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    千金藤素通過PI3K-AKT信號(hào)通路抑制前列腺癌細(xì)胞DU145增殖、侵襲和遷移①

    2022-11-25 08:28:44梁澤旭楊萬山董秀哲延邊大學(xué)附屬醫(yī)院延吉133000
    中國免疫學(xué)雜志 2022年16期
    關(guān)鍵詞:靶點(diǎn)癌癥通路

    梁澤旭 楊萬山 董秀哲(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院,延吉 133000)

    前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全世界男性第二常見癌癥,致死率排名第六,由于我國人口增長和老齡化,PCa發(fā)病率呈逐年上升狀態(tài)[1]。早期PCa多通過手術(shù)治療,而晚期或轉(zhuǎn)移性PCa多采用雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy,ADT)[2]。盡管ADT在最初治療中有較好效果,但大部分患者會(huì)在3年內(nèi)發(fā)展為去勢抵抗型前列腺癌(castrationresistant prostate cancer,CRPC)[3]。而CRPC患者死亡的唯一因素就是轉(zhuǎn)移[4]。因此,抑制PCa生長和轉(zhuǎn)移在臨床治療上至關(guān)重要。千金藤素(cepharanthine,CEP)是一種從千金藤中提取的天然生物堿,因其在抗腫瘤及抗炎方面的藥理作用被廣泛關(guān)注[5]。如PAYON等[6]發(fā)現(xiàn)CEP可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖;而KUDO等[7]發(fā)現(xiàn)CEP可通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。盡管CEP已被證明在多種癌癥中起抗癌作用,但其對(duì)PCa細(xì)胞增殖和侵襲遷移的影響尚不清楚。本研究擬探尋CEP是否通過調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路影響PCa細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

    1 材料與方法

    1.1 材料 CEP購自索萊寶公司;E-cadherin(ab40772)、Vimentin(ab92547)和Snail(ab216347)抗體購自美國Abcam公司;PI3K(SRP0691)、p-PI3K(SAB4301553)、AKT(SAB4500797)、p-AKT(SAB43 01497)、GAPDH(SAB2108668)及 二 抗(A9044、A0545)購自Sigma公司;740Y-P購自Selleck公司;電泳儀、電泳槽、Western blot轉(zhuǎn)膜儀和Gel Doc凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞存活率及藥物濃度檢測 采用CCK-8檢測不同濃度CEP(0、5、10、20μmol/L)對(duì)DU145細(xì)胞存活率的影響,按照試劑盒說明書操作。

    1.2.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將CEP處理后的DU145細(xì)胞接種于有蓋玻片的6孔板,細(xì)胞80%融合時(shí)開始實(shí)驗(yàn),加入一抗(1∶50)、二抗(1∶150)分別孵育2 h,DAPI封片,共聚焦顯微鏡拍照。

    1.2.3 Western blot 細(xì)胞經(jīng)CEP和或740Y-P處理后,收集并裂解,取30μg蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育后曝光成像,以GAPDH為內(nèi)參,抗體稀釋比例為E-cadherin(1∶1 500)、Vimentin(1∶1 500)、

    Snail(1∶2 000)、PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、GAPDH

    (1∶1 000)、二抗(1∶10 000)。

    1.2.4 侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 將CEP處理的細(xì)胞和未處理細(xì)胞分為3組,分別加入帶小室的24孔板,培養(yǎng)24 h后取出小室,甲醛固定,蘇木素染色,封片,顯微鏡下拍照。小室外層鋪基質(zhì)膠后進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn),步驟同上。

    1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同遷移實(shí)驗(yàn),制備密度為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液置于24孔板,待細(xì)胞貼壁后給予CEP處理,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄上清,改用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h,20μl滅菌槍頭做“一”字形劃痕,PBS清洗,無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),0 h、48 h取樣拍照。

    1.2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過PharmMapper平臺(tái)(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)對(duì)CEP的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)式進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,將預(yù)測后的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度CEP對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響 不同濃度CEP(0、5、10、20μmol/L,DMSO稀釋)分別處理DU145細(xì)胞24 h,CCK-8測定生存率,與對(duì)照組相比,CEP≥10μmol/L時(shí),DU145細(xì)胞增殖被抑制(P<0.05),5μmol/L時(shí)對(duì)DU145細(xì)胞存活率無明顯抑制作用(圖1)。

    圖1 不同濃度CEP對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of different concentrations of CEP on cell viability

    2.2 CEP對(duì)DU145細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的影響 Western blot結(jié)果顯示,DU145細(xì)胞經(jīng)10、20μmol/L CEP處理后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)EMT標(biāo)志物Vimentin和Snail蛋白表達(dá)明顯下降,而E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05,圖2A)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果與Western blot結(jié)果一致,Vimentin熒光強(qiáng)度隨著藥物濃度增加而減弱,E-cadherin熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05,圖2B)。

    圖2 CEP對(duì)DU145細(xì)胞EMT的影響Fig.2 Effect of CEPon EMT of DU145 cells

    2.3 CEP對(duì)DU145細(xì)胞侵襲遷移的影響 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測CEP對(duì)DU145細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,藥物處理組細(xì)胞侵襲和遷移能力呈劑量依賴性減弱(P<0.05,圖3A)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與侵襲遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,細(xì)胞橫向遷移指數(shù)呈劑量依賴性下降(P<0.05,圖3B)。

    圖3 CEP對(duì)DU145細(xì)胞侵襲遷移及橫向遷移的影響Fig.3 Effect of CEP on invasion and migration of DU145 cells and wound healing

    2.4 CEP對(duì)DU145細(xì)胞PI3K-AKT信號(hào)通路的影響 PharmMapper平臺(tái)預(yù)測CEP潛在靶點(diǎn)共224個(gè),對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析共得到125個(gè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)CEP不僅可對(duì)PCa產(chǎn)生影響,同時(shí)還有29個(gè)靶點(diǎn)作用于PI3K-AKT信號(hào)通路(表1)。Western blot結(jié)果顯示,10、20μmol/L CEP處理DU145細(xì)胞24 h,胞內(nèi)p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)且二者呈劑量依賴性(圖4A)。采用PBS將740Y-P(PI3K-AKT信號(hào)通路激活劑)稀釋至50μg/ml后聯(lián)合CEP(10μmol/L)處理DU145細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)740Y-P能夠逆轉(zhuǎn)CEP對(duì)EMT相關(guān)蛋白的影響(P<0.05,圖4B)。

    圖4 CEP對(duì)DU145細(xì)胞PI3K-AKT信號(hào)通路的影響Fig.4 Effect of CEP on PI3K-AKT signal pathway in DU145 cells

    表1 CEP的KEGG通路富集分析Tab.1 KEGG pathway enrichment analysis of CEP

    3 討論

    PCa發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居第一,已成為男性健康的主要威脅[8-10]。當(dāng)PCa進(jìn)展為浸潤性和轉(zhuǎn)移性疾病時(shí),患者五年生存率急劇下降[11]。目前,CEP已被證明可抑制多種癌癥進(jìn)展,如UNSON等[12]發(fā)現(xiàn)CEP可通過抑制P53突變抑制結(jié)直腸細(xì)胞生長。TANG等[13]發(fā)現(xiàn)CEP通過抑制自噬抑制非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展。但CEP在PCa中的作用尚未見報(bào)道。本研究表明,CEP(10、20μmol/L)能夠顯著抑制PCa細(xì)胞DU145增殖,且呈劑量依賴性。

    研究表明,EMT在胚胎發(fā)育、傷口愈合、癌癥轉(zhuǎn)移和耐藥性中具有關(guān)鍵作用[14-15]。經(jīng)歷EMT的細(xì)胞從極化上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨瓤梢苿?dòng)的間充質(zhì)表型,該表型可增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲和遷移能力[15]。因此,抑制PCa細(xì)胞EMT進(jìn)程可作為轉(zhuǎn)移性PCa的潛在治療方法。本研究顯示,CEP(10、20μmol/L)處理后,DU145細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白(Vimentin、Snail和E-cadherin)表達(dá)受到影響,同時(shí)細(xì)胞侵襲和遷移能力被明顯抑制,表明CEP不僅可抑制PCa細(xì)胞DU145增殖,同時(shí)可抑制其轉(zhuǎn)移。

    PI3K-AKT信號(hào)通路是癌癥的經(jīng)典通路之一,不僅參與癌細(xì)胞增殖,同時(shí)調(diào)控癌癥干細(xì)胞樣特性及EMT[16]。LI等[17]研究證實(shí),淫羊藿苷Ⅱ通過抑制PI3K-AKT信號(hào)通路降低PCa細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移能力。已有研究證實(shí)CEP通過下調(diào)p-AKT表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖[18]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法證實(shí)在DU145細(xì)胞中,CEP具有調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路的能力,且PI3K-AKT信號(hào)通路激活劑可逆轉(zhuǎn)CEP對(duì)DU145細(xì)胞EMT的影響。

    綜上,CEP可能通過調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路影響PCa細(xì)胞DU145增殖、EMT、侵襲和遷移,為臨床應(yīng)用CEP治療PCa提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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