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    凱里酸湯對(duì)代謝性脂肪肝的改善作用及其機(jī)制探討①

    2022-11-25 08:28:42李正超朱紫馨劉詠梅胡亞欣程義局程明亮貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院貴陽550003
    中國免疫學(xué)雜志 2022年16期
    關(guān)鍵詞:凱里高脂菌群

    叢 碩 李正超 朱紫馨 劉詠梅 胡亞欣 程義局 程明亮 (貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,貴陽 550003)

    隨著國家經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,人們的生活環(huán)境、飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的改變,隨之引發(fā)的慢性代謝性疾病的發(fā)病率逐年增加,其中肥胖、代謝性脂肪性肝?。╩etabolic-dysfunction-associated fatty liver disease,MAFLD)和糖尿病等疾病躍居前列[1]。MAFLD是指發(fā)病機(jī)制排除酒精和其他誘發(fā)繼發(fā)性肝脂肪變性因素外,以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征[2],臨床以肝組織病理學(xué)活檢、影像學(xué)及血液生物標(biāo)志物為證據(jù),同時(shí)結(jié)合以下三項(xiàng)體征之一:超重/肥胖、Ⅱ型糖尿病、代謝功能障礙作為診斷MAFLD新標(biāo)準(zhǔn)[3]。MAFLD是多種因素共同參與的結(jié)果,其發(fā)病機(jī)制除了遺傳因素外,還與飲食、胰島素抵抗、脂質(zhì)過氧化、膽汁酸代謝和腸道菌群等因素密切相關(guān)。目前多采用保肝、改變飲食結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)等方法來達(dá)到緩解或改善疾病的目的。

    凱里酸湯作為貴州省非物質(zhì)文化遺產(chǎn),其由西紅柿、辣椒、大米和生姜等多種天然農(nóng)作物經(jīng)傳統(tǒng)工藝兩次自然發(fā)酵而成,富含番茄紅素、辣椒堿、維生素C/E、鈣、磷等多種有效成分[4]。番茄紅素能抑制肝臟脂肪變性、修復(fù)肝損傷及改善肝功能[5]。辣椒堿同樣可減輕肝臟脂肪變性,防止肝損傷[6]。本課題組前期對(duì)貴州省凱里市開展的MAFLD流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,當(dāng)?shù)厝巳褐校琈AFLD的發(fā)病率為18.19%,而食用凱里酸湯人群中,MAFLD的發(fā)病率為12.60%,明顯低于全國平均水平29%[7],且長期食用酸湯的人群發(fā)病率也低于該地區(qū)平均水平。因此,本研究擬利用高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠模型為研究對(duì)象,通過調(diào)節(jié)飲食-腸道菌群-膽汁酸代謝來探討凱里酸湯對(duì)MAFLD的改善作用及其可能機(jī)制,為凱里酸湯防治MAFLD提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 34只SPF級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±10)g,周齡6周,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào):SCXK(遼)2015-0001,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.1.2 主要試劑 凱里酸湯由貴州亮歡寨餐飲娛樂管理有限公司提供;蛋白提取試劑盒購自Solarbio公司;BCA定量試劑盒購自碧云天公司;免疫組化和DAB顯色試劑盒購自Bioss公司;HE和油紅O試劑盒購自南京雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司;一抗:抗β-actin抗體購自Bioss公司;抗IL-6抗體、抗TNF-α抗體均購自Abcam公司;抗TLR-4抗體購自Proteintech公司;抗NF-κBp65抗體購自CST公司;二抗:辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體、羊抗鼠抗體均購自普美生物公司。

    1.1.3 主要儀器 雙垂直電泳儀購自北京六一公司;全波長酶標(biāo)儀購買Bio-Rad公司;高速離心機(jī)購自BECKMANAllegra X-30R Centrifuge公司;旋渦振蕩器購自杭州米歐公司;光學(xué)顯微鏡購自耐博公司;Cobas 702全自動(dòng)生化分析儀購自羅氏Cobas公司。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、MAFLD模型構(gòu)建及酸湯干預(yù)所有SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為4組,正常對(duì)照組(ND,n=8)、正常飲食+酸湯組(NS,n=8)、模型對(duì)照組(HF,n=10)和高脂飲食+酸湯組(HS,n=8)。ND組和NS組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),HF組和HS組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)以誘導(dǎo)MAFLD模型。飼料喂養(yǎng)時(shí)NS組和HS組大鼠給予酸湯灌胃干預(yù),ND組和HF組大鼠給予等體積雙蒸水灌胃。飼喂12周后,隨機(jī)從HF組中取2只大鼠處死,收取血和肝組織樣本,通過生化和病理組織學(xué)檢查確認(rèn)造模是否成功。

    1.2.2 標(biāo)本收集 各組大鼠自由飲水?dāng)z食12周后,水合氯醛麻醉后心臟取血,稱量各組大鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量,計(jì)算肝指數(shù);收集血和肝組織用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

    1.2.3 生化指標(biāo)活性/含量檢測(cè) 將全血置于低速離心機(jī)4 000 r/min離心5 min,取上清,檢測(cè)各組大鼠生化指標(biāo)活性及含量。

    1.2.4 HE和油紅O染色觀察肝組織病理學(xué)改變及脂肪變性程度 采用4%多聚甲醛固定肝組織,脫水浸蠟,石蠟包埋,制成3μm厚的石蠟切片,脫蠟透明后行HE和油紅O染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及脂肪小滴多少與大小。

    1.2.5 免疫組織化學(xué)(IHC)染色檢測(cè)肝組織中TNF-α的變化 石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,高壓抗原修復(fù),3%H2O2滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶20 min,正常山羊血清工作液封閉30 min,孵育一抗4℃過夜,室溫復(fù)溫30 min,室溫孵育二抗30 min,DAB顯色,顯微鏡觀察,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,自來水返藍(lán),脫水、透明、封片,光學(xué)顯微鏡下觀察TNF-α的變化情況。

    1.2.6 糞便16SrRNA測(cè)序檢測(cè)大鼠腸道菌群變化 實(shí)驗(yàn)干預(yù)12周后,大鼠處死前,固定大鼠,無菌去酶EP管直接接取大鼠自然排出的糞便,采用Misep技術(shù)對(duì)大鼠糞便進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA測(cè)序,在OTU水平上,對(duì)各組大鼠腸道菌群的多樣性及豐度進(jìn)行α分析。各組大鼠腸道菌群多樣性及豐度用Observed species指數(shù)表示。

    1.2.7 Western blot檢測(cè)肝組織中IL-6、TNF-α、TLR-4和NF-κBp65等蛋白表達(dá) 稱取0.020 g肝組織加入蛋白裂解液充分研磨裂解,4℃離心20 min取上清,應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度,配制蛋白樣本。配制SDS-PAGE凝膠,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入一抗:IL-6、TNF-α、TLR-4和NF-κB p65,4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜,孵育相應(yīng)二抗,TBST洗膜,ECL顯影曝光,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描,Image J 1.6軟件分析各條帶的灰度值,以β-actin為內(nèi)參,目的蛋白與β-actin的比值用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(n)或百分比(%)表示,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 凱里酸湯對(duì)各組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)的影響 與ND組相比,HF組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)及Lee's指數(shù)均明顯升高(P<0.05),提示模型構(gòu)建成功;與HF組相比,HS組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。各組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1。

    表1 大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)變化(±s,n=6)Tab.1 Changes in body weight,liver weight,liver index and Lee's index of rats(±s,n=6)

    表1 大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)和Lee's指數(shù)變化(±s,n=6)Tab.1 Changes in body weight,liver weight,liver index and Lee's index of rats(±s,n=6)

    Note:1)P<0.05 vs NDgroup;2)P<0.05 vs HFgroup.

    Parameters Initial body weight/g Final body weight/g Liver weight/g Liver index/%Lee's index ND 235.83±10.67 428.33±27.81 11.19±1.01 2.59±0.18 2.94±0.04 NS 236.83±7.17 413.83±12.73 10.40±0.69 2.46±0.19 2.96±0.05 HF 237.17±6.59 503.83±36.441)14.33±1.741)2.85±0.161)3.06±0.061)HS 233.33±5.13 453.00±24.452)12.39±0.872)2.60±0.152)2.96±0.062)

    2.2 凱里酸湯對(duì)各組大鼠血清中AST和ALT活性及TG、TC、HDL-C、LDL-C和TBA含量的影響 與ND組比較,HF組大鼠血清中AST和ALT活性及TG、TC、LDL-C和TBA含量顯著升高(P<0.05),而血清中HDL-C含量顯著降低(P<0.05);與HF組比較,HS組大鼠血清中AST和ALT活性及TG、TC、LDL-C和TBA含量均顯著降低(P<0.05),而血清中HDL-C含量均顯著升高(P<0.05)。各組大鼠血清中AST和ALT活性及TG、TC、HDL-C、LDL-C和TBA含量測(cè)定結(jié)果見表2。

    表2 各組大鼠血清中ALT和AST活性及TC、TG、LDL-C、HDL-C和TBA含量測(cè)定結(jié)果(±s,n=6)Tab.2 Serum ALT,AST activity,TC,TG,LDL-C,HDL-C and TBA concentrations of rats in each group(±s,n=6)

    表2 各組大鼠血清中ALT和AST活性及TC、TG、LDL-C、HDL-C和TBA含量測(cè)定結(jié)果(±s,n=6)Tab.2 Serum ALT,AST activity,TC,TG,LDL-C,HDL-C and TBA concentrations of rats in each group(±s,n=6)

    Note:1)P<0.05 vs NDgroup;2)P<0.05 vs HFgroup.

    Parameters ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)TC/(mmol·L-1)TG/mmol·L-1 HDL-C/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)TBA/(μmol·L-1)ND 55.17±10.87 160.28±13.78 1.56±0.41 0.44±0.17 0.44±0.06 0.14±0.05 7.53±1.12 NS 61.43±14.31 185.02±24.28 1.96±0.24 0.35±0.10 0.42±0.05 0.15±0.07 12.86±2.89 HF 125.65±35.361)391.57±161.581)2.26±0.191)1.34±0.171)0.35±0.031)0.29±0.021)29.28±8.221)HS 77.37±22.462)202.33±78.672)1.70±0.152)1.10±0.132)0.39±0.022)0.22±0.052)20.30±3.662)

    2.3 凱里酸湯對(duì)各組大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 ND組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,周圍細(xì)胞索呈放射狀排列,無脂肪變性細(xì)胞;HF組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變,肝小葉界限不清晰,出現(xiàn)大量球形脂滴;與HF比較,HS組大鼠肝組織病理形態(tài)得到明顯改善,球形脂滴減少或變小。各組大鼠肝組織病理改變結(jié)果見圖1。

    圖1 各組大鼠肝臟病理學(xué)改變Fig.1 Pathological changes of liver in each group rats

    2.4 凱里酸湯對(duì)各組大鼠腸道菌群的影響 HF組菌群多樣性明顯降低,與ND組和HS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而NS組和HS組的菌群雖低于ND組,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HS組與HF組菌群結(jié)構(gòu)上相近,但與ND組距離較遠(yuǎn),NS組與ND組距離較近。且HF組與ND組和NS組、HS組的菌群結(jié)構(gòu)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。各組大鼠糞便腸道菌群α多樣性、PC分析和β多樣性分析結(jié)果見圖2。

    圖2 各組大鼠糞便腸道菌群分析Fig.2 Analysis of intestinal microflora in faeces of rats in each group

    2.5 凱里酸湯對(duì)各鼠肝組織中IL-6和TNF-α含量的影響 與ND組比較,HF組大鼠肝組織中IL-6及TNF-α含量均顯著升高(P<0.01);與HF組比較,HS組大鼠肝組織中IL-6及TNF-α含量均顯著降低(P<0.01)。各組小鼠肝組織中IL-6及TNF-α含量測(cè)定結(jié)果見圖3和圖4。

    圖3 各組大鼠肝組織中IL-6和TNF-α相對(duì)表達(dá)Fig.3 Content determination results of IL-6 and TNF-α in liver tissue of mice in each group

    圖4 各組大鼠肝組織中TNF-α表達(dá)Fig.4 Expression of TNF-αin liver tissue of rats in each group

    2.6 凱里酸湯對(duì)各鼠肝組織中TLR-4和NF-κB p65含量的影響 與ND組比較,HF組大鼠肝組織中TLR-4和p-NF-κB p65含量均顯著升高(P<0.05);與HF組比較,HS組大鼠肝組織中TLR-4和p-NF-κB p65含量均顯著降低(P<0.05)。各組大鼠肝組織中TLR-4和p-NF-κBp65含量測(cè)定結(jié)果見圖5。

    圖5 各組大鼠肝組織中TLR-4和p-NF-κB p65相對(duì)表達(dá)Fig.5 Content determination results of TLR-4和p-NFκB p65 in liver tissue of rats in each group

    3 討論

    肝臟作為脂肪代謝的主要靶器官,長期高脂飲食會(huì)增加肝臟對(duì)脂肪的攝取,當(dāng)脂肪攝取量大于排出量時(shí),會(huì)導(dǎo)致肝脂肪變性[8]。運(yùn)用高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠動(dòng)物模型,具備胰島素抵抗、肥胖等特征,較好地模擬了人類MAFLD的發(fā)生、發(fā)展過程[9]。本研究運(yùn)用高脂飲食飼養(yǎng)SD大鼠12周,構(gòu)建MAFLD大鼠模型,研究結(jié)果顯示,與ND組相比,HF組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)及Lee's指數(shù)均明顯升高,肝組織出現(xiàn)病理性改變及大量的球形脂滴,提示建模成功,與國內(nèi)外研究結(jié)果一致[10]。而HS組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)及Lee's指數(shù)均顯著下降,肝組織病理形態(tài)及脂肪變性得到改善,提示凱里酸湯具有改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝臟病變的作用。本研究還發(fā)現(xiàn),凱里酸湯可顯著降低HF組大鼠血清中AST、ALT活性、TG、TC及LDL-C含量,升高HDL-C含量,進(jìn)一步證明了凱里酸湯能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織病變。

    高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD機(jī)制復(fù)雜,有眾多因素參與,腸道菌群紊亂及腸道屏障功能障礙是其關(guān)鍵因素。研究表明,腸道菌群紊亂可引起膽汁酸代謝紊亂,腸壁通透性增加,致使活性氧系、細(xì)菌內(nèi)毒素和乙醇及其毒性代謝產(chǎn)物大量進(jìn)入肝臟,最終導(dǎo)致肝損害加劇[11]。膽汁酸是膽固醇的終末降解產(chǎn)物,在脂肪代謝中起重要作用,研究表明,膽汁酸可通過直接或間接激活法尼醇X受體和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用,與肥胖、糖尿病和MAFLD等代謝性疾病有著密切關(guān)系[12]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)凱里酸湯干預(yù)后,與ND組相比,HF組大鼠腸道菌群及菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著改變,糞便腸道菌群的豐度和多樣性均顯著降低,厚壁菌門(Firmicutes)比例明顯升高,擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌比例降低,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[13]。有研究發(fā)現(xiàn),厚壁菌門可產(chǎn)生更多的脂多糖和脫氧膽酸,通過肝門靜脈進(jìn)入肝臟,導(dǎo)致肝臟炎癥[14-15]。擬桿菌參與不可消化多糖的發(fā)酵,以產(chǎn)生短鏈脂肪酸,能夠直接激活G蛋白偶聯(lián)受體,抑制組蛋白去乙?;?,并作為能量底物,從而調(diào)節(jié)各種生理過程,有助于身體健康[15-17]。而放線菌負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗炎特性的短鏈脂肪酸[18]。腸道菌群的這些改變也正是影響MAFLD發(fā)生、發(fā)展的重要因素。而經(jīng)過酸湯干預(yù)后的HS組的菌群結(jié)構(gòu)得到了改善,厚壁菌門比例降低,擬桿菌門和放線菌比例升高。同時(shí),與ND組相比,HF組大鼠血清中TBA含量明顯升高,而凱里酸湯可顯著降低HS組大鼠血清中TBA含量,其機(jī)制可能與凱里酸湯干預(yù)后腸道菌群的改變進(jìn)而影響膽汁酸代謝相關(guān)[19]。

    MAFLD患者常伴有肥胖和胰島素抵抗(insulin resistance,IR)兩大特點(diǎn),而因肥胖導(dǎo)致的腸道菌群失衡和腸壁通透性增加是機(jī)體內(nèi)毒素血癥發(fā)生的重要因素,腸道內(nèi)毒素通過門靜脈進(jìn)入肝臟,促進(jìn)肝臟炎癥反應(yīng)[20],而肝臟炎癥反應(yīng)使肝細(xì)胞分泌膽汁酸異常,進(jìn)一步加重腸道菌群失衡,提示腸道和肝臟通過“腸-肝軸”,相互作用,相互影響[21]。肝臟炎癥反應(yīng)參與MAFLD發(fā)生發(fā)展且貫穿MAFLD整個(gè)過程,其機(jī)制與“二次打擊學(xué)說”關(guān)聯(lián)緊密[22]?!岸未驌魧W(xué)說”中一次打擊核心是IR,二次打擊是在IR基礎(chǔ)上導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng),促使TNF-α及IL-6等炎癥細(xì)胞因子大量釋放,引發(fā)肝細(xì)胞脂肪變性、凋亡、壞死及炎癥,最終導(dǎo)致MAFLD的發(fā)生[23]。研究發(fā)現(xiàn),五味子提取物對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織炎癥損傷和肝細(xì)胞變性有較好的改善作用,其機(jī)制與抑制TNF-α及IL-6等炎癥因子的表達(dá)有關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn),HF組大鼠肝組織中IL-6和TNF-α含量明顯升高,而HS組大鼠肝組織中IL-6和TNF-α含量顯著降低,提示凱里酸湯可有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織的炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能與抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子有關(guān),但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

    腸道菌群失衡可誘發(fā)IR,在肝脂肪變性過程及肝臟炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用,是誘發(fā)MAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[25]。脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,該物質(zhì)可通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)等介導(dǎo)的信號(hào)通路激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)[如:TNF-α、IL-6和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)等]的基因表達(dá)上調(diào),是誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)及激活炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵因子[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn),HF組大鼠肝組織中TLR-4和NF-κB含量明顯升高,而HS組大鼠肝組織中TLR-4和NF-κB含量顯著降低,提示凱里酸湯可通過抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活,進(jìn)而抑制肝組織炎癥反應(yīng),改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織病變。

    綜上所述,凱里酸湯能夠明顯改善高脂飲食誘導(dǎo)的MAFLD大鼠肝組織病變,其機(jī)制可能與凱里酸湯改善腸道微生態(tài)環(huán)境,進(jìn)而改善膽汁酸代謝有關(guān)。凱里酸湯作為一類多種物質(zhì)經(jīng)過發(fā)酵而形成的混合物,其中富含的番茄紅素、辣椒堿、維生素C/E、鈣、磷等多種有效成分已經(jīng)得到了驗(yàn)證,但是課題組本次的研究并未對(duì)其主要成分進(jìn)行提取和驗(yàn)證,其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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