣口的D5 站和灣外的D7 站作為典型站位, 研究了夜光藻配子細(xì)胞的垂直分布(圖7)。A5 站在全部月份的表底差異均不明顯; 其他站位在2～3 月、7 月和11 月呈現(xiàn)明顯的表底差異。在2～3 月, D5 站配子豐度按表層、10 m 層、10 m 以下水層的順序遞減, C3 站和D7 站的底層豐度高于表層。在7 月, D5 站和D7 站均為表層豐度最高, 表層以下水層差異不大。在11 月, C3站的表層豐度略高于底層, D5 站則在底層出現(xiàn)了非常明顯的配子豐度高值。但從全年來(lái)看, 配子豐度與水深的Spearman 相關(guān)性不顯著(R=0.079,P＞0.05)。

圖7 配子細(xì)胞在典型站位的垂直分布Fig.7 Vertical distribution of gametes in typical stations

水柱平均配子豐度在不同站位的年平均值示于圖8a, 配子細(xì)胞在灣內(nèi)水深小于10 m 的站位(A3、A5、B2、C1、C4 站)豐度較低, 在灣中心、灣口和灣外水深大于10 m 的站位豐度較高, 最高值出現(xiàn)在灣中心的C3 站。全年來(lái)看, 水柱平均配子豐度在水深小于10 m 的站位和大于10 m 的站位存在顯著差異(P＜0.01, Mann-WhitneyUtest); 在2～4 月、7～9 月和11 月, 水深大于10 m 站位的水柱平均配子豐度顯著高于水深小于10 m 的站位(P＜0.05), 其余月份則沒(méi)有顯著差異(P＞0.05) (圖8b)。

圖8 水柱平均配子豐度在不同站位的分布(*P ＜ 0.05)Fig.8 Distribution of gametes abundance in different stations(*P ＜ 0.05)

夜光藻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度同樣呈現(xiàn)顯著的季節(jié)變化(P＜0.01, Kruskal-Wallis One-Way ANOVA), 最高值出現(xiàn)在2 月的C4 站, 為31.37 cells/L; 最低值出現(xiàn)在11月的C4 站和12 月的A3、B2、C1 站, 均未檢出。對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度和水柱平均配子豐度進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度與配子豐度的月度變化基本一致, 最高峰都出現(xiàn)在2 月, 并在7 月出現(xiàn)次高峰, 最低值都出現(xiàn)在12 月(圖6b), Spearman 相關(guān)性分析顯示二者極顯著正相關(guān)(R=0.759,P＜0.01)。在2 月最高峰發(fā)生前后的1、4 月, 雖然營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度處于同一水平(P＞0.05, Mann-WhitneyUtest), 但4 月的配子豐度顯著低于1 月(P＜0.05, Mann-WhitneyUtest), 其月平均值分別為(7.28±8.32)×103和(1.78±1.38)×104cells/L;在7 月次高峰發(fā)生前后的6、9 月, 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度與配子豐度均不存在顯著差異(P＞0.05; Mann- WhitneyUtest)。

3 討論

有性繁殖可能在夜光藻的種群增長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用(Fukudaet al, 2006; Miyaguchiet al, 2008;Sriwoonet al, 2008; 宋書(shū)群等, 2016), 定量檢測(cè)自然水體中的夜光藻配子, 研究其時(shí)空分布特征, 有助于闡明夜光藻有性繁殖與種群增長(zhǎng)的關(guān)系。傳統(tǒng)的浮游植物采集、保存、鏡檢技術(shù)只能計(jì)數(shù)自然水體中夜光藻的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、二分裂細(xì)胞和配子母細(xì)胞(周成旭等,1994; Uhliget al, 1995; Sriwoonet al, 2008)。然而, 夜光藻配子細(xì)胞粒徑較小(10～15 μm), 難以固定保存,且形態(tài)類(lèi)似裸甲藻, 在光學(xué)顯微鏡下不易鑒別(Elbr?chteret al, 1998; Fukudaet al, 2006), 傳統(tǒng)的鏡檢技術(shù)無(wú)法對(duì)其進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。近年來(lái), 流式細(xì)胞術(shù)、熒光原位雜交和qRT-PCR 等技術(shù)廣泛應(yīng)用于浮游植物的鑒定與計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)可以根據(jù)細(xì)胞粒徑和熒光特性對(duì)粒徑小于50 μm 的細(xì)胞進(jìn)行類(lèi)群劃分和計(jì)數(shù), 常用于微微型浮游植物(picophytoplankton,＜2 μm)的檢測(cè)(晁敏等, 2003), 但很難在環(huán)境樣品中鑒定到種。熒光原位雜交技術(shù)能夠利用特異性核酸探針對(duì)浮游植物進(jìn)行定性分析, 但定量分析需要在固定、離心、裂解及雜交等步驟后保持細(xì)胞不變形、不出現(xiàn)因破碎導(dǎo)致的團(tuán)聚現(xiàn)象, 否則會(huì)對(duì)后續(xù)的熒光顯微計(jì)數(shù)造成很大的困難(張寶玉, 2005)。qRT-PCR技術(shù)具有高特異性與靈敏度, 廣泛應(yīng)用于多種海洋藻類(lèi)的野外監(jiān)測(cè)(Heet al, 2007; 高巖等, 2013; Huet al, 2022; Liet al, 2022), 能夠區(qū)分同一屬的不同物種(Blomsteret al, 2000; Yuanet al, 2012), 其檢出限甚至可以在個(gè)位數(shù)以下, Li 等(2010)定量檢測(cè)水體中血卵渦鞭蟲(chóng)(Hematodinium perezi)的檢出限可低至每反應(yīng)0.01 個(gè)細(xì)胞; 另外, 該方法對(duì)樣品保存的要求較低,現(xiàn)場(chǎng)即可完成真空抽濾采樣與液氮速凍保存工作,很大程度上避免了細(xì)胞數(shù)量的損失。

Miyaguchi 等(2008)在相模灣(Sagimi Bay)曾嘗試建立夜光藻配子的qRT-PCR 定量檢測(cè)方法, 但其標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)沒(méi)有體現(xiàn)出良好的線(xiàn)性響應(yīng)(R2=0.722 5)。在本研究中, qRT-PCR 熔解曲線(xiàn)顯示單峰, PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全匹配, 說(shuō)明參照rRNA 基因的18S-ITS1 區(qū)域設(shè)計(jì)的引物能夠從環(huán)境樣品中精準(zhǔn)地識(shí)別夜光藻的序列。兩種標(biāo)準(zhǔn)品的qRT-PCR 擴(kuò)增效率(95.40%, 95.23%)及R2值(0.993 7,0.999 6)均 在 理 想 范 圍 內(nèi)(90%～110%,R2＞0.980 0)(Tayloret al, 2010), 能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)水體中配子細(xì)胞的準(zhǔn)確計(jì)算。以500 mL 的濾水體積、30 μL 的DNA 提取洗脫體積和1 μL 的qRT-PCR 分析體積計(jì)算, 本研究中檢測(cè)到的最低配子豐度(18.12 cells/L)可換算為每反應(yīng)0.30 個(gè)細(xì)胞, 高于細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的檢出限(每反應(yīng)0.17 個(gè)細(xì)胞), 完全可以滿(mǎn)足野外監(jiān)測(cè)工作的需求。

應(yīng)用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞豐度時(shí), 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的構(gòu)建至關(guān)重要。在過(guò)去的研究中, 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品通常有兩種, 即重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品與基因組DNA 標(biāo)準(zhǔn)品, 二者在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康南赂饔衅鋬?yōu)勢(shì)。重組質(zhì)粒的制備便捷, 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)長(zhǎng)期保存, 反復(fù)凍融后仍可保證其穩(wěn)定性(Yuanet al, 2012); 以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品在彭宇科等(2011)與本研究中均表現(xiàn)出了更好的線(xiàn)性響應(yīng), 雖然無(wú)法直接獲得細(xì)胞豐度,但可用于比較夜光藻配子細(xì)胞這類(lèi)不易保存、鑒定的細(xì)胞在不同時(shí)間、空間的拷貝數(shù)豐度。以基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品能通過(guò)計(jì)算獲得更為直觀的細(xì)胞豐度數(shù)據(jù),其實(shí)是以標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的細(xì)胞豐度為參照的相對(duì)值,因此其準(zhǔn)確性與細(xì)胞所含靶基因的拷貝數(shù)密切相關(guān),不同藻株、不同時(shí)期細(xì)胞所含拷貝數(shù)的差異會(huì)影響該方法的準(zhǔn)確性(Galluzziet al, 2004; 高巖等, 2013)。本研究專(zhuān)一地針對(duì)夜光藻生活史中的配子細(xì)胞階段,不需考慮不同細(xì)胞階段間拷貝數(shù)的差異, 但夜光藻不同地理類(lèi)群間的rRNA 基因拷貝數(shù)是否存在差異尚不清楚, 建議在實(shí)際應(yīng)用時(shí)以當(dāng)?shù)刂甑呐渥蛹?xì)胞建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

本研究應(yīng)用qRT-PCR 技術(shù)定量檢測(cè)膠州灣的夜光藻配子細(xì)胞, 研究了其時(shí)空分布特征, 分析了其與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)配子細(xì)胞具有促進(jìn)種群增長(zhǎng)的潛力。夜光藻的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞與配子細(xì)胞在全年尺度上是緊密相關(guān)的, 兩種細(xì)胞不僅呈現(xiàn)一致的月際變化趨勢(shì), 在相關(guān)性分析中也表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01); 這與Miyaguchi 等(2008)的研究結(jié)果相吻合,在相模灣配子豐度高值多出現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度高值之前或同時(shí)出現(xiàn)。在夜光藻種群大規(guī)模增長(zhǎng)之前, 可能存在有性繁殖細(xì)胞發(fā)生的活躍期。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度在2～3 月的峰值發(fā)生前后沒(méi)有顯著差異(P＞0.05), 但1 月的配子豐度卻顯著高于4月(P＜0.05), 同期采集的配子母細(xì)胞在種群中的比例也高于4 月(田達(dá)瑋等, 2017)。Sriwoon 等(2008)發(fā)現(xiàn)泰國(guó)灣(Gulf of Thailand)的綠色夜光藻無(wú)論是在自然水體還是培養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi), 配子母細(xì)胞均在其快速增長(zhǎng)期頻繁出現(xiàn)。Miyaguchi 等(2008)與本研究都發(fā)現(xiàn)配子細(xì)胞在水體中全年存在,即使網(wǎng)采樣品中沒(méi)有檢出夜光藻細(xì)胞, 該站位仍有配子細(xì)胞被檢出, 說(shuō)明在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度極低的水體中,配子的存在可能是種群延續(xù)的關(guān)鍵之一。

膠州灣夜光藻的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞與配子細(xì)胞呈現(xiàn)不同的時(shí)空分布模式。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的水平分布具有一定的季節(jié)規(guī)律: 1～2 月, 細(xì)胞豐度在灣內(nèi)東側(cè)靠近河流入?？诘恼疚蛔罡? 3 月, 僅C1 站和D1 站豐度略低, 其他站位差異不大; 4～9 月, 細(xì)胞豐度的高值多出現(xiàn)在灣口和灣外; 10～12 月, 高值分別出現(xiàn)在灣內(nèi)、灣口和灣外(田達(dá)瑋等, 2017)。配子細(xì)胞的水平分布沒(méi)有明顯的季節(jié)變化, 全年均表現(xiàn)出灣內(nèi)近岸站位低于灣中心、灣口和灣外站位的分布規(guī)律。以水深是否超過(guò)10 m 分組, 配子豐度在較深的站位總體上高于分布在灣內(nèi)近岸的較淺站位, 這可能與10 m 層的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞活力較高有關(guān), Tada 等(2020)發(fā)現(xiàn)雖然表層水體中營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度較高, 但活力極低, 較深的站位可能為夜光藻提供了適宜有性繁殖的水層。淺水站位受風(fēng)、海流和潮汐等物理因素的驅(qū)使, 易導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的聚集(Zhanget al, 2017, 2020), 但表層大量衰弱的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞沒(méi)有能力進(jìn)行旺盛的繁殖活動(dòng), 可能造成灣內(nèi)近岸站位的配子豐度呈現(xiàn)低值。

夜光藻配子細(xì)胞在水體中的形成與擴(kuò)散可能受多種因素影響。在膠州灣, 配子豐度垂直分布總體上比較均勻。水深較淺時(shí), 可能與水體垂直混合均勻有關(guān)(康美華, 2014)。同時(shí), 夜光藻餌料的垂直分布也可能影響配子的形成。夜光藻的有性繁殖需要吞噬營(yíng)養(yǎng)的支持, 在葉綠素a濃度低的月份, 觀察不到配子母細(xì)胞的存在(田達(dá)瑋等, 2017); 在不投喂食物的情況下,綠色夜光藻不能形成配子母細(xì)胞(Sriwoonet al, 2008)。其次, 夜光藻在自然水體中存在晝夜遷移現(xiàn)象(張?zhí)煳牡? 2009), 其無(wú)性繁殖存在明顯晝夜節(jié)律(陳漢輝等,1991; Uhliget al, 1995), 有性繁殖也可能存在節(jié)律性,調(diào)查時(shí)采集到的樣品只能代表該站位的瞬時(shí)狀態(tài), 可能影響對(duì)配子細(xì)胞垂直分布的整體描述。另外, 膠州灣局部海域在盛夏期間會(huì)形成溫躍層(楊玉玲等,1999), 水體的層化也可能影響配子細(xì)胞的垂直分布。

4 結(jié)論

(1) 以夜光藻rRNA 基因的18S-ITS1 為靶區(qū)域,建立了一種能快速、靈敏定量檢測(cè)水體中夜光藻配子的qRT-PCR 方法, 檢出限為每反應(yīng)0.17 個(gè)細(xì)胞或102個(gè)拷貝, 在分析室內(nèi)培養(yǎng)的其他海洋微藻和環(huán)境水樣時(shí)均表現(xiàn)出良好的特異性。

(2) 2015 年膠州灣水體中的夜光藻配子豐度呈雙峰分布, 最高峰出現(xiàn)在2～3 月, 次高峰出現(xiàn)在7 月;配子細(xì)胞的水平分布可能受存在于10 m 水層的高活力細(xì)胞群體的影響, 呈現(xiàn)灣內(nèi)近岸淺水站位低于灣中心、灣口和灣外深水站位的分布規(guī)律; 配子細(xì)胞總體在垂向分布均勻, 深水站位的個(gè)別月份存在垂直差異。

(3) 在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞最高值出現(xiàn)的月份及前一個(gè)月,水體中存在的大量配子細(xì)胞可能促進(jìn)種群增長(zhǎng); 在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞豐度極低時(shí), 水體中的配子細(xì)胞對(duì)種群存續(xù)有潛在的積極意義。

致謝數(shù)據(jù)在膠州灣海洋生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站幫助下產(chǎn)生, 謹(jǐn)致謝忱。