水稻白葉枯病抗性基因和相關(guān)因子研究利用進(jìn)展

李 舟，楊雅云，戴陸園，張斐斐，阿新祥，董 超，王 斌，湯翠鳳

（1云南大學(xué)資源植物研究院，昆明 650504；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部云南稻種資源科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，昆明 650223）

0 引言

水稻是世界上最重要的糧食作物，由Xanthomonas oryzaepv.Oryzae，Xoo引起的水稻白葉枯病，嚴(yán)重制約稻谷產(chǎn)量[1]。水稻生產(chǎn)上廣泛使用化學(xué)藥劑防治該病害，但長期實(shí)踐表明發(fā)掘抗病新基因、培育抗病品種是解決這一問題的最經(jīng)濟(jì)和有效的途徑。然而，近年鮮有研究對經(jīng)國際鑒定報(bào)道的抗病新基因進(jìn)行概述歸納與總結(jié)，抗病基因作用機(jī)制并不清晰，也并未有文章報(bào)道白葉枯病抗病相關(guān)因子的研究進(jìn)展。因此本文基于Xoo侵染、抗病機(jī)制研究，對近年來水稻抗白葉枯病基因的定位克隆、功能類型以及抗病相關(guān)因子的研究進(jìn)展做了簡要綜述，以期為現(xiàn)階段抗白葉枯病基因的發(fā)掘利用和抗病機(jī)制深入研究提供參考。

1 Xoo致病機(jī)制與水稻抗病機(jī)制概述

白葉枯病菌通常從水稻自然開口處進(jìn)入葉片組織，在細(xì)胞間隙繁殖，并通過木質(zhì)部容器傳播到其他部分[2-3]。白葉枯病原菌通常會利用II型或III型分泌系統(tǒng)在植物體內(nèi)更好的生長繁殖。其中，II型分泌系統(tǒng)能分泌多種碳水化合物降解酶削弱細(xì)胞壁，使Xoo更容易獲取營養(yǎng)[4-5]；III型分泌系統(tǒng)分泌效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)錄激活物樣TAL和非TAL效應(yīng)蛋白劫持寄主代謝以促進(jìn)其生長發(fā)育[6-7]。同時(shí)，Xoo還能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子檢測局部種群密度以調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)模式并分泌胞外多糖，阻塞木質(zhì)部增強(qiáng)致病性[8-9]。

而水稻植株受到Xoo侵入后，基礎(chǔ)免疫PTI與效應(yīng)觸發(fā)免疫ETI防御機(jī)制被觸發(fā)[10-11]。PTI和ETI由受體激酶蛋白、重復(fù)序列蛋白以及其他抗病因子介導(dǎo)。PTI包括活性氧(ROS)的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加、細(xì)胞壁胼胝質(zhì)沉積、抗菌化合物以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活等[12]；ETI是定性抗性[13]，大部分由主效抗病基因調(diào)控，對病原菌某個(gè)或少數(shù)生理小種免疫或高抗，主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，這些抗性蛋白能夠直接或間接識別病原體在宿主細(xì)胞內(nèi)分泌的特定毒力效應(yīng)子，反應(yīng)出了快速且更強(qiáng)的抗病性，它們通常與感染部位的程序性細(xì)胞死亡有關(guān)，還涉及其他防御反應(yīng)包括ROS的產(chǎn)生、細(xì)胞壁的增強(qiáng)、有毒代謝物或蛋白質(zhì)的積累以及激素水平的改變[14]。在植物抗病這一過程中，抗病基因與抗病相關(guān)因子參與植物PTI與ETI反應(yīng)，通過編碼抗性蛋白、改變植物通路信號、改變細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)等多種方式，調(diào)控植物抗病反應(yīng)，最終使植物抵御白葉枯病或減輕植物感病癥狀等。

2 水稻抗白葉枯病基因的定位與克隆

2.1 水稻抗白葉枯病基因的定位現(xiàn)狀

在水稻抵御白葉枯病過程中，抗白葉枯病基因普遍參與植物PTI或ETI反應(yīng)，由于宿主植物遺傳多樣性與抗病基因緊密關(guān)聯(lián)，不同的水稻品種或群體會出現(xiàn)不同的感染癥狀[15]。迄今利用各種方法定位出的抗白葉枯病的主效基因經(jīng)過國際確認(rèn)和文獻(xiàn)報(bào)道的至少有48個(gè)（見表1），其中31個(gè)為顯性基因Xa，17個(gè)為隱性基因xa，且發(fā)現(xiàn)的大量抗白葉枯病基因在第4號和第11號染色體上成簇分布，而第9和第10染色體上則暫未有抗白葉枯病基因被定位。對抗白葉枯病基因進(jìn)行定位，促進(jìn)了基因的進(jìn)一步克隆及在水稻抗病育種中的利用。

表1 水稻抗白葉枯病基因的定位、連鎖標(biāo)記、蛋白類型（*代表已克隆基因）

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 水稻抗白葉枯病基因的克隆

目前已被克隆的水稻抗白葉枯病主效基因有18個(gè)，其中Xa1、Xa3/Xa26、xa5、Xa21等基因的克隆研究情況已被何翔等[67]、李定琴等[68]介紹，故下面僅對2017年以來克隆的7個(gè)抗白葉枯病主效基因作簡要介紹。

Xa10從水稻品種Cas209中發(fā)現(xiàn)并定位于第11號染色體[26]，TIAN等[25]將其分離并發(fā)現(xiàn)編碼了126個(gè)含氨基酸蛋白，通過誘導(dǎo)消耗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，抵御病菌侵入；SUN等[19]將Xa4定位于第11號染色體47 kb區(qū)段上，HU等[59]在精細(xì)定位的基礎(chǔ)上將Xa4分離克隆并發(fā)現(xiàn)編碼細(xì)胞壁相關(guān)激酶(WAK)，能增強(qiáng)細(xì)胞壁進(jìn)而增強(qiáng)了對Xoo的抵抗力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因增強(qiáng)水稻抗倒伏性，在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中被廣泛應(yīng)用[69]；ZHANG等[48,70-71]過同源克隆和圖位克隆的方法分離克隆了Xa2、Xa14和Xa31(t)，發(fā)現(xiàn)Xa31(t)與Xa2是相同的基因，且發(fā)現(xiàn)Xa1，Xa2和Xa14之間的相互作用使得水稻表現(xiàn)出不同的抗病性，且至少存在一個(gè)由Xa1，Xa2和Xa14所組成的獨(dú)特基因座賦予了水稻抗病性。同期，JI等[63]克隆了Xa2，Xa31(t)，Xa14，CGS-Xo111和Xa45(t)，通過序列分析發(fā)現(xiàn)這些基因及其預(yù)測的蛋白質(zhì)高度保守，形成一組Xa1等位基因，與ZHANG等[69]研究結(jié)果一致；Xa7由COHEN等[72]定位在水稻第6號染色體51 kb的區(qū)段上，梅樂[73]在此基礎(chǔ)上通過構(gòu)建BAC文庫，比對水稻品種間的序列同源性，篩選出易感突變體，通過映射區(qū)域比對，將Xa7錨定在28 kb的區(qū)域中最終分離克隆；xa41(t)是HUTIN等[59]在OsSWEET14的啟動子中篩選并分離克隆，啟動子缺失的18 bp與其他幾個(gè)已知激活OsSWEET14基因的TAL效應(yīng)子靶向的結(jié)合位點(diǎn)重疊，進(jìn)而產(chǎn)生了對白葉枯病的抗性。

2.3 抗白葉枯病基因的功能類型

水稻抗白葉枯病基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)分為五類，即編碼受體激酶蛋白RLK的抗性基因，編碼NLR蛋白的抗性基因、編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET基因、執(zhí)行基因和其他類型的基因。

受體激酶蛋白RLK是一類植物細(xì)胞膜表面的模式識別受體，是植物先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分[74]。通常包含胞外結(jié)構(gòu)域、單程跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域[69]。Xa21編碼的跨膜富亮氨酸重復(fù)序列LRR結(jié)構(gòu)域能識別Xoo中的RaxX蛋白進(jìn)而激發(fā)免疫反應(yīng)[37]。Xa3/Xa26編碼蛋白的胞外的結(jié)構(gòu)域由26個(gè)不完全的LRR組成，研究推測該基因編碼的LRR能夠識別Xoo中的特異蛋白而激發(fā)免疫反應(yīng)[18,75]。Xa4[76]編碼由707個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞壁相關(guān)激酶WAK，能將細(xì)胞壁與質(zhì)膜連接起來，并把細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)纖維素合成并抑制細(xì)胞壁松弛來增強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)了對Xoo的抵抗力[77]。

NLR蛋白是含有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸重復(fù)序列的抗病蛋白，通常能識別病原菌的特定效應(yīng)蛋白TAL來觸發(fā)小種特異性免疫反應(yīng)。Xa1[16]編碼的NLR蛋白通過識別包括PthXo1、Tal4和Tal9d在內(nèi)的幾種TAL效應(yīng)子來賦予對Xoo的抗性[78]。近期被克隆的4個(gè)Xa1的等位基因Xa2、Xa14、Xa31(t)和Xa45，均編碼禾本科特有的NLR蛋白，這些基因互相協(xié)同作用，組成的獨(dú)特基因座能激發(fā)水稻對Xoo的抗性[63,69]。

SWEET家族蛋白是一類獨(dú)特的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過SWEET蛋白輸出到細(xì)胞質(zhì)外體的糖會被病原體的TAL效應(yīng)子劫持[79]。研究發(fā)現(xiàn)Xoo中的一種TAL效應(yīng)器PthXo1直接靶向顯性基因Xa13效應(yīng)子結(jié)合元件EBE，以誘導(dǎo)病原菌的表達(dá)，同時(shí)還能利用OsSWEET11蛋白協(xié)同其他銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白去除水稻木質(zhì)部導(dǎo)管中的銅[80]，而xa13[29]編碼的SWEET蛋白不受Xoo誘導(dǎo)，木質(zhì)部導(dǎo)管中的銅抑制了Xoo的生長，進(jìn)而表現(xiàn)出抗病性。隱性基因xa25[41]編碼蛋白OsSWEET13相關(guān)抗病機(jī)理暫不明確。xa41(t)編碼蛋白對Xoo中兩種TAL效應(yīng)器AvrXa7和Tal5的識別位點(diǎn)發(fā)生了缺失突變，進(jìn)而產(chǎn)生抗性[59]。

執(zhí)行基因Executor是一類重要的抗白葉枯病基因，具有多個(gè)潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域作為啟動子陷阱，能被TAL效應(yīng)子轉(zhuǎn)錄激活并觸發(fā)防御反應(yīng)。Xa27能被攜帶AvrXa27效應(yīng)器的Xoo特異性誘導(dǎo)，使水稻維管束細(xì)胞次生細(xì)胞壁變厚，抵御白葉枯病[44]。Xa23啟動子區(qū)域含有結(jié)合位點(diǎn)UPT[81]，因而擁有更廣的抗譜。Xa10[25-26]通過直接結(jié)合Xa10的啟動子特異性誘導(dǎo)AvrXa10表達(dá)。Xa7啟動子中存在效應(yīng)子結(jié)合元件EBE能被AvrXa7或PthXo3誘導(dǎo)，進(jìn)而激發(fā)Xa7產(chǎn)生免疫反應(yīng)[72]。

TFIIAγ是一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子能直接影響聚合酶的轉(zhuǎn)錄[82]?？拱兹~枯病基因xa5編碼突變的轉(zhuǎn)錄因子TFIIAγ5V39E，相比與TFIIAγ5/Xa5，xa5編碼的蛋白僅含有一處氨基酸突變[20]，xa5編碼的TFIIAγ5V39E阻礙了TFIIAγ5與TAL的結(jié)合，從而影響了白葉枯菌的侵染[83]。

3 水稻抗白葉枯病相關(guān)因子的研究

在植物抗病過程中，抗病基因發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，同時(shí)大量抗病相關(guān)因子也參與抗病過程，這類因子正向或負(fù)向調(diào)控抗病反應(yīng)，或者間接調(diào)控抗病基因，但因其調(diào)控的抗性水平相對較低，通常需要使用超量表達(dá)或者抑制表達(dá)的方法研究抗病相關(guān)因子[84]。對抗病相關(guān)因子的研究與利用，有助于更深入理解水稻抗病機(jī)制，增強(qiáng)水稻對白葉枯病的抗性并拓寬其抗譜。目前，水稻中編碼抗病相關(guān)因子的基因約有900個(gè)，其中至少30個(gè)基因編碼抗病因子從而影響Xoo的侵染[85]，下面僅列舉幾種常見的類型。

3.1 植物激素類抗病因子

生長素是一種重要的植物激素，也是植物抗病機(jī)制中的關(guān)鍵因子。吲哚-3-乙酸IAA是生長素的一種主要形式，外源施用IAA會增加水稻白葉枯病斑的面積[86]。植物GH3基因家族成員編碼的GH3蛋白能將IAA與氨基酸連接，從而使IAA失活。超量表達(dá)水稻OsGH3-2或OsGH3-8后，水稻體內(nèi)游離生長素的含量下降，但是對白葉枯病產(chǎn)生了廣譜抗性[87-88]。

水楊酸通常在植物被Xoo侵染后合成，侵染的部分迅速合成水楊酸，使被侵染部分發(fā)生超敏反應(yīng)，隨后通過維管束組織向其他的未被侵染的部分運(yùn)輸，逐漸使整個(gè)植株獲得抗性。NPR1是擬南芥中一個(gè)重要基因，通過超量表達(dá)該基因在水稻中的同源基因NH1后，激活了水稻的防御反應(yīng)，抑制白葉枯病菌的生長，推測該基因能夠直接結(jié)合水楊酸以單體的形式進(jìn)入細(xì)胞核，并與相關(guān)的TGA轉(zhuǎn)錄因子互作[89]。

茉莉酸作為植物抗病反應(yīng)的重要信號分子，能激活與植物抗病反應(yīng)相關(guān)的防御保護(hù)機(jī)制，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對多種病害的系統(tǒng)獲得抗性[90]。KE[91]等發(fā)現(xiàn)水稻基因OsPAD4編碼一種質(zhì)膜蛋白，能與植物體內(nèi)游離的茉莉酸結(jié)合，增強(qiáng)水稻對Xoo的抗性。研究發(fā)現(xiàn)水楊酸信號通過誘導(dǎo)多種OsPIPs基因的表達(dá)，抑制白葉枯病菌侵染，提高水稻抗病性。

3.2 WRKY類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子，廣泛參與植物各種生理過程。目前從水稻基因組中克隆和鑒定出WRKY基因至少有109個(gè)[92]，根據(jù)功能類型分為：響應(yīng)生物脅迫類、響應(yīng)非生物脅迫類、參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類、參與植物的生長發(fā)育類。其中一部分響應(yīng)生物脅迫類WRKY基因能通過多種方式調(diào)節(jié)植物對Xoo的免疫反應(yīng)[93]，例如OsWRKY13[94]能影響類植物抗毒素——黃酮素的合成，超量表達(dá)該基因后發(fā)現(xiàn)對白葉枯病的抗性有所增強(qiáng)；WRKY30的超量表達(dá)增強(qiáng)了水稻對白葉枯病的抗性，并且該基因的轉(zhuǎn)錄物在受到水楊酸和茉莉酸的影響下迅速積累，推測該基因可能還與植物激素類抗病因子有協(xié)同關(guān)系[95]；WRKY45-1和WRKY45-2介導(dǎo)不同的防御信號傳導(dǎo)途徑，他們編碼的蛋白在抗病過程中發(fā)揮了相反的作用。OsWRKY45-1過表達(dá)的植株顯示出對白葉枯病的抗性隨著水楊酸和茉莉酸的積累增加增強(qiáng)，而WRKY45-2則與之相反[96]；WRKY6[97]正向調(diào)控水稻防御相關(guān)基因OsPR10a，通過直接與OsICS1啟動子結(jié)合，激活SA介導(dǎo)的調(diào)控通路，從而增強(qiáng)防御反應(yīng)；WRKY62[98]負(fù)調(diào)控抗白葉枯病主效基因Xa21介導(dǎo)的抗性，水稻在白葉枯病菌感染后對防御相關(guān)基因的激活受到抑制。

3.3 sRNAs類抗病因子

sRNAs是一類長度在21～24 nt的非編碼小分子，參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，作用機(jī)制復(fù)雜。在植物體中，sRNAs對植物的生長發(fā)育、激素轉(zhuǎn)導(dǎo)、適應(yīng)生物與非生物脅迫等生物進(jìn)程具有重要作用，同時(shí)也參與調(diào)控植物的免疫反應(yīng)?？拱兹~枯病相關(guān)的OsmiR1858a，其靶基因?yàn)镺sHIN1，編碼一類特殊的sRNA，對該基因進(jìn)行超量表達(dá)發(fā)現(xiàn)對Xoo表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性[99]。另外研究發(fā)現(xiàn)，植物除了可以利用RNA結(jié)合蛋白這一機(jī)制來調(diào)節(jié)自身免疫，還可以利用sRNA與蛋白互相作用來調(diào)節(jié)自身免疫，例如Bsr-k1基因能編碼一種TPR域蛋白，該蛋白通過與植物體內(nèi)的miRNA相互作用，進(jìn)而增強(qiáng)對Xoo的抗性[100]。

4 抗白葉枯病基因利用設(shè)想與展望

4.1 抗病新基因的發(fā)掘

目前已被發(fā)掘的抗白葉枯病基因約有1/3被定位于水稻第11號染色體上，如Xa4、Xa10、Xa21[19,26,38]等。因此，可以推斷水稻第11號染色體上應(yīng)該還有很多新的抗白葉枯病基因，而基于高通量測序的信息解析技術(shù)以及基因編輯技術(shù)有望對第11號染色體上的基因進(jìn)行挖掘和功能驗(yàn)證，系統(tǒng)的解析抗病新基因。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)一個(gè)來自云南耿馬縣的地方稻種毫糯揚(yáng)中攜帶有新的抗白葉枯病基因Xa48(t)，該基因定位在第11號染色體長臂端的0.12 Mb區(qū)段內(nèi)，挖掘該基因?qū)榻馕鏊究共C(jī)制提供新的線索。

4.2 抗病新基因的克隆與利用

迄今，被克隆的抗白葉枯病基因有17個(gè)，僅占被報(bào)道抗病基因的1/3，仍有大量抗病基因未被克隆利用，有些被確定的抗病基因由于定位區(qū)間過大、候選基因復(fù)雜而難以被克隆。就現(xiàn)階段而言，可以利用多方法組合克隆目標(biāo)基因，例如將圖位克隆與突變體篩選相結(jié)合克隆出了Xa7。而今后基于高通量測序的克隆技術(shù)有望對曾被出定位的基因進(jìn)行更精細(xì)定位以及克隆，甚至對易感基因片段進(jìn)行基因編輯與功能驗(yàn)證，進(jìn)而探究基因、蛋白的互作機(jī)理，加速水稻的抗病育種研究進(jìn)程。

4.3 抗病基因與抗病相關(guān)因子的協(xié)同利用

目前發(fā)掘的抗白葉枯病相關(guān)因子30余個(gè)，不同家族之間的抗病因子互相影響，使水稻具有特異性或廣譜性的抗性。例如部分WRKY基因能調(diào)控水稻的PR基因，進(jìn)而激活植物激素或者其他抗病因子[96]，多種抗病因子相互協(xié)同，編碼豐富的抗病產(chǎn)物，激發(fā)植物免疫反應(yīng)。此外，抗病相關(guān)因子還受到主效抗病基因的影響，共同抵御Xoo的侵染，例如抗病基因Xa21編碼的XA21能與一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY62結(jié)合，負(fù)向調(diào)控水稻抗病性[101]；此外，XA21還能與類生長素蛋白XB21互作，提高對Xoo的抗性[102]。但由于抗病相關(guān)因子數(shù)量多且功能復(fù)雜，編碼抗病相關(guān)因子的基因并未全部發(fā)掘與定位，今后有望利用多組學(xué)手段對編碼抗病因子的基因進(jìn)行克隆鑒定，對抗病相關(guān)因子進(jìn)行分類整理，與其他植物抗病相關(guān)基因進(jìn)行橫向比較，研究其同源基因在其他植物上的功能特征，以期在植物大背景下深入研究對抗病相關(guān)因子與抗病基因的相互作用，通過抗病基因與抗病因子的綜合利用，選育出更持久廣譜的抗性品種。