益氣散結(jié)方對(duì)氣陰兩虛型食管癌化療患者Th17/Treg免疫平衡及NF-κB蛋白含量的影響

邵 璟（山東省東營(yíng)市勝利醫(yī)院中醫(yī)科，東營(yíng) 257055）

中國(guó)食管癌病死人數(shù)約占惡性腫瘤總病死人數(shù)的16.1%，僅次于胃癌、肝癌與肺癌，位居第4，且發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)［1-2］?；熓乾F(xiàn)階段臨床治療食管癌，尤其是中晚期食管癌的首選手段，可殺死腫瘤細(xì)胞，延緩生命周期，但由于細(xì)胞毒物無(wú)法識(shí)別腫瘤細(xì)胞，一定程度損害機(jī)體正常細(xì)胞，加重惡心嘔吐等毒副反應(yīng)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)在減輕化療所致毒副反應(yīng)方面具有顯著作用，認(rèn)為食管癌歸屬于“噎噻”“噎膈”等范疇，屬氣陰兩虛型，其發(fā)病機(jī)制為長(zhǎng)期情志郁結(jié)、脾胃損傷致使運(yùn)化失常，故應(yīng)從益氣健脾、化瘀散結(jié)等方面入手治療［4］。益氣散結(jié)方在消癰散結(jié)、清熱解毒、開(kāi)宣肺氣等方面作用突出。另外，NF-κB是一條炎癥相關(guān)信號(hào)通路，通常以p50/p65異二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)，可能調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥免疫應(yīng)答等生理病理反應(yīng)［5］。陳甜甜等［6］研究指出，長(zhǎng)期炎癥刺激下，Th17/Treg免疫失衡在慢性炎癥發(fā)展過(guò)程中可能起重要作用，故維持Th17/Treg平衡有望成為“炎癌轉(zhuǎn)化”的潛在治療手段?；诖?，本研究將益氣散結(jié)方用于氣陰兩虛型食管癌化療患者，分析其療效，并明確其對(duì)生存質(zhì)量、Th17/Treg免疫平衡及NF-κB蛋白含量的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取2014年3月至2017年3月于山東省東營(yíng)市勝利醫(yī)院就診的60例氣陰兩虛型食管癌患者，隨機(jī)分為研究組、對(duì)照組，每組30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)X線鋇餐、胃鏡或病理檢查確診為食管癌；②臨床分期ⅡB～Ⅲ期；③預(yù)計(jì)生存時(shí)間12周以上；④KPS評(píng)分＞60分；⑤臨床資料完整；⑥患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有紫杉醇、順鉑等藥物過(guò)敏史者；②凝血機(jī)制紊亂或活動(dòng)性出血者；③對(duì)化療耐受度較差者；④心腦血管疾病者；⑤合并腎、肺等重要臟器器質(zhì)性病變者；⑥合并繼發(fā)性或原發(fā)性視力減退、溝通不暢或聽(tīng)力下降者；⑦合并意識(shí)不清、心源性休克或精神疾病，無(wú)法主動(dòng)配合研究者。診斷標(biāo)準(zhǔn)：①西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)為均符合《中國(guó)早期食管癌篩查及內(nèi)鏡診治專家共識(shí)意見(jiàn)（2014年，北京）》［7］食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②中醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)為均屬氣陰兩虛型，且癥見(jiàn)胸膈痞滿、四肢困乏、吞咽哽噎，舌苔薄膩，脈弦緊。兩組患者基本資料（年齡、病變部位、性別、體質(zhì)量指數(shù)、臨床表現(xiàn)、臨床分期）具有可比性（P＞0.05，表1）。本研究經(jīng)山東省東營(yíng)市勝利醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組一般資料比較（n=30）Tab.1 Comparison of general data between two groups（n=30）

1.1.2 主要試劑與儀器 地塞米松（江蘇朗歐藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32026441）；苯海拉明（北京太洋藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H11020888）；西咪替丁（廣東沙溪制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44023767）；紫杉醇（山西普德藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20053005）；順鉑（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20043889）；FITC標(biāo)記鼠抗人CD4單抗、PE標(biāo)記鼠抗人FOXP3單抗及PC5標(biāo)記的鼠抗人CD25單抗（艾美捷科技有限公司）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組治療前12 h口服10 mg地塞米松；治療前30 min口服50 mg苯海拉明+靜脈注射200 mg西咪替丁。對(duì)照組在此基礎(chǔ)上第1天靜脈滴注140 mg/m2紫杉醇+500 ml生理鹽水，連續(xù)3 h，第1～5天靜脈滴注50 mg/m2順鉑+100 ml生理鹽水，連續(xù)2 h，5 d為1個(gè)療程，連續(xù)治療2個(gè)療程。研究組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用益氣散結(jié)方：甘草5 g、淫羊藿10 g、半夏12 g、山慈菇10 g、石見(jiàn)穿20 g、天冬10 g、女貞子12 g、桔梗10 g、枳殼10 g、萎皮10 g、夏枯草15 g、白蚤休20 g、北沙參15 g、生黃芪20 g，胸膜受侵或胸痛者加瓜萎皮20 g、川芎15 g、延胡索20 g，氣急或胸水者加豬苓15 g、半邊蓮25 g、龍葵15 g、葶藶子20 g，咯血不止者加白茅根20 g、三七末6 g、仙鶴草15 g。水煎取汁，100 ml/次，bid，7 d為1個(gè)療程，連續(xù)治療2個(gè)療程。

1.2.2 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 參照WHO實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估兩組療效。疾病進(jìn)展：腫瘤最大直徑與最大垂直徑乘積升高＞25%，或出現(xiàn)新病灶；疾病穩(wěn)定：介于部分緩解/疾病進(jìn)展；部分緩解：腫瘤最大直徑與最大垂直徑乘積下降＞50%，至少維持4周；完全緩解：腫瘤完全消失，且至少維持4周?？陀^有效率（%）=（完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.2.3 觀察指標(biāo) ①治療效果；②比較兩組治療前后Th17、Treg水平：采用含抗凝劑的試管收集患者空腹外周靜脈血4 ml，室溫保存，12 h內(nèi)檢測(cè)，最大限度保持細(xì)胞自然狀態(tài)，抗體孵育前采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106～2×106個(gè)/L，細(xì)胞涂片預(yù)估細(xì)胞數(shù)、瑞式染色法觀察形態(tài)學(xué)變化，流水緩慢沖洗干凈玻片，自然干燥，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)各細(xì)胞數(shù)，觀察是否出現(xiàn)異常細(xì)胞。Treg：取2支試管分別作為1號(hào)空白對(duì)照管與2號(hào)標(biāo)本檢測(cè)管，向2號(hào)管中分別加入FITC標(biāo)記鼠抗人CD4單抗、PE標(biāo)記鼠抗人FOXP3單抗及PC5標(biāo)記的鼠抗人CD25單抗，2管均添加100μl全血，室溫避光孵育15 min，2管內(nèi)分別加入2 ml紅細(xì)胞裂解液室溫避光孵育10 min，溶液透明清澈后離心棄上清，PBS洗滌，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Th17細(xì)胞：收集細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)細(xì)胞活性，加入CD3-APC單克隆抗體與CD8a-FITC單克隆抗體室溫避光孵育30 min，PBS洗2次，固定液避光固定反應(yīng)20 min，離心棄上清，PBS洗2次，添加破膜劑，細(xì)胞打孔，離心棄上清，染色，測(cè)定管內(nèi)添加PE標(biāo)記的IL-17，對(duì)照組管添加同型對(duì)照，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，流式細(xì)胞儀檢測(cè)；③Western blot檢測(cè)兩組治療前后NF-κBp50、p65蛋白含量，嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，取食管癌組織按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取全細(xì)胞蛋白，去培養(yǎng)液，PBS沖洗2～3次，冰上裂解10～20 min，細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，收集至Eppendorf管，超聲（100～200 w）3 s，2次。4℃、12 000 g離心2 min，取少量上清進(jìn)行定量。所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer，上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗、二抗，圖像分析系統(tǒng)掃描分析；④KPS評(píng)分對(duì)比兩組治療前后生存質(zhì)量，總分100分，得分與生存質(zhì)量呈正相關(guān)；⑤統(tǒng)計(jì)兩組不良反應(yīng)（惡心、嘔吐、血小板下降、白細(xì)胞下降）發(fā)生率；⑥隨訪18個(gè)月，比較兩組生存率；⑦分析典型病例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以［n（%）］表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療效果 兩組患者治療總有效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 兩組治療有效率對(duì)比［例（%），n=30］Tab.2 Comparison of effective rate between two groups［n（%），n=30］

2.2 Th17/Treg免疫平衡 兩組Th17、Treg治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；研究組治療后Th17、Treg、Th17/Treg較對(duì)照組降低（P＜0.001，表3、圖1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)治療前后外周血Th17、Treg情況Fig.1 Flow cytometry to detect Th17 and Treg in peripheral blood before and after treatment

表3 兩組Th17/Treg免疫平衡對(duì)比（±s，n=30，%）Tab.3 Comparison of Th17/Treg immune balance between two groups（±s，n=30，%）

表3 兩組Th17/Treg免疫平衡對(duì)比（±s，n=30，%）Tab.3 Comparison of Th17/Treg immune balance between two groups（±s，n=30，%）

Groups Research Control t P Th17 Before therapy 3.48±0.29 3.51±0.30 0.394 0.695 After treatment 0.80±0.42 1.38±0.59 4.387＜0.001 Treg Before therapy 7.61±1.19 7.23±1.36 1.152 0.254 After treatment 4.39±1.05 5.84±1.63 4.096＜0.001 Th17/Treg Beforetherapy 0.46±0.15 0.49±0.16 0.749 0.457 After treatment 0.18±0.05 0.24±0.07 3.820＜0.001

2.3 NF-κB蛋白含量 兩組NF-κB p50、p65蛋白含量治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；研究組治療后NF-κB p50、p65蛋白含量較對(duì)照組降低（P＜0.05，表4、圖2）。

圖2 Western blot檢測(cè)治療前后食管癌組織NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of NF-κB p65 protein in esophageal carcinoma tissues before and after treatment detected by Western blot

表4 兩組NF-κB p50、p65蛋白含量對(duì)比（±s，n=30）Tab.4 Comparison of protein contents of NF-κB p50 and p65 between two groups（±s，n=30）

表4 兩組NF-κB p50、p65蛋白含量對(duì)比（±s，n=30）Tab.4 Comparison of protein contents of NF-κB p50 and p65 between two groups（±s，n=30）

Groups Research Control t P p50 Before therapy 1.37±0.32 1.35±0.30 0.250 0.804 After treatment 0.52±0.15 0.70±0.23 3.590 0.001 p65 Before therapy 5.47±2.85 6.32±3.11 1.104 0.274 After treatment 2.19±0.53 3.23±0.67 6.668＜0.001

2.4 不良反應(yīng)發(fā)生率 兩組Ⅲ～Ⅳ級(jí)惡心、嘔吐、白細(xì)胞、血小板下降發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究組Ⅰ～Ⅱ級(jí)惡心、嘔吐發(fā)生率較對(duì)照組降低（P＜0.05，表5）。

表5 兩組不良反應(yīng)發(fā)生率［例（%），n=30］Tab.5 Incidence of adverse reaction between two groups［n（%），n=30］

2.5 KPS評(píng)分 兩組治療前KPS評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；研究組治療后KPS評(píng)分較對(duì)照組升高（P＜0.001，表6）。

表6 兩組KPS評(píng)分（±s，n=30）Tab.6 KPSscores between two groups（±s，n=30）

表6 兩組KPS評(píng)分（±s，n=30）Tab.6 KPSscores between two groups（±s，n=30）

Groups Research Control t P Before therapy 72.86±6.52 73.15±6.98 0.166 0.869 After treatment 87.15±6.31 80.56±6.32 4.042＜0.001

2.6 生存率 觀察組脫落2例，對(duì)照組脫落3例。兩組治療后12、16、18個(gè)月生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表7、圖3）。

圖3 生存分析Fig.3 Survival analysis

表7 兩組生存率［例（%）］Tab.7 Survival rate between two groups［n（%）］

2.7 研究組典型病例 男，59歲，入院后經(jīng)中醫(yī)辨證分型為氣陰兩虛型食管癌，給予益氣散結(jié)方聯(lián)合化療后，影像學(xué)顯示病灶消失，典型圖片見(jiàn)圖4。

圖4 治療前后病灶影像學(xué)圖像Fig.4 Imaging images of lesions before and after treatment

3 討論

目前臨床尚未明確食管癌發(fā)病機(jī)制，多認(rèn)為其與癌基因、抑癌基因等因素有關(guān)，多數(shù)患者早期無(wú)特異性癥狀，確診時(shí)已處于中晚期，喪失最佳手術(shù)時(shí)機(jī)［8-10］?；熓乾F(xiàn)階段臨床針對(duì)中晚期食管癌的主要治療手段，能縮小腫瘤體積，減輕臨床癥狀，提高患者生存質(zhì)量。但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，化療可加重機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷，嚴(yán)重者可增加食管癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［11］。因此積極探索有效治療方案是目前臨床急需解決的問(wèn)題。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，食管癌病理機(jī)制為正虛邪戀、陰血虧虛，邪毒內(nèi)侵致使痰凝、氣滯、血瘀［12］。且《癥因脈治·噎膈論》認(rèn)為：“內(nèi)傷噎膈之證，飲食之間漸覺(jué)難下，或下咽稍急，即噎胸前，如此旬月，日甚一日，漸至每食必噎，只食稀粥、不食干糧”。進(jìn)一步說(shuō)明正氣匱乏、邪毒侵體是氣陰兩虛型食管癌的發(fā)病基礎(chǔ)。故治療過(guò)程中應(yīng)以補(bǔ)氣固本為主，散結(jié)驅(qū)邪為輔。益氣散結(jié)方主要由甘草、淫羊藿、半夏、山慈菇、石見(jiàn)穿、天冬、女貞子、桔梗、枳殼、瓜萎皮、夏枯草、白蚤休、北沙參、生黃芪等組成，可散結(jié)解毒、益氣滋陰，其中女貞子、生黃芪為君藥，補(bǔ)氣固本、滋養(yǎng)肝腎；夏枯草、山慈菇、天冬、石見(jiàn)穿、白蚤休、北沙參為臣藥，有清熱解毒、清心潤(rùn)肺、活血祛瘀、攻積散結(jié)之功；淫羊藿、半夏、瓜萎皮、枳殼為佐藥，有調(diào)肺腑、祛痰結(jié)、降逆止嘔、理氣寬中之效；甘草、桔梗為使藥，可調(diào)和諸藥，祛痰宣肺?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，益氣散結(jié)方能增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［13-14］。本研究在紫杉醇、順鉑治療基礎(chǔ)上首次加用益氣散結(jié)方，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組治療總有效率及隨訪12、16、18個(gè)月生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與本研究樣本量較小有關(guān)。

研究顯示，NF-κB可刺激TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB活化，形成持續(xù)或放大炎癥反應(yīng)，而慢性炎癥可通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，募集炎癥細(xì)胞，引起氧化損傷，促使正常細(xì)胞癌變，最終引發(fā)腫瘤［15-16］。Th17可結(jié)合體內(nèi)炎癥因子共同參與炎癥反應(yīng)表達(dá)，Treg可通過(guò)分泌免疫抑制因子與直接抑制免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。研究顯示，Th17/Treg所致免疫逃逸與食管癌發(fā)生緊密相關(guān)［17］。研究還指出，抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/NF-κB信號(hào)通路激活，維持Th17/Treg免疫平衡可能有助于阻斷腫瘤形成［18］。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，研究組治療后NF-κB p50、p65蛋白含量、Th17/Treg均較對(duì)照組降低（P＜0.05）。提示益氣散結(jié)方有助于改善食管癌患者免疫炎癥反應(yīng)，原因可能為益氣散結(jié)方內(nèi)含有女貞子多糖、黃芪多糖、夏枯草多糖等化學(xué)成分，不僅阻止食管癌微環(huán)境中BMSCs異常改變，提高CTL特異性抗腫瘤功能，改善TNF-α所致NF-κB活化異常，減少或逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤化療耐藥性，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的靈敏度，還可誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞，增加殺傷細(xì)胞數(shù)，多途徑調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，刺激外周血T淋巴細(xì)胞增殖，提高單核巨噬細(xì)胞吞噬能力，增加NK細(xì)胞數(shù)，調(diào)節(jié)免疫內(nèi)環(huán)境。推測(cè)益氣散結(jié)方糾正患者Th17/Treg免疫失衡的機(jī)制可能與抑制NF-κB通路活化相關(guān)。此外，本研究對(duì)不良反應(yīng)、KPS評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，研究組Ⅰ～Ⅱ級(jí)惡心、嘔吐發(fā)生率較對(duì)照組降低，且治療后KPS評(píng)分較對(duì)照組升高（P＜0.05），說(shuō)明益氣散結(jié)方治療氣陰兩虛型食管癌化療患者可明顯降低惡心、嘔吐發(fā)生率，提高生存質(zhì)量，原因可能為益氣散結(jié)方內(nèi)含有半夏、枳殼等成分，能顯著發(fā)揮散結(jié)、止吐等作用，減輕因化療所致惡心嘔吐程度，改善生存質(zhì)量。

綜上，益氣散結(jié)方用于氣陰兩虛型食管癌化療患者治療，有助于調(diào)控NF-κB表達(dá)，糾正Th17/Treg免疫失衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫抵抗力，降低惡心、嘔吐發(fā)生率，提升生存質(zhì)量。但本研究仍存在一定不足，如缺乏NF-κB、Th17/Treg作用機(jī)制研究、樣本量較少，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究NF-κB、Th17/Treg的作用機(jī)制。