補(bǔ)中益氣湯含藥血清調(diào)控GSK-3β介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路增強(qiáng)A549細(xì)胞對順鉑敏感性的研究①

王 瑩 付權(quán)澤 牟琪瑞 劉春英 王 淳 高 原（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

肺癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人類健康，肺腺癌是其較常見的類型［1］。順鉑是肺腺癌一線化療藥物，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，可使腫瘤細(xì)胞周期停止，但治療同時可降低機(jī)體免疫功能，并出現(xiàn)多器官毒性損傷［2-3］。順鉑治療肺癌過程中常因耐藥、轉(zhuǎn)移和不良反應(yīng)降低患者生活質(zhì)量，影響治療效果，是臨床治療難題［4-5］。因此，如何增效減毒是當(dāng)前順鉑治療肺癌急需解決的問題。補(bǔ)中益氣湯是中醫(yī)“培土生金法”經(jīng)典方劑，可抑制肺癌生長，與順鉑聯(lián)合能強(qiáng)化臨床療效，且利于降低不良反應(yīng)，提高患者生存質(zhì)量，作用機(jī)制值得深入研究［6-8］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合順鉑抗肺癌作用優(yōu)于單獨用藥，作用機(jī)制與抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)［9-10］。但PI3K/AKT信號通路是一個龐大的信號網(wǎng)絡(luò)，具體通過其下游哪些通路增強(qiáng)順鉑抗肺癌作用尚未明確。

GSK-3β是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶蛋白，也是參與Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵作用因子［11-12］。Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是PI3K/AKT下游最為活躍的細(xì)胞途徑之一，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡中發(fā)揮重要作用［13-14］。研究報道，激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致其下游靶蛋白survivin表達(dá)上調(diào)所引起的細(xì)胞凋亡抑制可能使肺腺癌對順鉑的敏感性降低［15］。

課題組前期實驗雖發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯增強(qiáng)順鉑抗肺癌作用與抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，但是否與其下游GSK-3β介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)尚未見報道。因此，本研究通過補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑干預(yù)A549細(xì)胞，檢測GSK-3β介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵信號分子，進(jìn)一步探討補(bǔ)中益氣湯增強(qiáng)順鉑抗肺癌作用的分子機(jī)制，以期為臨床尋求補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合順鉑治療肺癌的有效靶點及相關(guān)中藥新藥開發(fā)提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量190～230 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2018-0010。A549細(xì)胞株購自中國醫(yī)科院腫瘤研究中心細(xì)胞庫。

1.1.2 主 要 試 劑 GSK-3β、β-catenin、survivin、β-actin一抗、全蛋白提取試劑盒、核蛋白和漿蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光液、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自沈陽萬類生物科技有限公司（批號：WL01456、WL0961a、

WL01684、WL0002、WLA019、WLA004、WLA020、WLA003、WLA001c）；p-GSK-3βser9一抗、RIPA裂解液、羊抗兔IgG-HRP均購自碧云天生物科技有限公司（批號：AG753、P0013B、A0208）；p-GSK-3βtyr216一抗購自英國Abcam生物公司（批號：ab75745）；順鉑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（批號：MB1055）；全部藥材均購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，并通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實驗室鑒定。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 根據(jù)新世紀(jì)版《方劑學(xué)》規(guī)定用藥量并結(jié)合臨床常用劑量，補(bǔ)中益氣湯組方及劑量為黃芪18 g、甘草9 g、人參6 g、當(dāng)歸3 g、橘皮6 g、升麻6 g、柴胡6 g、白術(shù)9 g，按“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算小鼠等效劑量，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果篩選最佳中藥濃度，最終選取成人推薦日用量作為本次實驗中藥干預(yù)濃度（生藥2.91 g/kg），過濾、水浴蒸發(fā)至含生藥終濃度為每毫升含生藥1 g，冷卻，4℃保存?zhèn)溆?。SD大鼠每天灌胃給藥（1.314 g/ml，2 ml）1次，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后，腹主動脈采血置于無菌管，37℃水浴靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，重復(fù)離心2次，56℃水浴滅活30 min，0.22μm濾器濾過除菌，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶1 ml消化2～5 min（肉眼觀察瓶壁半透明細(xì)胞層出現(xiàn)細(xì)針孔空隙，或倒置顯微鏡下細(xì)胞變鈍圓，細(xì)胞間隙增大），即可終止消化，加入含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液5 ml，無菌吸管輕輕吹打使之均勻懸浮，分裝入2個培養(yǎng)瓶，傳代繼續(xù)培養(yǎng)，隨機(jī)分為4組：a組（對照血清組，10%正常血清處理）、b組（順鉑組，20μg/ml順鉑與10%正常血清共同處理）、c組（補(bǔ)中益氣湯組，10%補(bǔ)中益氣湯含藥血清處理）、d組（補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑組，20μg/ml順鉑與10%補(bǔ)中益氣湯含藥血清共同處理），每組作用48 h后收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞309 g離心5 min，收集，吸除上清，PBS洗滌2次，309 g離心5 min，收集細(xì)胞，吸除上清，殘留約50μl PBS，每管細(xì)胞樣品加入500μl Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITC混勻，加入5μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 細(xì)胞核漿蛋白分離 各組細(xì)胞胰酶消化，收集于1.5 ml離心管，1 000 g離心5 min，棄上清，加入CERⅠ（CERⅠ∶PMSF=100∶1），將預(yù)冷的CERⅡ加入1.5 ml離心管，4℃、16 000 g離心5 min，上清即為胞漿蛋白提取物。向裝有不能溶解沉淀物（含細(xì)胞核蛋白）的原離心管加入預(yù)冷NER，4℃、16 000 g離心10 min，上清即為細(xì)胞核蛋白提取物。整個細(xì)胞核漿分離過程均在冰上操作。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，以RIPA緩沖液（1×PBS、1%NP40、0.1%SDS、0.1 mmol/L PMSF）于冰上裂解30 min，BCA試劑盒測定蛋白濃度，常規(guī)制備蛋白電泳樣品，SDS-PAGE凝膠電泳，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β、β-catenin、survivin，稀釋濃度均為1∶500）4℃孵育過夜，二抗（羊抗兔IgG-HRP，稀釋濃度1∶5 000）室溫孵育2 h，暗室發(fā)光，圖像掃描并分析結(jié)果。以所測蛋白條帶與內(nèi)參條帶光密度比值表示蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析，方差齊性時，兩兩比較采用SNK檢驗；不符合參數(shù)檢驗者，采用多組劑量資料秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞凋亡的影響 與對照血清相比，單獨順鉑、補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑均能顯著提高A549/順鉑細(xì)胞晚期凋亡率（P＜0.05），單獨補(bǔ)中益氣湯含藥血清并未顯著提高晚期凋亡率（P＞0.05）。與單獨順鉑相比，補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑提高晚期凋亡率效果更為顯著（P＜0.05，圖1、表1）。

表1 補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞凋亡率的影響（±s）Tab.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells（±s）

表1 補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞凋亡率的影響（±s）Tab.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells（±s）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d Late apoptosis rate（%）4.57±0.13 18.29±1.421）6.54±0.752）29.59±1.241）2）

圖1 補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞凋亡率的影響Fig.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells

2.2 補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞GSK-3β在細(xì)胞漿、細(xì)胞核中活性表達(dá)的影響 順鉑可顯著下調(diào)胞漿p-GSK-3βser9表達(dá)（P＜0.05），而補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑可進(jìn)一步下調(diào)胞漿p-GSK-3βser9表達(dá)（P＜0.05），但補(bǔ)中益氣湯含藥血清對胞漿p-GSK-3βser9表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）；順鉑、補(bǔ)中益氣湯含藥血清、補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞胞漿GSK-3β、p-GSK-3βtyr216表達(dá)均無顯著影響（P＞0.05，表2、圖2A）。順鉑可顯著下調(diào)胞核p-GSK-3βser9表達(dá)（P＜0.05），而補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑可進(jìn)一步下調(diào)胞核p-GSK-3βser9表達(dá)（P＜0.05），但補(bǔ)中益氣湯含藥血清對胞核p-GSK-3βser9表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）；順鉑、補(bǔ)中益氣湯含藥血清、補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞的細(xì)胞核GSK-3β、p-GSK-3βtyr216表達(dá)均無顯著影響（P＞0.05，表3、圖2B）。

表2 A549細(xì) 胞 漿p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm of A549 cells（±s，n=3）

表2 A549細(xì) 胞 漿p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm of A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d p-GSK-3βser9 1.00 0.38±0.091）0.88±0.072）0.20±0.051）2）p-GSK-3βtyr216 1.00 0.92±0.01 0.87±0.05 0.85±0.06 GSK-3β 1.00 0.98±0.04 0.99±0.01 1.10±0.07

圖2 A549細(xì) 胞 漿、細(xì) 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm and nucleus of A549 cells

表3 A549細(xì) 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.3 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in nucleusof A549 cells（±s，n=3）

表3 A549細(xì) 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.3 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in nucleusof A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d p-GSK-3βser9 1.00 0.56±0.091）0.88±0.072）0.40±0.051）2）p-GSK-3βtyr216 1.00 0.99±0.04 1.07±0.02 0.92±0.03 GSK-3β 1.00 0.98±0.06 1.01±0.03 0.94±0.02

2.3 補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，順鉑可顯著下調(diào)A549細(xì)胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)（P＜0.05），補(bǔ)中益氣湯含藥血清未使A549細(xì)胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化（P＞0.05）；而補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑可使A549細(xì) 胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），同時也較順鉑單獨處理的β-catenin、survivin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05，表4、圖3）。

表4 A549細(xì)胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.4 Expressions ofβ-catenin and survivin protein in A549 cells（±s，n=3）

表4 A549細(xì)胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.4 Expressions ofβ-catenin and survivin protein in A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d β-catenin 1.00 0.76±0.051）1.07±0.062）0.42±0.031）2）survivin 1.00 0.47±0.131）1.18±0.052）0.25±0.101）2）

圖3 A549細(xì)胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions ofβ-catenin and survivin proteins in A549 cells

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為癌癥是正氣虛弱、邪氣過盛所致，加之化療藥物的毒副反應(yīng)，使患者正氣更加虛弱，無力對抗邪氣。根據(jù)五行規(guī)律，土屬脾，金屬肺，脾為肺之母，脾散精以充肺，即“培土生金”。脾轉(zhuǎn)輸津液，散精于肺，不僅是肺通調(diào)水道的前提，也為肺生理活動提供營養(yǎng)。肺脾二臟在病理上相互影響，脾氣虛損時，常導(dǎo)致肺氣不足，邪氣入侵，引發(fā)肺病。因此，中醫(yī)治療肺癌常用“培土生金”法，通過補(bǔ)益正氣，抵抗邪氣，從而抵御腫瘤。如李東垣所創(chuàng)的補(bǔ)中益氣湯作為“培土生金”法的經(jīng)典方劑，臨床常用于晚期肺癌治療，能提高機(jī)體免疫功能，增加化療藥物敏感性，改善患者生存狀況［7-8］。但中醫(yī)治療肺癌的研究中，尚未見“培土生金”法通過調(diào)控GSK-3β介導(dǎo)的Wnt/β-catenin途徑增強(qiáng)肺癌對順鉑敏感性的報道。

目前認(rèn)為GSK-3β是PI3K/AKT信號通路的效應(yīng)靶蛋白，p-AKT可引起GSK-3βser9磷酸化［16-17］。GSK-3β是一種普遍存在在于細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是公認(rèn)的Wnt/β-catenin信號通路信號分子［18-19］。GSK-3β活性受兩個磷酸化位點的控制，GSK-3βser9磷酸化可抑制GSK-3β活性，GSK-3βtyr216磷酸化提高GSK-3β活性［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可下調(diào)A549細(xì)胞胞漿p-GSK-3βser9表達(dá)，補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑可進(jìn)一步下調(diào)p-GSK-3βser9表達(dá)，從而增加胞漿中GSK-3β表達(dá)，增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

正常情況下Wnt/β-catenin信號通路未被激活，細(xì)胞漿中β-catenin會被GSK-3β磷酸化，進(jìn)而啟動泛素化被降解，維持細(xì)胞漿中較低水平的β-catenin［22］。而病理情況下，p-GSK-3βser9表達(dá)升高，抑制GSK-3β活性，從而使β-catenin在腫瘤細(xì)胞內(nèi)積蓄［23-24］。當(dāng)細(xì)胞漿中β-catenin大量積蓄，β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而啟動下游靶基因，如survivin等［25］。本研究顯示，順鉑可下調(diào)A549細(xì)胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)，補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑可進(jìn)一步下調(diào)A549細(xì)胞β-catenin、survivin蛋白表達(dá)，說明補(bǔ)中益氣湯有助于順鉑抑制Wnt/β-catenin信號通路激活。

survivin是Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白之一，同時是一種抗凋亡蛋白，生理情況下，細(xì)胞內(nèi)較低水平s urvivin會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［26-27］。但當(dāng)大量β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積蓄并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核激活s urvivin蛋白時，使細(xì)胞凋亡受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致藥效降低［28］。本研究證實單獨順鉑和補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑均能顯著提高肺腺癌細(xì)胞晚期凋亡率，且后者促進(jìn)凋亡效果優(yōu)于前者，說明補(bǔ)中益氣湯可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。

綜上，補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑可抑制p-GSK-3βser9表達(dá)，從而增強(qiáng)GSK-3β活性，進(jìn)一步影響Wnt/β-catenin信號通路，下調(diào)β-catenin、survivin蛋白表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)順鉑敏感性。本研究深入揭示了補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合順鉑抗肺癌作用優(yōu)于單獨用藥的分子機(jī)制，為臨床尋求補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合順鉑治療肺癌的有效靶點及相關(guān)中藥新藥開發(fā)提供新的依據(jù)，有助于臨床制定合理的肺癌治療方案，提高患者生存率和改善患者生存狀態(tài)。此外，研究結(jié)果部分揭示了中醫(yī)“培土生金”的本質(zhì)，并為臨床拓展中藥協(xié)同順鉑治療肺癌的病機(jī)與治法理論提供新的思路。