IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞CXCR4表達(dá)及腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移及凋亡能力的影響①

蔣雅玲 胡學(xué)麗 陳 輝 段 智 劉 景 范先成 （長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院乳甲外科，長(zhǎng)沙 410005）

乳腺癌是臨床常見(jiàn)癌癥之一，同樣也是導(dǎo)致女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。隨著人口老齡化與生活方式改變，過(guò)去十幾年我國(guó)乳腺癌發(fā)病率急劇上升，且發(fā)病人群呈明顯年輕化趨勢(shì)［1］。盡管近年乳腺癌診療技術(shù)顯著提高，但局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是影響患者預(yù)后的主要因素。因此，積極探究乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制具有重要意義［2］。

人黑色素瘤分化相關(guān)基因-7（melanoma differentiation associated gene 7，MDA-7）是近年被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的抑癌基因IL-10家族成員，根據(jù)其生物學(xué)特性和染色體定位又被命名為IL-24。內(nèi)源性IL-24多表達(dá)于外周血單個(gè)核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及黑色素細(xì)胞等，但其在多種腫瘤細(xì)胞中呈缺失狀態(tài)［3］。臨床前研究表明，外源性IL-24在體內(nèi)體外均具有廣譜抗腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移活性，如黑色瘤、肺癌及乳腺癌等［3-5］。但I(xiàn)L-24在各種腫瘤中的具體作用機(jī)制不盡相同，其在乳腺癌中的抗癌機(jī)制尚未完全闡明。

趨化因子是一類具有趨化活性的龐大家族，研究證實(shí)趨化因子不僅參與炎癥反應(yīng)及免疫監(jiān)控過(guò)程，還參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展。大量數(shù)據(jù)表明乳腺癌組織中存在多種趨化因子受體及配體表達(dá)，其中以CX-C趨化因子受體4（CX-Cchemokine receptor 4，CXCR4）及其配體CXCL12表達(dá)最為顯著［6］。同時(shí)，多中心回顧性研究證實(shí)CXCR4表達(dá)增加與腫瘤高復(fù)發(fā)率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較短生存期相關(guān)［7］。此外，在其他實(shí)體腫瘤中同樣證實(shí)CXCR4及其配體CXCL12可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移［8］。細(xì)胞中CXCR4/CXCL12主要通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用，而IL-24可直接調(diào)控該信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移［4，9］。因此課題組猜測(cè)，在乳腺癌中IL-24可能通過(guò)抑制高表達(dá)的CXCR4而發(fā)揮抑癌作用。AMD3100作為CXCR4/CXCL12軸的阻滯劑，可特異性地與CXCR4結(jié)合阻斷該軸信號(hào)傳導(dǎo)，從而有效抑制其生物學(xué)效應(yīng)［10］。鑒于以上研究背景，本研究擬采用慢病毒過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞中IL-24以探究其對(duì)CXCR4的影響及相關(guān)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 收集2018年1月至2019年12月于長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院乳甲外科行乳腺癌手術(shù)治療的乳腺癌組織50例，術(shù)后病理證實(shí)為乳腺癌，其中TNM分型Ⅰ期28例，Ⅱ期19例，Ⅲ期3例；病理分型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌33例，浸潤(rùn)性小葉癌14例，混合癌3例；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，未見(jiàn)腋窩淋巴結(jié)28例。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或免疫治療，年齡25～63歲，中位年齡42歲。另取距腫瘤邊緣＞3 cm的正常乳腺組織作為對(duì)照。本研究經(jīng)長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬知情同意。

1.1.2 細(xì)胞系及主要試劑 人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-231（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）；RPMI1640、L-15培養(yǎng)基、MCF-10A細(xì)胞專用培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone）；CXCR4/CXCL12軸阻滯劑AMD3100（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清（FBS，英國(guó)Gbico公司）；TRIzol（美國(guó)Thermo公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Abcam公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real-time PCR（北京天根生化科技有限公司）；IL-28過(guò)表達(dá)慢病毒（LV-IL-28）和陰性對(duì)照慢病毒（LV-NC）由上海吉?jiǎng)P基因生物公司構(gòu)建；Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司）；Transwell小室（8μm，美國(guó)Millipore公司）；大鼠抗p-mTOR、mTOR單克隆抗體（美國(guó)CST公司）；大鼠抗p-AKT、AKT、Bax、cleaved-Caspase-3、GAPDH單克隆抗體（美國(guó)Acris公司）；大鼠抗CXCR4單克隆抗體（美國(guó)Pierce Biotech公司）；HRP標(biāo)記的兔抗大鼠二抗、Annexin V-FITC凋亡試劑盒（武漢博士德生物公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒感染及分組 MCF-10A細(xì)胞采用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，MDA-MB-453與MDAMB-231細(xì)胞采用含10%FBS的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)，MCF-7細(xì)胞采用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均為：37℃、5%CO2，隔日更換培養(yǎng)液。取第3代以后且生長(zhǎng)狀況良好的MDA-MB-231細(xì)胞用于感染慢病毒：調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至50%時(shí)，加入預(yù)先用Opti-MEM稀釋的病毒液（MOI=15），24 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，將培養(yǎng)基更換為含2μg/ml嘌呤霉素與10%FBS的L-15培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)基，3 d后得到穩(wěn)定傳代的感染細(xì)胞。取慢病毒感染后的MDA-MB-231細(xì)胞，按處理?xiàng)l件不同分為5組：LV-IL-24組（感染過(guò)表達(dá)IL-24慢病毒）、LV-NC組（感染陰性對(duì)照慢病毒）、AMD3100組（給予100 ng/ml AMD3100）、LV-IL-24+AMD3100組（采用含100 ng/ml AMD3100培養(yǎng)的感染過(guò)表達(dá)IL-24慢病毒的細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（正常培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞）。將上述細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，若無(wú)特殊說(shuō)明，以下實(shí)驗(yàn)均取培養(yǎng)24 h的各組MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色（immuno-histochemical staining，IHC） 取石蠟包埋的乳腺癌組織，切片（4μm），常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫孵育，微波加熱恢復(fù)抗原，山羊血清封閉，分別滴加抗CXCL12（1∶1 000）與CXCL4（1∶800）的一抗，4℃孵育過(guò)夜，添加HRP標(biāo)記的二抗，DAB染色液染色，中性樹(shù)脂封片，光鏡下拍照觀察。

1.2.3 RT-PCR 取慢病毒感染后的MDA-MB-231細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參考SYBR Green Real-time PCR試劑說(shuō)明進(jìn)行RTPCR，引物序列為IL-24 F：5＇-AAGCCTGTGGACTTTAGCCAGACC-3＇，IL-24 R：5＇-GCACTCGTGATGTTATCCTGAGC-3＇；GAPDH F：5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3＇，GAPDH R：5＇-AGTACACCCATCGAATTCCAGT-3＇，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法分析。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.4 ELISA 按照IL-24 ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)感染慢病毒后MDA-MB-231細(xì)胞上清中IL-24表達(dá)。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 預(yù)先采用稀釋的Martrigel基質(zhì)膠包被Transwell上室，取轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞，常規(guī)消化，以不含F(xiàn)BS的L-15培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，2×105個(gè)/孔接種至Transwell上室，加入200μl無(wú)血清培養(yǎng)基。分組處理按1.2.1進(jìn)行。下室加入600μl含10%FBS的常規(guī)L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。取出上室，無(wú)水乙醇固定，結(jié)晶紫染色，雙蒸水沖洗，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察拍照，計(jì)數(shù)各組穿膜細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 以2×105個(gè)/孔將上述感染的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí)，用移液器槍頭垂直培養(yǎng)皿底部劃2條間隔為5 mm的橫線，按1.2.1分組干預(yù)，并將培養(yǎng)基更換為含2%FBS的L-15繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察拍照，NIS-Elements軟件測(cè)量細(xì)胞間距離并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取1.2.1中各組細(xì)胞，800 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，按Annexin V-FITC試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色、孵育。過(guò)濾細(xì)胞團(tuán)塊后上機(jī)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot 取待測(cè)細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，聯(lián)合使用RIPA細(xì)胞裂解液與蛋白酶抑制劑提取總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量，加熱變性。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗：CXCR4（1∶600）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶800）、mTOR（1∶1 000）、p-mTOR（1∶800）、Bax（1∶1000）、cleaved-Caspase-3（1∶800）、GAPDH（1∶2 000）4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST清洗，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST再次清洗，均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀曝光拍照。Bio-Rad圖像軟件分析，以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的LSD-t檢驗(yàn)，免疫組化陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)；采用秩相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中CXCL12與CXCR4表達(dá) IHC結(jié)果顯示，CXCL12和CXCR4在癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為12.0%（6/50）、18.0%（9/50），在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.0%（41/50）、78.0%（39/50）。與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中CXCL12與CXCR4表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖1）；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CXCL12與CXCR4表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.613，P＜0.05，表1）。

表1 乳腺癌組織CXCL12與CXCR4表達(dá)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between CXCL 12 and CXCR4 expressions in breast cancer tissue

2.2 乳腺癌細(xì)胞中CXCR4表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231中CXCR4表達(dá)顯著增加（P＜0.01），MDA-MB-231細(xì)胞變化最為顯著，故選擇該細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2）。

圖2 乳腺癌細(xì)胞系中CXCR4表達(dá)Fig.2 Expression of CXCR4 in breast cancer cell lines

2.3 慢病毒感染后乳腺癌細(xì)胞IL-24表達(dá) 熒光顯微鏡觀察感染72 h后的感染效率，結(jié)果顯示感染LV-NC與LV-IL-24的MDA-MB-231細(xì)胞可見(jiàn)明顯綠色熒光信號(hào)表達(dá)，且轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上，而陰性對(duì)照組細(xì)胞無(wú)綠色熒光信號(hào)產(chǎn)生（圖3A）；RT-PCR和ELISA結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，感染LVIL-24慢病毒的乳腺癌細(xì)胞IL-24 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05），而感染LV-NC的細(xì)胞IL-24mRNA及蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3B、C）。

圖3 慢病毒感染后乳腺癌細(xì)胞中IL-24表達(dá)Fig.3 IL-24 expression in breast cancer cells after lentivirus infection

2.4 過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響 Transwell檢測(cè)過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲的影響，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比，LV-IL-24組、AMD3100組、LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞侵襲能力顯著降低（P＜0.05），LV-IL-24+AMD3100組降低最為顯著（P＜0.01），LV-NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響Fig.4 Effects of overexpression of IL-24 on invasion of breast cancer cells

2.5 過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移能力的影響，結(jié)果表明：與陰性對(duì)照組相比，LV-IL-24組、AMD3100組、LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞遷移能力顯著降低（P＜0.05），LV-IL-24+AMD3100組降低最為顯著（P＜0.01），LV-NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

圖1乳腺癌組織與癌旁正常組織CXCL12與CXCR4表達(dá)（IHC，×400）Fig.1 Expressions of CXCL 12 and CXCR4 in breast cancer and para-carcinoma tissues（IHC，×400）

圖5 過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響Fig.5 Effects of overexpression of IL-24 on migration of breast cancer cells

圖7過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞CXCR4與AKT/mTOR信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)的影響Fig.7 Effects of overexpression of IL-24 on expressions of CXCR4 and AKT/mTOR signaling pathways and apoptosis-related proteins Bax and Caspase-3 in breast cancer cells

2.6 過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC細(xì)胞流式檢測(cè)過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡的影響，結(jié)果表明：與Control組細(xì)胞相比，LV-IL-24組，AMD3100組，LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05），其中以LV-IL-24+AMD3100組升高最為顯著（P＜0.01），LV-NC組無(wú)明顯變化（P＞0.05，圖6）。

圖6 過(guò)表達(dá)IL-24促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡Fig.6 Overexpression of IL-24 promotes apoptosis of breast cancer cells

2.7 過(guò)表達(dá)IL-24對(duì)CXCR4、AKT/mTOR信號(hào)通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果如圖7所示，與陰性對(duì)照組相比，LV-IL-24組、AMD3100組、LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)與AKT和mTOR磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），LV-IL-24+AMD3100組降低趨勢(shì)最為顯著（P＜0.01），LV-NC組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與陰性對(duì)照組相比，LV-IL-24組、AMD3100組、LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax與Caspase-3表達(dá)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），IL-24+AMD3100組升高趨勢(shì)最為顯著（P＜0.01，P＜0.001），LV-NC組細(xì)胞Bax與Caspase-3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移模擬了正常生理過(guò)程的多種機(jī)制，如由趨化因子系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)的白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及歸巢，即腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)其表達(dá)的趨化因子受體向分泌該配體的組織或器官進(jìn)行特定轉(zhuǎn)移［11］。而眾多趨化因子受體中，CXCR4在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4與其配體CXCL12相互作用后能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲并抑制其凋亡，而臨床研究同樣證實(shí)高表達(dá)CXCR4的乳腺癌患者具有更高的腫瘤復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移活性［6-7］。本研究通過(guò)IHC檢測(cè)CXCR4與CXCL12在乳腺癌與癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)結(jié)果同樣表明，CXCR4與CXCL12在乳腺癌中的表達(dá)較健康人群明顯升高，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)。

近年IL-24因其對(duì)人黑色瘤生長(zhǎng)及分化的影響而備受關(guān)注。大量數(shù)據(jù)顯示，IL-24可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但其對(duì)正常細(xì)胞卻無(wú)明顯毒性，且內(nèi)源性IL-24多表達(dá)于免疫相關(guān)組織與細(xì)胞，如脾臟、胰腺及T細(xì)胞、B細(xì)胞，但多數(shù)人類起源的癌細(xì)胞中，IL-24表達(dá)呈缺失狀態(tài)，同樣提示IL-24可能具有抑癌活性［12-13］。但I(xiàn)L-24抑制腫瘤的機(jī)制較為復(fù)雜，其在不同腫瘤類型中涉及的信號(hào)通路也可能存在差異。如在黑色素瘤中，IL-24能夠通過(guò)p38MAPK與ERK信號(hào)通路促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［14］；而膠質(zhì)瘤中IL-24能夠活化JNK信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終通過(guò)線粒體途徑下調(diào)腫瘤細(xì)胞存活率［15］。此外，研究表明IL-24還能夠通過(guò)抑制口腔鱗癌與肺腺癌細(xì)胞中CXCR4表達(dá)抑制腫瘤進(jìn)展［16-17］。最新研究表明IL-24能夠通過(guò)磷脂酰肌醇-3（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路在體內(nèi)外抑制乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)其凋亡［18］。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其中PI3K是一種異質(zhì)二聚體，通過(guò)其跨膜受體的胞外結(jié)構(gòu)域與環(huán)境中的各種受體，如生長(zhǎng)因子、G蛋白偶聯(lián)受體等相互作用，引起自身構(gòu)象改變而被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)下游AKT磷酸化，并使其與胞膜分離，釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，活化一系列底物并使后者發(fā)生磷酸化，其中最重要的為mTOR［19］。而PI3K/AKT/mTOR是CXCR4/CXCL12在乳腺癌中的主要作用機(jī)制。CXCR4與CXCL12特異性結(jié)合后可激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)域G蛋白偶聯(lián)受體，從而啟動(dòng)上述信號(hào)通路［8，20］。本研究首先選取CXCR4表達(dá)最為顯著的乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231進(jìn)行研究，隨后采用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)細(xì)胞中的IL-24，驗(yàn)證感染效率后，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)IL-24能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移，促進(jìn)其凋亡，且聯(lián)合使用AMD3100時(shí)，IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞上述生物學(xué)行為的影響更為顯著。Western blot進(jìn)一步表明，IL-24在乳腺癌中同樣能夠抑制CXCR4表達(dá)，同時(shí)下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax與Caspase-3表達(dá)。提示在乳腺癌中IL-24一方面能夠通過(guò)抑制CXCR4表達(dá)，一方面能通過(guò)PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮對(duì)CXCR4/CXCL12軸的抑制作用，且聯(lián)合應(yīng)用AMD3100后其抑癌效果更為顯著，與其在肺癌中的作用途徑相似，即均能通過(guò)抑制CXCR4表達(dá)及下游PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮作用，而聯(lián)合應(yīng)用CXCR4拮抗劑AMD3100療效更佳［21］。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)IL-24可抑制CXCR4表達(dá)，通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路降低腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力，促進(jìn)其凋亡，且聯(lián)合使用CXCR4/CXCL12阻滯劑AMD3100可顯著提高IL-24的上述抑癌效應(yīng)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)IL-24在乳腺癌發(fā)展進(jìn)程中具有潛在保護(hù)作用，而IL-24有望成為乳腺癌治療的新策略。