聚氯乙烯材質醫(yī)療器械細胞毒性檢測方法的探究

伍錫棟 林引花 徐麗瑛 朱思睿 孫英朔

1 江西省醫(yī)療器械檢測中心檢測四室 （江西 南昌 330000）

2 南昌大學藥學院 （江西 南昌 330000）

內容提要： 目的：對聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）材質醫(yī)療器械的浸提液制備方法進行探索，為其細胞毒性檢測提供依據(jù)。方法：按照GB/T16886.12中規(guī)定的浸提比例（0.2g/mL），改變浸提溫度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）、時間（2h、4h、8h、12h、24h、48h）、濕度（100%、90%、80%、70%）和搖床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min），通過體外細胞毒性檢測方法評價PVC材質醫(yī)療器械不同的浸提液對細胞毒性的影響。結果：細胞毒性與浸提樣品的時間、溫度及搖床轉速呈正相關性，其中38°C、48h及搖床轉速8000r/min細胞毒性最高，均＜70%，按照GB/T16886.5-2017判定均具有細胞毒性；結論：PVC材質醫(yī)療器械的體外細胞毒性對樣品浸提液制備過程中浸提時間和搖床速率要求嚴格，在制備浸提液時應該根據(jù)產(chǎn)品的臨床使用情況合理選擇浸提時間和搖床的速率。

聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）是由氯乙烯單體在過氧化物等引發(fā)劑或者光熱條件下聚合而成的高分子聚合物，是世界上最早實現(xiàn)工業(yè)化的合成樹脂之一，具有加工方便、可消毒、柔軟、耐壓等優(yōu)良特性，被廣泛應用于日常生活。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，2018年我國醫(yī)用塑料市場消費中PVC的用量占比高達28%，以PVC為材料的醫(yī)療器械普遍使用，PVC材質的醫(yī)療器械因會與人體接觸所以需要格外注意其生物安全性[1]。細胞毒性試驗是一種在體外借助相關的細胞，模擬細胞生長環(huán)境，具有廣泛的通用性，在醫(yī)療器械的生物學評價中作為常規(guī)評價方法之一，是對醫(yī)療器械生物學評價的重要指標之一。GB/T16886.12針對樣品浸提液制備方法比較統(tǒng)籠，然市場上PVC材料來源質量參差不齊，且加工過程中常添加增塑劑等物質，加工的產(chǎn)品狀態(tài)及形狀等均可能影響其浸出物的不同，直接影響產(chǎn)品細胞毒性等生物學的評價，本文針對PVC材質的醫(yī)療器械在制備浸提液時可能的影響因素進行比較探究，為此類材質的醫(yī)療器械產(chǎn)品的浸提液制備方法提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 一般材料

細胞與試劑：L929細胞（來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫）；MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，批號：2085588）；胎牛血清（Excell公司，批號2261480CP）；0.25%胰蛋白酶EDTA消化液（Solarbio公司，批號：20210717）；100×青鏈霉素混合液（Solarbio公司，批號：20210625）等。

儀器設備：恒溫培養(yǎng)搖床（KYC-1102C），二氧化碳培養(yǎng)箱（CLM-170B-8-NF），倒置生物顯微鏡（AE31），電子天平（JY2003），自動細胞計數(shù)儀（IC1000），壓力蒸汽滅菌器（DSX-280KB24），全自動酶標儀（ELx800）等。

1.2 方法

1.2.1 浸提液制備

無菌條件下制備供試品浸提液，浸提比例為0.2g/mL，改變浸提溫度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）、時間（2h、4h、8h、12h、24h、48h）、濕度（100%、90%、80%、70%）和搖床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min），浸提液為含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。陰性對照為高密度聚乙烯浸提液，陽性對照為10%二甲基亞砜（DMSO）培養(yǎng)液，置于振幅為100r/mim恒溫震蕩箱中24h[2,3]。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察

24h后，棄去加入96孔板中細胞孔的原培養(yǎng)液，加入空白對照液、陰性對照液、陽性對照液及供試液，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，于生物學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細胞溶解和細胞膜完整性等方面的改變。

1.2.3 MTT細胞毒性檢測

棄去培養(yǎng)液，每孔加入50μL 1mg/mL的MTT溶液，37°C孵育2h后棄去所有孔內液體，加入0.1mL異丙醇，置振蕩器上振蕩10min，在酶標儀上雙波長（570nm）測定吸光度，計算細胞存活率（%）=OD570e/OD570b×100（OD570e試樣樣品浸提液光密度平均值；OD570b空白液光密度平均值）。

2.結果

2.1 改變浸提液制備的濕度

在不同濕度（100%、90%、80%、70%）制備試驗液，試驗液接觸24h后觀察細胞形態(tài)、空泡、溶解等情況，并MTT法檢測其OD值，計算細胞存活率，結果見圖1和表1。

2.2 改變浸提液制備的溫度

在不同溫度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）制備試驗液，試驗液接觸24h后觀察細胞形態(tài)、空泡、溶解等情況，并MTT法檢測其OD值，計算細胞存活率，結果見圖2和表2。

2.3 改變浸提液制備的時間

在不同時間（2h、4h、8h、12h、24h、48h）制備試驗液，試驗液接觸24h后觀察細胞形態(tài)、空泡、溶解等情況，并MTT法檢測其OD值，計算細胞存活率，結果見圖3和表3。

2.4 改變浸提液制備的搖床速率

在不同搖床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min）下制備試驗液，試液液接觸24h后觀察細胞形態(tài)、空泡、溶解等情況，并MTT法檢測其OD值，計算細胞存活率，結果見圖4和表4。

3.討論

聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）材質的醫(yī)療器械對接觸的藥品影響非常巨大，不僅會改變藥品的成分，而且還會加快藥物的聚合反應，影響人體健康，甚至影響到人生命。國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品包裝容器（材料）標準YBB00012003中關于細胞毒性檢查法的供試液制備要求用玻璃器皿作為浸提容器[4,5]；中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布的國家標準GB/T16886.5中體外細胞毒性實驗的浸提條件要求在無菌、化學惰性的封閉容器中進行，ISO10993中體外細胞毒性測試中浸提條件要求盡量模擬臨床使用條件，應在無菌、化學惰性的封閉容器中進行[6,7]。然而PVC因為性能穩(wěn)定、價格低廉而廣泛應用于醫(yī)療器械領域，企業(yè)生產(chǎn)PVC材質的產(chǎn)品需要根據(jù)使用的需求不同而加入不同比例的增塑劑、熱穩(wěn)定劑、色素等添加劑，但是因為添加劑的使用會造成一定的生物毒性，對人體健康造成危害，在PVC材料加工時增塑劑和熱穩(wěn)定劑的使用量最大。細胞毒性研究是醫(yī)療器械生物學評價經(jīng)典的試驗方法，其干擾和影響因素復雜，類似上述列舉的添加劑極其常見，故會給產(chǎn)品的生物性能帶來一定的不可控的風險點，其中，產(chǎn)品的使用溫度要求等都會影響產(chǎn)品的實際生物學性能等，故對其在生物學評價的細胞毒性浸提液制備中可能影響的因素有必要深入的研究。

本項目從通過體外細胞毒性檢測方法評價PVC材質醫(yī)療器械不同的浸提液對細胞毒性的影響，對浸提樣品浸出物可能影響的因素進行深入的研究比較，得出浸提時間、浸提溫度、搖床轉速等都會對細胞毒性的檢測產(chǎn)生不同的影響，浸提時間越長、浸提溫度越高及搖床轉速越高，細胞毒性越大，提示可能跟樣品浸提溶出物濃度有關，也可能材料中確實存在一些不確定的物質等，此實驗結果將為企業(yè)有關生產(chǎn)工藝改進提供試驗基礎，同時為此類產(chǎn)品的檢驗檢測提供實驗依據(jù)，在實際檢驗檢測中應該根據(jù)產(chǎn)品的實際使用情況選擇不同的浸提條件，才能比較客觀地反映產(chǎn)品的生物學毒性等。