膀胱感染性結(jié)石大鼠的模型構(gòu)建

倪永梁，劉娟娟，趙孝曉，葉丹丹，劉 霞，李麗華，張 恒，蔣德啟

(山東省立第三醫(yī)院泌尿外科，山東省結(jié)石病防治中心，山東濟(jì)南 250031)

感染性結(jié)石是泌尿系結(jié)石中的“惡性結(jié)石”，感染性結(jié)石具有復(fù)發(fā)率高、復(fù)發(fā)時間短、生長速度快、對腎臟功能損害大等特點。感染性結(jié)石與尿液中的解脲酶細(xì)菌有直接關(guān)系，解脲酶細(xì)菌通過分解尿液中尿素、細(xì)菌生物膜以及細(xì)菌自身的粘附功能促進(jìn)了感染性結(jié)石的形成，遺憾的是目前泌尿系結(jié)石基礎(chǔ)研究方面缺乏公認(rèn)的動物模型，尤其是感染性結(jié)石動物模型，很大程度上阻礙了泌尿系結(jié)石基礎(chǔ)研究的發(fā)展，因此探索合適的泌尿系結(jié)石動物模型仍然是急需解決的重要問題。我們在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬是人輸尿管支架管結(jié)殼中差異性表達(dá)的主要菌屬，而脆弱擬桿菌為該菌屬中最常見的細(xì)菌[1],基于此本研究選擇用脆弱擬桿菌進(jìn)行灌注，并嘗試建立無創(chuàng)的膀胱感染性結(jié)石動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本實驗選取健康雌性SD大鼠34只，6～8周齡，體重224～272 g，購買于山東省濟(jì)南市朋悅實驗動物繁育有限公司，飼養(yǎng)在山東大學(xué)實驗動物中心，所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)在25 ℃的恒溫室內(nèi)，12 h白天，12 h黑夜，給予正常飲食。每個鼠籠3～4只大鼠。所有動物實驗按照美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護(hù)理和使用指南(NIH出版物編號8023，1978年修訂)進(jìn)行，并獲得山東省立第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 異物制作及放置過程膀胱內(nèi)異物管為聚乙烯管(型號PE-50)，購于上海紅葉塑料制品有限公司。尿道內(nèi)引導(dǎo)棒選擇硬膜外麻醉導(dǎo)管內(nèi)的金屬導(dǎo)芯，直徑0.4 mm，購于河南馱人醫(yī)療器械有限公司，異物制作過程如圖1所示，另外截取長度約5 cm的PE-50管作為推管使用。實驗前30 min對操作間進(jìn)行紫外線照射殺菌，麻醉前禁食6 h，所有大鼠稱重，采用抽簽的方式隨機(jī)排序確定編號，鼠尾標(biāo)記編號，將體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛按照0.3 mL/100 g腹腔注射，麻醉滿意后，操作臺鋪設(shè)棉墊，將大鼠置于臺面，仰臥位，充分暴露會陰部，四肢固定于操作臺四角，酒精噴霧消毒，手消毒，穿隔離衣，佩戴口罩及無菌手套，碘伏液消毒會陰部，無菌紗布覆蓋會陰部周邊，非無菌操作器械均提前置于體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精內(nèi)浸泡24 h殺菌，置管過程如圖2所示。觸摸恥骨上膀胱區(qū)隱約可觸及質(zhì)硬異物證實膀胱內(nèi)螺旋管置入成功。

A:將PE-50管緊密纏繞在5 mL注射器針頭上;B:100 ℃熱水澆灌在PE-50管上，加熱時間約15 s;C:繃緊PE-50管約1 min;D:連續(xù)制作多段螺旋管；E:裁剪螺旋管，每個螺旋管長約15 mm;F:螺旋管放入酒精溶液塑料管備用。

A:將螺旋管套入金屬導(dǎo)絲;B:螺旋管已完全套入金屬導(dǎo)絲外;C:將推管從金屬導(dǎo)絲末端套入，推管靠近螺旋管;D:碘伏棉球消毒大鼠會陰部;E:金屬導(dǎo)絲與腹部呈60°角進(jìn)入尿道前部；F:金屬導(dǎo)絲經(jīng)尿道推入大鼠膀胱內(nèi);G:緩慢拔出金屬導(dǎo)絲，繼續(xù)向內(nèi)推入推管，黑色箭頭所指為金屬導(dǎo)絲，紅色箭頭所指為推管;H:拔出推管，置管過程結(jié)束。

1.3 實驗分組雌性SD大鼠34只分為3組。模型組：大鼠14只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在麻醉狀態(tài)下通過金屬導(dǎo)絲、推桿將加熱塑形的螺旋狀異物(聚乙烯材料)置入大鼠膀胱內(nèi)，其后給予膀胱灌注脆弱擬桿菌液1×106個/mL約1.5 mL，菌液灌注，隔天1次，灌注3周(圖3A)。脆弱擬桿菌菌種購買自美國典型菌種保藏中心，產(chǎn)品名稱脆弱擬桿菌(ATCC?25285TM)(菌株型號: VPI 2553)，由濟(jì)南雅博生物技術(shù)有限公司儲存和制備。無菌水對照組：大鼠10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用模型組相同方法放置膀胱異物，其后給予灌注無菌注射用水約1.5 mL，灌注方案同模型組?？瞻讓φ战M：大鼠10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照模型組相同方法放置膀胱異物，不進(jìn)行灌注，正常飼養(yǎng)3周。

1.4 尿斑實驗選取模型組大鼠進(jìn)行尿斑實驗，另選取10只健康成年SD雌鼠作為健康對照組進(jìn)行實驗結(jié)果的對比分析。在檢測之前，正常飲水進(jìn)食，檢測當(dāng)天13時放置于標(biāo)準(zhǔn)代謝籠中，在放入或取回大鼠的過程中，動作輕柔，避免大鼠引起排尿反射，代謝籠下面鋪有濾紙，長40 cm，寬27 cm，禁飲水4 h，以防止水污染尿斑或者引起尿斑擴(kuò)散。檢測之后，大鼠放回飼養(yǎng)籠中，收集印有尿斑(美國Whatman公司)的濾紙。晾干后，濾紙放置于紫外線燈下觀察并進(jìn)行拍照。尿斑實驗分析如文獻(xiàn)所述[2-3]。

1.5 標(biāo)本獲取及成分分析實驗結(jié)束后，頸部脫臼處死大鼠，切開膀胱組織，觀察膀胱內(nèi)異物形態(tài)及有無結(jié)石，將異物或結(jié)石放入5 mL凍存管內(nèi)室溫下保存，采用智能結(jié)石分析儀(型號SUN-3G，濟(jì)南鼎舜醫(yī)療器械有限公司)，采用傅里葉變換紅外光譜法進(jìn)行結(jié)石成分分析。切除的膀胱三角區(qū)上皮組織，部分放入體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液內(nèi)4 ℃保存，部分置于凍存管內(nèi)-80 ℃保存。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠膀胱結(jié)石情況模型組在實驗結(jié)束后存活12(12/14，85.7%)只，模型組在實驗結(jié)束后12(100.0%)例存活大鼠均可見膀胱結(jié)石(圖3)；無菌水對照組無大鼠死亡，實驗結(jié)束后有3(30.0%)只大鼠存在膀胱結(jié)石；空白對照組無大鼠死亡，實驗結(jié)束后有2只大鼠存在膀胱結(jié)石，結(jié)石率20%。模型組的結(jié)石率與兩個對照組之間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A:大鼠膀胱灌注后留置導(dǎo)管，保證灌注菌液在膀胱內(nèi)存留；B～D：模型組大鼠所形成的膀胱結(jié)石大體觀。

2.2 膀胱結(jié)石成分模型組的12只大鼠膀胱結(jié)石成分中，9只為碳酸磷灰石，3只為磷酸銨鎂和碳酸磷灰石的混合結(jié)石。兩個對照組的膀胱結(jié)石成分均為碳酸磷灰石。

2.3 大鼠排尿行為模型組大鼠在實驗結(jié)束前進(jìn)行尿斑實驗，實驗結(jié)果顯示，與健康大鼠相比，模型組大鼠尿斑點數(shù)量較多，且在濾紙中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)多個尿斑點，主尿斑所占百分比減少，提示模型大鼠存在尿頻癥狀。模型組大鼠在濾紙中央?yún)^(qū)域的估測尿量多于健康大鼠，根據(jù)正常大鼠通常存在的趨觸性特征，提示模型大鼠存在尿急癥狀(圖4)。

A: 模型組和健康對照組大鼠尿斑實驗結(jié)果對照圖(a～c為模型組大鼠尿斑圖，可見尿斑點數(shù)量較多且在濾紙中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)多個尿斑點，d～e為健康對照組大鼠尿斑圖，尿斑點數(shù)量較少，且尿斑主要集中在濾紙邊緣或角落)；B: 模型組和健康對照組的尿斑數(shù)據(jù)分析。*P < 0.05；N.S：差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 結(jié)石的電鏡觀察選取模型組大鼠膀胱結(jié)石進(jìn)行掃描電鏡檢查，可見結(jié)石表面存在大量結(jié)晶體，縱橫排列，在結(jié)晶體表面及內(nèi)部可見細(xì)菌相關(guān)的生物膜以及大量桿菌存在，桿菌形態(tài)不一，處于不同的生長時期(圖5)。

A、B、D：放大1萬倍下可見結(jié)晶體、生物膜以及桿菌;C、E、F：放大2萬倍可見生物膜上桿菌形態(tài)各異，處于不同生長時期。

3 討 論

膀胱內(nèi)異物、局部感染及下尿路梗阻是膀胱感染性結(jié)石的常見誘因，但是目前利用膀胱異物構(gòu)建感染性結(jié)石的動物研究并不多見，LINSENMEYER等[4]認(rèn)為將SD大鼠作為此類研究的動物模型是一種較好選擇。本研究顯示由膀胱異物聯(lián)合脆弱擬桿菌液灌注誘導(dǎo)出的結(jié)石成分包括碳酸磷灰石和磷酸銨鎂，前者較多見，兩者均屬于感染性結(jié)石，因此本次研究的動物模型形成的感染性結(jié)石是以碳酸磷灰石為主的。感染性結(jié)石的形成與解脲酶細(xì)菌感染、細(xì)菌生物膜、細(xì)菌拓殖以及尿液中的磷酸銨鎂結(jié)晶等因素有關(guān)，在此次實驗中，膀胱內(nèi)異物為灌注的細(xì)菌提供了拓殖的空間，其后在異物表面形成細(xì)菌生物膜，有利于尿液中磷酸銨鎂結(jié)晶的附著和聚集。

目前感染性結(jié)石動物模型多采用奇異變形桿菌作為灌注菌液，該細(xì)菌為解脲酶細(xì)菌，且在人類感染性結(jié)石患者的尿液細(xì)菌培養(yǎng)中有較高的檢出率，本次研究選擇灌注的脆弱擬桿菌是本課題組團(tuán)隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)的支架管結(jié)殼患者尿液菌群中豐度占比最大的菌屬——擬桿菌屬的常見細(xì)菌，該菌是一種厭氧菌，常見于人類呼吸道、腸道和生殖道，是擬桿菌屬的代表菌株，在本次實驗中我們給大鼠膀胱內(nèi)灌注脆弱擬桿菌后，圍繞膀胱異物的感染性結(jié)石發(fā)生率明顯增高，這說明脆弱擬桿菌的生物學(xué)功能有利于支架管結(jié)殼事件的發(fā)生，從以下兩方面進(jìn)行合理推理：①脆弱擬桿菌可以結(jié)合尿液中的鈣離子。有文獻(xiàn)報道，與其他細(xì)菌不同的是，擬桿菌屬細(xì)菌的脂質(zhì)A上的?；D(zhuǎn)移酶LpxA含有3個鈣離子結(jié)合位點，在堿基序列Asn89的調(diào)控下，能結(jié)合3個鈣離子，且其中1個鈣離子位于呈三重軸空間構(gòu)象的LpxA的中心區(qū)域，但鈣離子發(fā)揮的作用尚不明確[5]。②脆弱擬桿菌細(xì)胞膜具多種特性，可通過分泌特殊蛋白并改變細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)形態(tài)，參與生物膜的形成[6]。PUMBWE等[7]的研究也顯示脆弱擬桿菌在不同的人體環(huán)境中，如血液、膿液及糞便中，其胞膜都表現(xiàn)出不同的超微結(jié)構(gòu)和表達(dá)不同外排功能的外排泵作為對周圍環(huán)境的反應(yīng)，推測其釋放的物質(zhì)可能參與了支架管結(jié)殼事件的發(fā)生。另外，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)脆弱擬桿菌可以釋放黏蛋白凝膠，有利于生物膜的形成[8]。

既往研究顯示，有多種方式可以實現(xiàn)在大鼠膀胱內(nèi)放置異物，例如進(jìn)行腹部手術(shù)切開膀胱后放置異物，也可以經(jīng)過腹部穿刺將異物置入膀胱內(nèi)，或者采用和本研究類似的無創(chuàng)方法將異物經(jīng)尿道置入膀胱內(nèi)[4,9-11]。對于采用有創(chuàng)操作將異物放入膀胱內(nèi)的方式，創(chuàng)傷以及相關(guān)并發(fā)癥可能會顯著影響大鼠生存以及生理功能，對進(jìn)一步的深入研究造成影響[12]。采用無創(chuàng)辦法將螺旋管置入大鼠膀胱，可最大限度的避免操作本身對大鼠模型的影響，實現(xiàn)模型大鼠的長期生存，因此本課題組采用與LINSENMEYER[4]、KUROSAKA[9]等相似的無創(chuàng)辦法將異物置入大鼠膀胱內(nèi)，但我們在螺旋管制作工藝上進(jìn)行改進(jìn)，我們使用5號注射器針頭而不是18號注射器針頭，增大螺旋管弧度，減少異物在膀胱內(nèi)容積，減少尿潴留發(fā)生的幾率。

評估嚙齒類動物排尿行為的主要檢測手段包括尿斑實驗、膀胱測壓和尿流率測定，本研究采用尿斑實驗方法來評估大鼠膀胱內(nèi)結(jié)石對排尿行為的影響，該方法的特點是無創(chuàng)、廉價且可以重復(fù)實驗，實驗過程中我們遵循美國國立衛(wèi)生院在2015年制定的尿斑試驗專家共識[13]，設(shè)計尿斑實驗應(yīng)該具備的基本要素，目的是檢測膀胱結(jié)石模型大鼠能否模擬出膀胱結(jié)石患者常見的LUTS癥狀，制定評價指標(biāo)的依據(jù)包括動物的正向趨觸性、實驗?zāi)康暮图夹g(shù)條件等因素，正向趨觸性體現(xiàn)在老鼠通常會選定鼠籠的某個邊緣區(qū)域作為安全排尿區(qū)域，在此處多次排尿，相反在鼠籠中央?yún)^(qū)域排尿被視為不正常的排尿行為[14-15]。事實上，已有多項研究通過尿斑實驗評估模型動物的排尿行為，以此解釋人類相關(guān)疾病所表現(xiàn)出來的LUTS癥狀[16-18]，本研究選擇尿斑數(shù)量、主尿斑所占尿斑面積百分比、中央?yún)^(qū)尿量百分比和總尿量等比較常用的評價指標(biāo)來反映排尿情況。與健康對照組大鼠相比，模型大鼠的尿斑數(shù)量相對增多，主尿斑所占面積下降，這可以解釋為膀胱內(nèi)異物所致膀胱有效容積下降，排尿次數(shù)增多，每次尿量減少，同時異物帶來的不適感影響到大鼠正向趨觸性，大鼠在濾紙中央?yún)^(qū)出現(xiàn)反常的排尿行為，因此在中央?yún)^(qū)尿量所占的百分比要大于對照組。

雖然長期生存的模型大鼠能夠在感染、膀胱異物附壁結(jié)石以及排尿行為等方面模擬出人類膀胱感染性結(jié)石的臨床表現(xiàn)，但是要想成功建立一個成熟的泌尿系感染性結(jié)石動物模型仍然是一個艱巨的挑戰(zhàn)，受限于實驗動物的生理條件、實驗材料及操作技術(shù)瓶頸，目前尚不能向大鼠腎臟內(nèi)無創(chuàng)的逆向灌注細(xì)菌液，這也就決定了無法通過模型動物模擬出人類感染性腎結(jié)石所表現(xiàn)出來的臨床癥狀，同時本研究也存在一些局限性，如沒有通過電鏡對異物表面細(xì)菌生物被膜進(jìn)行觀察和研究；沒有通過病理HE染色對感染造成的膀胱黏膜炎癥程度進(jìn)行評估；也沒有對改善模型大鼠并發(fā)癥方面進(jìn)行深入研究，這都是我們課題組未來努力的方向，但是不可否認(rèn)的是本研究為探索此類動物模型做出的積極嘗試，對模型大鼠在實驗周期內(nèi)的生理病理指標(biāo)進(jìn)行合理分析，能夠表現(xiàn)出膀胱結(jié)石患者的部分癥狀，本實驗室其后進(jìn)行的類似動物實驗顯示動物模型穩(wěn)定且具有可重復(fù)性，同時也對既往動物模型中的制作工藝提出了建設(shè)性意見。