基于量子點編碼微球的流式檢測技術用于白血病診斷的研究

楊俊飛,王燁穎,周靖娥,王 鏡,閆志強,俞磊

（華東師范大學 化學與分子工程學院,上海 200062）

0 引言

血清中多種表達異常的蛋白質(zhì)的并行檢測可以作為一些復雜疾病 (如癌癥[1-3]、心臟病[4-5]及囊包性纖維癥[6-7]等) 診斷的關鍵性依據(jù).除此,并行檢測也廣泛應用于各種微生物分析中[8].酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)[8-9]和蛋白質(zhì)免疫印記 (Western Blotting,WB)是目前常用的免疫檢測方法,雖然技術成熟,但通量低,所需要的樣品量大,試劑等耗材量也大,不能滿足全民醫(yī)保和預防醫(yī)療理念的推廣和實現(xiàn).免疫臨床診斷的發(fā)展方向是低消耗、高通量檢測的實現(xiàn),所以急需一種快速、靈敏、精確的多重蛋白定量檢測方法,用于疾病診斷和生物分析等領域.

微陣列技術是高通量檢測中的常用手段,可以對多種分子并行檢測[10-11].較傳統(tǒng)分析技術,其樣品檢測能力更強、靈敏度更高、成本更低[12].高通量檢測技術主要分為3 種: 平面微陣列[13-14]、微珠陣列檢測芯片[15]、基于微球的懸浮陣列技術[16].相比于前兩者,懸浮微陣列技術運用了更高效的混合方式來加強微球與目標分子的結(jié)合,并通過流式細胞儀讀出的信號實現(xiàn)定量檢測.

根據(jù)熒光染料的不同,可分為有機熒光染料、熒光蛋白、量子點.近年來,隨著有機熒光染料和熒光蛋白的發(fā)展,且一些有機熒光編碼的微球被用來轉(zhuǎn)化利用,逐漸暴露出許多問題.因為這樣的檢測系統(tǒng)往往需要能夠產(chǎn)生多頻段激發(fā)光的復雜光學系統(tǒng),而且熒光染料種類有限,光譜特征存在廣泛的重疊現(xiàn)象,這些極易引起錯誤識別.此外,有機染色微珠還存在易光漂白[17-18]、編碼能力有限等缺點,限制了其進一步應用.與之相比,量子點的優(yōu)點表現(xiàn)為: ①激發(fā)波段寬,發(fā)射峰窄而對稱,一個范圍內(nèi)的激發(fā)波長可以同時激發(fā)不同發(fā)射波長的量子點,不易互相重疊和干擾;② 熒光強度和穩(wěn)定性高;③只需要改變合成過程中單體組分的比例,或者改變尺寸大小,就會改變其發(fā)射波長,因而可以簡單地獲得不同發(fā)射波長的量子點;④ 生物相容性好.因此,基于量子點編碼的懸浮微陣列可以克服有機熒光染料種類有限且光譜特征重疊等缺陷[19].

流式細胞術 (Flow Cytometry,FCM) 于20 世紀90 年代[20]被提出,在蛋白質(zhì)、DNA、RNA、細胞因子、抗原、抗體等分子的含量分析中逐漸體現(xiàn)出優(yōu)勢.將量子點編碼微球應用于流式檢測,具有高效、快捷、定性、定量檢測等優(yōu)點,目前受到了越來越多的關注.如經(jīng)典的三明治免疫夾心反應 (雙抗夾心法),將量子點微球作為載體,表面連接功能性官能團和抗體,作為檢測分子去識別抗原,實現(xiàn)定性檢測;將另一種有機染料或者量子點標記的抗體作為探針分子,將抗原夾在其中,實現(xiàn)定量檢測.

急性淋巴白血病 (Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL) 屬于淋巴瘤的一種,其發(fā)病機制是白血病細胞的增殖、分化以及凋亡受到阻礙,導致細胞受損和死亡,聚集在組織內(nèi)無法排出,且造血功能受到嚴重抑制.白血病根據(jù)病情分類,可以分為急性和慢性 (患病率為6∶1);根據(jù)發(fā)病起因分類,可以分為淋巴細胞和非淋巴細胞.據(jù)統(tǒng)計,全球每年有幾十萬白血病患者,占全部癌癥病人的四分之一.中國發(fā)病率較高,且病例數(shù)呈逐年上升趨勢.男性患病率高于女性 (2∶1);相對于成人,兒童和青少年患病率占大多數(shù),是唯一一個未成年人患病率高于成年人的癌癥.更為重要的是,白血病患者生存率低,容易復發(fā),并在治療后可能會伴隨后遺癥,所以迫切需要完善的診療技術[21].在早期診斷方面,與該病的表達水平異常的抗原和細胞因子的檢測成為首要選擇,如白細胞介素家族 (Interleukin-IL-2、4、10)、血清腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)、干擾素γ (Interferon-γ,IFN-γ)等[22-25].

綜上,本研究用分散聚合法制備了微球種子 (seed),再以seed 為模板,聚合成更大粒徑的多孔微球.多孔有利于量子點的摻雜,防止其泄漏,且羧基功能化后,利于IgG和IL-6 抗體的共價連接.在表征過程中,研究了量子點在微球中的滲透和分布狀況,以及在生理條件下長期貯存后的穩(wěn)定性.采用該策略,編碼的微球熒光均勻,編碼能力強,溶液穩(wěn)定性好,表面的羧基可進行抗體偶聯(lián).所有這些優(yōu)點都有利于長期存儲和檢測應用.使用人IgG 作為模型分析物,驗證了QDs@PS 材料與抗原連接的有效性,并且進一步利用雙抗夾心反應的原理,使用一抗和二抗兩種不同的IL-6 抗體與材料共價結(jié)合.最后,將連接抗體的材料與ALL 血清樣本共孵育,流式上機檢測.

1 實驗方法

1.1 材料

聚乙烯吡咯烷酮 K-30 (Polyvinyl Pyrrolidone K-30,PVP K-30)、十二烷基硫酸鈉 (Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)、甲基丙烯酸 (Methacrylic Acid,MAA,98%) 購于Sigma-Aldrich 公司,過氧化苯甲酰 (Dibenzoyl Peroxide,BPO)、氧化鎘 (CdO,99.99%)、苯乙烯 (99%)、醋酸鋅 (99.9%)、硒 (Se,99.9%)、硫 (S,99.9%) 購于麥克林公司,鼠抗-IL-6 (Ⅰ)、鼠抗-IL-6 (Ⅱ)、IL-6 蛋白購于北京義翹神州科技股份有限公司,甲苯、油酸 (Oleic Acid,OA)、EDC-HCl、1-十八烯 (1-Octadecene,ODE,90%)、二甲基丙烯酸乙二醇酯 (Ethyleneglycoldimethacrylate,EGDMA,98%)、三正辛基膦 (Tri-noctylphosphine,TOP,90%)、巰基丙酸 (3-Mercaptopropionic Acid,MPA,99.8%) 購于阿拉丁試劑公司,偶氮二異丁腈 (Azodiisobutyronitrile,AIBN)、環(huán)己烷、去離子水購于當?shù)毓?2-嗎琳乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonic Acid,MES)、N-羥基琥珀酰亞胺 (N-Hydroxy Succinimide,NHS)、人免疫球蛋白G (IgG)、羊抗人IgG、牛血清白蛋白 (Bovine Albumin,BSA)、Tween-20 購于上海鼎國生物,鼠抗-IL-6 (Ⅰ)、鼠抗-IL-6 (Ⅱ)、IL-6 蛋白購于北京義翹神州科技股份有限公司,不同濃度的急性白血病(Acute Leukemia,AL)血清樣本源于上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司.

1.2 聚苯乙烯微球 (PS) 的合成

按照相關文獻[26],不斷優(yōu)化并制備尺寸為5 μm 的PS 球,實驗步驟如下.

(1) 聚苯乙烯種子 (PS seed): 先將4 g PVP K-30和80 mL 乙醇溶液倒入150 mL 四頸燒瓶中,通氮氣20 min,升溫至70℃后,加入0.8 g AIBN和30 g 苯乙烯,聚合反應15 h.反應完成后,先用去離子水離心洗滌2 次,再用乙醇離心洗滌1 次,去除苯乙烯和PVP 殘留,獲得seed,然后在真空干燥機中干燥 (25℃、6 h),得到白色粉末.

(2) 先用去離子水配置一定量的SDS 水溶液 (3wt% (質(zhì)量百分比)).稱量0.1 g seed 分散在30 g SDS 水溶液中,超聲 (10 min、100 W)使其分散;將0.3 g 環(huán)己烷加至10 g SDS 水溶液中,超聲 (10 min、100 W) 使其乳化;將兩者一起加至250 mL 四頸燒瓶中,通氮氣20 min,在機械攪拌下反應溶脹10 h (25℃、200 r/min).

(3) 稱量0.15 g BPO 加至10 g SDS 水溶液中,超聲 (10 min、100 W) 后加至步驟(2)的反應溶液中,再將含5 g 苯乙烯、5 g EGDMA、1 g MAA、8 g 甲苯混合,加入上述反應溶液中,在機械攪拌下反應溶脹12 h (25℃、250 r/min).

(4) 將3 g 聚乙烯醇溶脹至100 g 水中,加熱至120℃,快速攪拌0.5 h 后溶解,冷卻至室溫 (或者將3 g PVP K-30 加至100 g 去離子水中,超聲溶解),隨后用滴管吸取,緩慢加入反應體系中,通冷凝回流裝置,水浴加熱至85℃,在機械攪拌下聚合反應12 h (250 r/min).

(5) 反應結(jié)束后,將制備好的微球分離純化.具體操作: 先將溶液離心 (10 000 r/min、10 min),得到沉淀,再加入去離子水超聲溶解,再離心,重復2 次.最后用乙醇洗1 次,離心得到沉淀,最后置于真空干燥機中干燥 (25℃、6 h、0.1 MPa),得到白色粉末,4℃冰箱中保存使用.

1.3 不同發(fā)射波長量子點(QDs)的制備

(1) 根據(jù)相關文獻[27],制備尺寸為6.5 nm 的QDs.稱量 0.4 mmoL CdO、4 mmoL 醋酸鋅、9.942 g OA、20 mL ODE 加至100 mL 圓底燒瓶中,將燒瓶置于磁力加熱攪拌器中,連接冷凝回流裝置并通N2,15 min 后將混合物加熱至150℃并攪拌 (600 r/min).待反應溶液變澄清之后,進一步加熱至308℃.

(2) 稱量0.3 mmol Se 粉和4 mmoL S 粉,加至3 mL TOP 中,隨后磁力加熱、攪拌溶解 (90℃、800 r/min、10 min),然后冷卻至室溫.最后加至上述反應體系(1) 中,將反應燒瓶溫度設置為300℃,反應10 min,以促進QDs 的生長.

(3) 反應結(jié)束后,將溶液分散至4 個50 mL 離心管中,每管加入10 mL 丙酮和10 mL 三氯甲烷,離心純化QDs 3 次,然后將離心所得全部沉淀物分散至10 mL 氯仿或環(huán)己烷中,得到發(fā)射波長為550 nm 的油溶性QDs.為了改變QDs 的光學特性,從而獲得多種發(fā)射波長,只需調(diào)節(jié)Se和S 物質(zhì)的量的比例,保持其他參數(shù)(如CdO、醋酸鋅、OA、ODE 或TOP、反應溫度、反應時間等)不變.

(4) 量子點作為探針分子連接抗體或者抗原的需要進一步親水改性.用巰基丙酸(MPA)代替附著在量子點表面的OA 制備水溶性量子點: 將20 mg QDs 與20 mL CHCl3超聲混合,打開通風櫥通風,加入4 mL MPA,磁力攪拌加熱 (70℃、500 r/min、1.5 h).反應結(jié)束后,將溶液在6 000 r/min 下離心,用三氯甲烷純化3 次,最終溶解至4 mL 去離子水中 (濃度約為5 mg/mL).

1.4 量子點摻雜多孔微球 (QDs@PS)

根據(jù)相關文獻[28],先將多孔微球溶脹,有利于量子點的摻雜和滲透.稱量1.2 節(jié)中制備好的 PS 固體粉末20 mg;量取10 mL 三氯甲烷、2 mL 異丙醇,混合超聲 (10 min,100 W);取1.3 節(jié)中未親水改性的油溶性QDs 400 μL 加入其中,超聲 (10 min、100 W),隨后放至真空干燥箱 (30℃、12 h、0.1 MPa).所有的溶劑揮發(fā)后,用乙醇和環(huán)己烷 (體積比為5∶1) 離心洗滌3 次.干燥,稱重,得到純化的QDs@PS.

1.5 偶聯(lián)抗體及免疫熒光反應檢測

1.5.1 量子點微球偶聯(lián)人IgG (捕獲分子)

將20 mg QDs@PS 加至活化緩沖液MES (1.2 mL、pH 6.0)、新鮮配制的EDC (400 μL、50 mg/mL)及NHS (400 μL、50 mg/mL) 中,旋轉(zhuǎn)30 min,使表面羧基活化;用PBS 離心洗滌3 次,除去過量的EDC和NHS.將活化的QDs@PS 重新分散在2 mL PBS (pH 7.4) 中,加入200 μL 人IgG (1 mg/mL),在搖床上共孵育3 h (37℃、250 r/min);隨后,用2 mL PBS (含有0.5% Tween-20) 離心洗滌3 次;最后分散在2 mL PBS 中,4℃冰箱中保存使用.按照同樣的方法,偶聯(lián)BSA 作為對照組.

1.5.2 水溶性量子點偶聯(lián)羊抗人IgG (探針分子)

根據(jù)相關文獻[29],將5 mg 上述水溶性量子點加入到EDC (400 μL、50 mg/mL) 及NHS (400 μL、50 mg/mL) 中,共孵育2 h (37℃、250 r/min),用PBS 離心洗滌3 次,隨后重新分散在2 mL PBS 中.再加入羊抗人IgG (200 μL、1 mg/mL),在搖床上共孵育3 h (37℃、250 r/min).最后用PBS 離心洗滌3 次,分散在10 mL PBS 中.

1.5.3 免疫熒光反應

取1.5.1 節(jié)中得到的偶聯(lián)兩種蛋白的捕獲分子各100 μL,分別加至1.5.2 節(jié)所述的檢測分子100 μL 中,在搖床上共孵育2 h (37℃、250 r/min),用PBS 離心洗滌3 次,分散在2 mL PBS 中,用熒光光譜儀檢測分析.

1.6 基于QDs@PS-IL-6 (一抗)和QDs-IL6 (二抗) 的雙抗夾心反應

按照1.5 節(jié)同樣的方法,制備得到QDs@PS 偶聯(lián)鼠抗-IL-6 (一抗) 捕獲分子和水溶性QDs 偶聯(lián)鼠抗-IL-6 (二抗) 探針分子.取1 mL (1 mg/mL) QD@PS-IL-6 (一抗) 與10 mg 待測抗原IL-6 混合,在搖床中共孵育2 h (37℃、250 r/min),隨后用PBS 離心洗滌3 次,分散在1 mL PBS 中.最后,加入1 mL(0.5 mg/mL) QDs-IL-6 (二抗) 納米探針,共孵育2 h (37℃、250 r/min).反應結(jié)束后,用PBS 離心洗滌3 次,用熒光光譜儀檢測分析.

1.7 量子點微球應用于流式檢測人血清樣本中的IL-6

按照1.6 節(jié)同樣的方法,將已知IL-6 濃度為40 pg/mL 的白血病患者血清樣本與QD@PS-IL-6(一抗) 共孵育2 h (37℃、250 r/min),離心洗滌后分散在PBS 中,再將QDs-IL-6 (Ⅱ) 加入其中,共孵育2 h (37℃、250 r/min),離心洗滌后分散在PBS 中.改變加入的白血病患者血清濃度(血清樣本取自同一患者的不同時刻),最后用流式檢測量子點探針熒光強度,每次檢測收集5 000 個微球.

1.8 表征

使用熒光光譜儀檢測量子點發(fā)射光譜,使用熒光顯微鏡觀察量子點發(fā)光情況,使用動態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering,DLS) 檢測微球粒徑,采用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)觀察微球的形貌和孔徑大小,結(jié)合Zeta 電位和傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜 (Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR) 檢測羧基,使用透射電子顯微鏡 (Transmission Electron Microscope,TEM) 觀察QDs 的形貌和大小,使用405 nm 激發(fā)光進行流式檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 微球的形態(tài)表征

微球的制備方法有很多,首先分別用沉淀[30]、分散[31]、種子聚合法[32](圖1) 合成了無孔的微球,根據(jù)圖1 的SEM 圖像顯示,種子聚合法制備的微球的粒徑和形貌最穩(wěn)定,所以下一步采用種子聚合法制備多孔的微球.本文使用的致孔劑為甲苯,羧基單體為MAA.如圖2 (a)—(c) 所示,微球具有良好的球形,平均粒徑約為5 μm,孔徑為幾十納米至幾百納米.因為量子點粒徑較小,不會超過20 nm,所以有利于進一步摻雜量子點.圖2 (d) 的紅外光譜圖顯示,加了MAA 之后,在1 726 cm–1處,有–C=O 特征峰;在2 600～3 200 cm–1處,有–OH 特征峰.而無MAA 的對照組圖像并無兩種峰的出現(xiàn),且結(jié)合圖2 (e) 含有MAA 微球的Zeta 電位和對照組比較,出現(xiàn)了左移,進一步驗證了微球表面羧基的存在,為進一步連接抗體提供了可能.

圖1 不同聚合法方法制備的無孔微球Fig.1 Pore-free microspheres prepared by different polymerization methods

2.2 量子點的合成及其形態(tài)表征

本文采用單步合成法制備CdSe/ZnS (核/殼) 量子點.由于徑向化學成分(或能級)梯度的存在,單步合成的量子點結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,有效地緩解了晶格失配,并將電子和空穴限制在核內(nèi).因為量子點的發(fā)射波長可以通過其組分含量的變化來改變,所以本文探究了Se和S 的物質(zhì)的量的比例,合成了幾種不同發(fā)射波長的量子點.如圖3 (a) 的TEM 圖所示,量子點呈不規(guī)則的方形結(jié)構(gòu),形貌規(guī)整,晶格明顯,分散性和均一性良好,尺寸為6.5 nm.圖3 (b) 的熒光發(fā)射光譜圖顯示,合成了4 種不同發(fā)射波長的量子點,Se、S 的物質(zhì)的量之比為0.2∶4.0,發(fā)射波長為540 nm;Se、S 的物質(zhì)的量之比為0.4∶2.5,發(fā)射波長為595 nm;Se、S 的物質(zhì)的量之比為0.4∶4.0,發(fā)射波長為565 nm;Se、S 的物質(zhì)的量之比為1∶2.5,發(fā)射波長為605 nm.量子點的峰形呈高斯分布且對稱,半峰寬均不超過40 nm.此外,該單步合成方法最多需要兩種表面活性劑(油酸和三辛基膦TOP),是一種直接、簡單、重復性好、經(jīng)濟的方法,可獲得大量發(fā)光性能高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的量子點.

圖2 多孔微球的形態(tài)表征Fig.2 Morphological characterization of microspheres

圖3 量子點的掃描透射電鏡圖 (a)和熒光光譜圖 (b)Fig.3 TEM (a) and photoluminescence (b) photographs of quantum dots

2.3 量子點在微球中的分布

為了獲得穩(wěn)定的量子點微球捕獲分子,需要將量子點有效地摻雜到多孔微球中.與異丙醇相比,氯仿更適于量子點的分散,并對聚合物珠體表現(xiàn)出良好的溶脹能力,氯仿溶劑也可以溶脹交聯(lián)的聚苯乙烯微球.本文將微球和發(fā)射波長為605 nm 的量子點分散在氯仿和異丙醇溶劑中,且超聲 (10 min、100 W) 混合,放置于真空干燥箱 (30℃、12 h、0.1 MPa),等待溶劑揮發(fā).在此過程中,氯仿將微球溶脹 (孔徑) 變大,利于量子點更好地進入.由于氯仿?lián)]發(fā)速度快,并隨著不斷地揮發(fā),利用兩種溶劑揮發(fā)速度的差距,氯仿濃度相對異丙醇減少,基于濃度梯度原理,量子點被動擴散到微球當中,當氯仿?lián)]發(fā)完全,微球恢復到原來的狀態(tài),量子點被牢牢地固定在微球當中.

量子點在微球中分布狀況很重要,如果只是分布在表面,說明量子點沒有進入孔內(nèi),亮度就會很弱.其次,量子點大量分布在微球表面,會影響微球表面功能團 (羧基) 與目標分子的連接.更重要的是,如果量子點在微球上分布不均勻,也會導致發(fā)光不均勻.例如: 一個微球上某部分發(fā)光強,某部分發(fā)光弱甚至不發(fā)光;或者有的微球上量子點分布多,有的較少,以上都不利于材料在生物檢測結(jié)果上的準確性.在熒光顯微鏡的觀察下(圖4),以綠光為激發(fā)光,在不同的倍鏡下 (圖4 (a)為10 倍,圖4 (b)為40 倍) 觀察,量子點均發(fā)出紅色的光,且發(fā)光明亮.進一步在100 倍油鏡下觀察到,當用白光為光源時 (圖4 (c)),可以清晰地看到量子點納米顆粒均勻地分布在微球中;當用綠光激發(fā)時 (圖4 (d)),微球顯示出很強的紅色熒光,并且亮度均勻,球形規(guī)整,說明量子點均勻地分布在微球當中.

圖4 熒光顯微鏡觀察量子點的分布狀況Fig.4 The distribution of quantum dots observed by a fluorescence microscope

2.4 量子點微球的熒光穩(wěn)定性

對于檢測應用,量子點微球應該在生理條件下保持其熒光的穩(wěn)定.以磷酸鹽緩沖鹽PBS (Phosphate Buffered Saline,pH=7.4) 溶液為培養(yǎng)基,測試量子點微球(590 nm)的穩(wěn)定性.樣品保存在此環(huán)境條件下,定期每兩天離心除去上清液,重新分散在等量的PBS 溶液中進行熒光光譜測量,觀察發(fā)射峰位置對應的熒光強度(圖5).從圖5 (a)可以看出,微球在PBS 溶液中保存兩周內(nèi)的熒光強度變化很小;從圖5 (b) 可以看出,量子點的熒光在第16 天仍保持明亮.結(jié)合兩張圖可以說明量子點熒光持久,且泄漏率很低 (不超過10%),良好的穩(wěn)定性為檢測提供了準確性.

圖5 量子點編碼微球的熒光在PBS 中隨時間變化的情況Fig.5 Fluorescence of quantum dot encoded microspheres over time in PBS

2.5 基于量子點微球檢測分子和量子點探針的熒光免疫分析

高性能熒光編碼微珠作為微流控蛋白芯片載體用于微球表面的羧基可作為DNA 序列、抗原或抗體的附著位點,功能微球上固定的抗原與抗體之間的免疫反應可用于評價QDs 編碼微球表面是否存在羧基.本文將制備的水溶性QDs (550 nm)與羊抗人IgG 抗體偶聯(lián)作為探針分子,人IgG 抗原或BSA (對照組) 與量子點微球 (605 nm) 偶聯(lián),對照組用來證明反應的特異性和有效性.免疫反應結(jié)束后,通過熒光光譜儀檢測,結(jié)果如圖6 (a)和(b) 所示.實驗組同時出現(xiàn)了兩個峰,對應于捕獲微球 (605 nm)和量子點探針 (550 nm) 的兩個量子點的發(fā)射峰;而對照組BSA 只出現(xiàn)了捕獲微球上量子點的峰(605 nm).由此可以說明: ①量子點微球上羧基的引入成功應用于抗原抗體的偶聯(lián);② 由于抗原抗體之間存在特異性,實驗組出現(xiàn)了兩個峰,而對照組只出現(xiàn)了一個峰,驗證了反應的特異性結(jié)合,排除了非特異性反應的干擾.

驗證了羧基化量子點熒光編碼微球羧基的活性及免疫反應的特異性后,本文進一步研究了對白血病高表達抗原白介素-6 (IL-6) 的三明治免疫夾心反應,免疫反應流程見圖7.首先,將QDs (605 nm)編碼的微球與抗IL-6 (一抗) 連接,水溶性QDs (550 nm) 與抗IL-6 (二抗) 連接,一抗和二抗之間不發(fā)生反應,但均可和IL-6 發(fā)生特異性反應,且與IL-6 的反應位點不同,避免了競爭反應的發(fā)生.先將IL-6與量子點微球反應,再加入量子點探針,反應結(jié)束后,通過熒光光譜儀檢測.結(jié)果如圖6 (c) 所示,同時出現(xiàn)了兩個量子點的發(fā)射峰,成功將材料應用三明治反應連接IL-6 抗原.

2.6 基于量子點微球的流式檢測白血病IL-6

驗證了三明治免疫反應的可行性后,進一步將量子點微球用于流式檢測白血病血清樣本中的IL-6.首先用流式細胞儀檢測了微球的粒徑分布(圖8 (a)和(b)),微球尺寸分布均一.定量檢測生物分子的能力,如癌癥生物標志物,需具有足夠的穩(wěn)定性和特異性,這對癌癥診斷和術后監(jiān)測非常重要.首先挑選出同一患者不同時期的血清,并用流式檢測得到血清中的IL-6 濃度,將不同濃度相同體積的血清與量子點微球共孵育,再加入550 nm QDs.免疫反應后,通過流式細胞儀測定量子點探針的熒光強度,每組檢測時收集5 000 個微球,結(jié)果如圖8 (c) 所示.隨著白血病血清濃度的增加,550 nm QDs 探針分子的熒光強度也逐漸增加,并計算平均熒光強度 (Mean Fluorescence Intensity,MFI)值,得到相應的曲線,如圖8 (d)所示.IL-6 濃度為120～450 pg/mL 時,圖線幾乎為直線,說明MFI 與IL-6 的濃度在此范圍內(nèi)具有線性關系,因此,可以通過計算量子點的MFI 來表示血清中IL-6 的濃度.

圖6 IL-6 與量子點微球免疫反應原理流程圖Fig.6 Flowchart of immune reaction mechanism between IL-6 and quantum dot encoded microspheres

圖7 免疫反應后的熒光光譜圖Fig.7 PL photographs of quantum dots after an immune reaction

3 總結(jié)

綜上所述,本文成功研究了一種檢測白血病血清中高表達抗原的檢測方法.在材料方面,制備了多孔的羧基化聚苯乙烯微球 (PS),并成功將量子點摻雜進整個微球 (QD@PS),PS 的SEM 圖像和流式細胞術數(shù)據(jù)顯示,PS 具有良好的球形和均勻的粒徑部分,為其在診斷分析和成像方面的潛在應用奠定了堅實的基礎.熒光顯微鏡圖像表明,采用甲苯作為致孔劑時,量子點已經(jīng)分布到整個微球,并且熒光明亮,強度均勻.穩(wěn)定性實驗表明,熒光能至少保持兩周.同時,免疫分析對人IgG和IL-6 檢測的性能表明,量子點微球表面的羧基有利于生物大分子的高效附著,從而成功應用于雙抗夾心反應.最后結(jié)合流式,成功實現(xiàn)了量子點微球?qū)Π籽⊙逯蠭L-6 的定量檢測,這對白血病及其他血液疾病的診斷有很大意義,并且具有臨床轉(zhuǎn)化和商業(yè)應用的潛力.

圖8 微球與白血病患者血清中IL-6 抗原免疫反應后的流式分析Fig.8 Flow cytometry analysis of immunoreactive IL-6 antigen in the serum of leukemia patients with microspheres