非洲豬瘟弱毒疫苗及病毒適應(yīng)細(xì)胞的研究進(jìn)展

李少麗 ， 王家福 ， 康 斌 ， 李建林 ， 尹忠良

(杭州佑本動(dòng)物疫苗有限公司 ， 浙江 杭州 310018)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是豬的一種高度接觸性、急性出血性傳染病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)法定報(bào)告的七類動(dòng)物疫病之一，其病原為非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)，屬于非洲豬瘟病毒家族唯一成員，是一種基因組為170～193 kb、編碼150多種蛋白的雙鏈DNA病毒[1]。ASF最初于1921年在肯尼亞被發(fā)現(xiàn)[2]，之后在非洲撒哈拉沙漠以南、撒丁島和意大利地區(qū)作為一種地方性疾病零星散發(fā)，2007年在格魯吉亞發(fā)生[3]，2017年傳播到包括俄羅斯在內(nèi)的周邊鄰國(guó)，2018年在中國(guó)、韓國(guó)暴發(fā)[4-5]，2019年在越南暴發(fā)[6]，全球大范圍ASF的暴發(fā)加大了養(yǎng)豬業(yè)防控ASF的難度。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有任何商品化疫苗批準(zhǔn)上市，豬場(chǎng)主要通過加強(qiáng)生物安全，早發(fā)現(xiàn)、早排查、精準(zhǔn)剔除等措施進(jìn)行防控。

1 ASF弱毒疫苗研究進(jìn)展

ASFV感染存活的豬可抵抗同種病原的感染，提示學(xué)者們開發(fā)ASF疫苗也許可對(duì)該病產(chǎn)生很好的控制，實(shí)際上自ASF發(fā)生以來，關(guān)于ASF疫苗的研究從未間斷。然而傳統(tǒng)的滅活疫苗、重組蛋白疫苗、DNA疫苗和DNAs/蛋白組合疫苗的免疫效果均不理想，因此，人們將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向ASF弱毒活疫苗，無論是自然分離弱毒株還是基因工程弱毒株，當(dāng)ASFV毒力充分致弱的情況下，可對(duì)同源甚至異源毒株產(chǎn)生一定的攻毒保護(hù)。

人工致弱的ASFV毒株大多是采用基因工程技術(shù)敲除其毒力基因構(gòu)建的，目前研究較多的ASFV毒力相關(guān)基因有MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、CD2v、9GL、DP148R、UK、TK和NS-L等。CD2v(也稱EP402R)基因編碼ASFV血凝素。Monteagudo等[7]以強(qiáng)毒力BA71毒株為親本毒株，敲除CD2v后構(gòu)建BA71ΔCD2，在COS-1細(xì)胞上連續(xù)傳20代，收獲上清制備疫苗，其免疫原性和保護(hù)效果與用豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophage，PAM)培養(yǎng)所制備的疫苗無明顯差異；BA71ΔCD2制備的疫苗接種6～8周齡試驗(yàn)豬，不僅可以抵抗致死量BA71的攻擊，還可抵抗致死量異源毒株E75(也是I型)的攻擊，推斷出這種交叉保護(hù)與BA71ΔCD2引起的可同時(shí)識(shí)別BA71和E75病毒的CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)。然而，不是所有缺失CD2v基因的ASFV制備的疫苗都能達(dá)到良好的免疫效果。Borca等[8]將缺失CD2v基因的ASFV Georgia 2010毒株接種外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，半數(shù)血球吸附量(50% hemadsorbing doses，HAD50)試驗(yàn)未出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，但以102～104TCID50/mL的劑量鼻腔接種試驗(yàn)豬與親本毒株試驗(yàn)豬表現(xiàn)出相似的病毒血癥和臨床癥狀，表明敲除CD2v基因只能稍微減弱ASFV Georgia 2010毒株的毒力。Chen等[9]構(gòu)建了多基因家族MGF360-505R、CD2v和MGF360-505R聯(lián)合缺失的重組病毒，在PAM上制備和純化后，接種7周齡SPF豬，并用親本毒株HLJ/2018進(jìn)行攻毒，結(jié)果以103和105TCID50/mL的HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD(以HLJ/18為骨架構(gòu)建的6基因缺失株和7基因缺失株)免疫的試驗(yàn)豬均能存活，并可抵抗200個(gè)豬半數(shù)致死劑量(PLD50)HLJ/18的攻擊。此外，將HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD兩個(gè)重組病毒分別在豬體內(nèi)連續(xù)傳5代，結(jié)果，HLJ/18-6GD傳至第4代時(shí)在豬體內(nèi)復(fù)制能力增強(qiáng)，其中1頭豬在第5次傳代后11 d死亡，提示病毒毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)較高；而HLJ/18-7GD則比較安全，將HLJ/18-7GD接種妊娠母豬后未使母豬產(chǎn)生明顯的繁殖障礙，安全性試驗(yàn)和毒力性試驗(yàn)結(jié)果均表明HLJ/18-7GD具有作為ASFV疫苗候選株的可行性，目前該重組疫苗正在進(jìn)行商品育肥豬的臨床試驗(yàn)，不同劑量接種組免疫保護(hù)率均在80%以上。

Zsak等[10]用強(qiáng)毒力毒株E70和2株Vero細(xì)胞適應(yīng)的ASFV毒株(MS16和BA71V)感染PAM，結(jié)果顯示E70可以在PAM上復(fù)制，在感染后48 h病毒滴度可達(dá)107TCID50/mL，而MS16和BA71V感染后檢測(cè)不到病毒滴度，但這2種毒株在Vero細(xì)胞上可以正常復(fù)制，基因序列分析顯示，MS16 和 BA71V2這2種病毒缺乏MGF360和MGF530基因，表明這2種基因可促進(jìn)病毒在巨噬細(xì)胞中繁殖，在決定病毒宿主范圍中起關(guān)鍵作用。Reis等[11]以Benin 97/1為骨架，構(gòu)建可以調(diào)節(jié)I型干擾素(IFN)的MGF360和MGF530/505雙基因缺失的重組病毒Benin△MGF，免疫試驗(yàn)豬后用致死量Benin 97/1攻擊，結(jié)果所有試驗(yàn)豬均在接種5～6 d后出現(xiàn)一過性發(fā)熱，無任何其他臨床癥狀，而OURT88/3毒株同樣缺失這2種基因接種試驗(yàn)豬后，有3/4的豬產(chǎn)生攻毒保護(hù)，表明不同分離株缺失MGF360和MGF530/505這2種基因后的效果不同。另外，Benin△MGF接種試驗(yàn)豬5～7 d后血清中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量增多，而接種OURT88/3后相應(yīng)細(xì)胞數(shù)量增多不明顯，因此，推測(cè)保護(hù)性免疫反應(yīng)可能與誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)不同有關(guān)。

另外，也有將ASFV的DP148R、TK、NS-L基因缺失構(gòu)建重組病毒的報(bào)道。DP148R是ASFV感染早期轉(zhuǎn)錄的基因，Reis等[12]將ASFV強(qiáng)毒株 Benin 97/1敲除DP148R基因構(gòu)建重組病毒接種豬骨髓細(xì)胞(Porcine bone marrow cell，PBM)，并于接種后24、48、72 h和96 h取樣檢測(cè)病毒滴度，發(fā)現(xiàn)Benin△DP148R與Benin 97/1表現(xiàn)出幾乎相同的生長(zhǎng)曲線，Benin△DP148R在接種后24～48 h病毒滴度可達(dá)106TCID50/mL，重組病毒在豬巨噬細(xì)胞上的復(fù)制能力沒有明顯降低。然而，Benin△DP148R對(duì)豬的致病力卻明顯降低，Benin△DP148R接種的所有豬全部存活，表明DP148R雖不是病毒復(fù)制必需基因，但在宿主的免疫防護(hù)中起關(guān)鍵作用。ASFV在感染細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制并合成病毒DNA復(fù)制所需要的各種酶基因，如胸腺激酶基因(TK基因)。Moore等[13]將ASFV Malawi毒株的TK基因敲除后制備重組病毒，重組病毒在Vero細(xì)胞上生長(zhǎng)良好但在豬巨噬細(xì)胞上的生長(zhǎng)受到抑制，接種重組病毒的試驗(yàn)豬只出現(xiàn)短暫的發(fā)熱和較低的死亡率，重組病毒對(duì)豬的致病力降低，再用親本毒株攻擊試驗(yàn)豬未出現(xiàn)ASFV典型癥狀，表明TK基因是ASFV在豬巨噬細(xì)胞復(fù)制的必需基因，也是ASFV的毒力基因。Zsak等[14]以ASFV E70毒株為骨架，缺失高度保守的NL-S基因構(gòu)建重組病毒，結(jié)果NL-S基因的缺失并未影響重組病毒在豬巨噬細(xì)胞或Vero細(xì)胞上的復(fù)制，但對(duì)豬的致病力卻明顯降低，表明NL-S基因是ASFV復(fù)制的非必需基因，也是ASFV的毒力基因。

ASFV有24種基因型，基因組龐大且大部分功能未知，據(jù)目前研究結(jié)果可以看出，影響病毒毒力的基因不止一種，不同毒株即使缺失相同的毒力基因產(chǎn)生的致病效果也可能不同，因此，構(gòu)建多基因缺失的重組病毒也許是開發(fā)活疫苗候選毒株比較好的選擇。

2 ASFV適應(yīng)細(xì)胞的研究進(jìn)展

目前，ASFV活疫苗制備和商業(yè)化生產(chǎn)的主要問題是缺乏支持重組病毒復(fù)制并保持良好免疫原性的細(xì)胞系。單核巨噬細(xì)胞、包括肺泡巨噬細(xì)胞在內(nèi)的組織巨噬細(xì)胞和豬骨髓細(xì)胞是ASFV感染豬的主要靶細(xì)胞，它們?cè)诳乖岢省⒓?xì)胞因子分泌和吞噬過程的免疫反應(yīng)中起重要作用[15-16]。King等[17]將ASFV弱毒株OURT/88/3在豬骨髓巨噬細(xì)胞中培養(yǎng)，Gallardo等[18]將NH/68毒株在PAM細(xì)胞中培養(yǎng)，兩者均可對(duì)異源強(qiáng)毒株UG65的攻擊產(chǎn)生100%保護(hù)。Genovesi等[19]在豬骨髓細(xì)胞和血液?jiǎn)魏?巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入鼠源集落刺激因子(CSF-1)，可使具有典型單核巨噬細(xì)胞形態(tài)和功能的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，加入CSF-1的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在接種ASFV后的病毒滴度和細(xì)胞病變?cè)鰪?qiáng)，表明CSF-1可增加ASFV對(duì)細(xì)胞的敏感性，并延長(zhǎng)細(xì)胞在體外的存活時(shí)間。

雖然用豬的原代細(xì)胞PBMC或PAM接種ASFV重組病毒與自然感染途徑非常相似，有利于研究ASFV和宿主細(xì)胞之間關(guān)系，但這些細(xì)胞制備繁瑣、批次間差異大、從動(dòng)物中提取細(xì)胞成本高，限制了疫苗抗原的規(guī)模化量產(chǎn)。為此，研究學(xué)者曾嘗試用已建立的細(xì)胞系培養(yǎng)ASFV。Krug等[20]將ASFV Georgia07毒株在Vero細(xì)胞上傳110代后，病毒在家豬體內(nèi)的復(fù)制能力喪失。Balysheva等[21]發(fā)現(xiàn)，ASFV的Stavropol 01/08毒株在A4C2/9K細(xì)胞中繁殖33代后喪失了致病性。Gallardo等[18]和Sánchez等[22]將弱毒株NH/P68在COS-7細(xì)胞上培養(yǎng)后，其對(duì)試驗(yàn)豬的免疫保護(hù)力降低至33%，但在野豬肺(Wild boar lung，WSL)細(xì)胞上傳代后仍可感染豬并在豬體內(nèi)繁殖。Krug等[20]將豬脾臟中分離的ASFV-G毒株在Vero細(xì)胞上傳110代，比較ASFV-G毒株與細(xì)胞適應(yīng)毒株在Vero細(xì)胞和豬巨噬細(xì)胞上的繁殖能力，結(jié)果顯示，隨著傳代次數(shù)的增加，ASFV-G對(duì)Vero細(xì)胞的適應(yīng)能力逐漸增強(qiáng)，病毒滴度可達(dá)107TCID50/mL以上，相反，在豬巨噬細(xì)胞上的繁殖能力下降，至第110代毒株的毒力完全喪失，而用細(xì)胞適應(yīng)毒株免疫試驗(yàn)豬后不能保護(hù)ASFV-G的攻擊；基因序列分析顯示，ASFV對(duì)PAM細(xì)胞感染力的喪失可能是由于在Vero細(xì)胞傳代過程中缺失了MGF360和MGF505基因所致。Carrascosa等[23]對(duì)ASFV在肺泡細(xì)胞、單核細(xì)胞和Vero細(xì)胞中的產(chǎn)量進(jìn)行了比較，得出采用單層培養(yǎng)時(shí)，PBMC或者PAM感染ASFV后產(chǎn)生的病毒粒子要比感染Vero細(xì)胞高出10倍；未經(jīng)任何處理的懸浮培養(yǎng)的PAM細(xì)胞比卡介苗(BCG)處理過的細(xì)胞所產(chǎn)病毒粒子量略少，但相差不多；雖懸浮培養(yǎng)的PAM細(xì)胞比貼壁方式產(chǎn)生的病毒粒子略少，但相比單層培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)更簡(jiǎn)便，更容易獲得大量細(xì)胞；此外，PBMC比PAM雖產(chǎn)生稍多的病毒粒子，但PBMC不容易獲得。因此，PAM的懸浮培養(yǎng)也許是可進(jìn)行ASFV規(guī)模化放大培養(yǎng)的良好系統(tǒng)。值得關(guān)注的是，近期，日本學(xué)者M(jìn)asujin等[24]在豬原代腎巨噬細(xì)胞中利用慢病毒載體引入SV40T基因和豬端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因，建立了永生化的豬腎巨噬細(xì)胞系(Immortalized porcine kidney macrophages，IPKM)，結(jié)果顯示，IPKM細(xì)胞系對(duì)ASFV強(qiáng)毒力毒株Armenia07、Kenya05/Tk-1和Espana75以及人工致弱毒株Lisbon60V均易感，且可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，推測(cè)IPKM也許可感染各種毒力和基因型的ASFV分離株。Portugal等[25]開發(fā)的豬巨噬細(xì)胞系(Zuckermann macrophage-4，ZMAC-4)對(duì)多種ASFV野毒分離株易感，ASFV致弱毒OURT88/3在ZMAC-4細(xì)胞上具有與在豬原代骨髓細(xì)胞上相似的感染動(dòng)力學(xué)曲線和病毒滴度，且OURT88/3病毒在ZMAC-4細(xì)胞上傳12代不改變?cè)摱局甑拿庖咴裕虼?，ZMAC-4細(xì)胞可能是研究ASFV繁殖的良好選擇。

綜上，采用現(xiàn)有猴源腎細(xì)胞系如Vero、COS-1、COS-7等培養(yǎng)ASFV或其重組病毒，雖操作簡(jiǎn)便，容易規(guī)?；囵B(yǎng)，但就目前研究結(jié)果看，傳代容易引起某些基因缺失和移碼突變，進(jìn)而導(dǎo)致病毒復(fù)制力或免疫原性改變。而豬源原代細(xì)胞(如PAM、PBMC和PBM等)雖容易培養(yǎng)各種ASFV分離株和重組病毒，并能保持病毒的免疫原性，但制備繁瑣、批次間差異大、不易規(guī)?；囵B(yǎng)，同時(shí)還涉及到動(dòng)物福利，也限制了其規(guī)?；慨a(chǎn)。對(duì)于新開發(fā)的IPKM和ZMAC-4細(xì)胞及其他正在研究中的細(xì)胞系，需持續(xù)關(guān)注和進(jìn)一步探究其作為病毒復(fù)制候選載體的可行性。

3 展望

非洲豬瘟為我國(guó)一類動(dòng)物疫病，非洲豬瘟相關(guān)疫苗研究工作必須在P3及以上生物安全等級(jí)實(shí)驗(yàn)室獲批開展，而目前包括我國(guó)在內(nèi)的其他國(guó)家均未見批準(zhǔn)上市銷售使用的非洲豬瘟疫苗。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)局專家強(qiáng)調(diào)，所謂“非洲豬瘟中試苗、自家苗，甚至走私苗”，沒有通過科學(xué)、客觀、嚴(yán)格的評(píng)審評(píng)價(jià)，其安全性和有效性都無法保證，特別是活疫苗，更可能存在不可預(yù)知的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，違規(guī)使用不僅控制不了非洲豬瘟疫情，反而會(huì)造成病毒擴(kuò)散，擴(kuò)大病毒污染面，進(jìn)而干擾非洲豬瘟防控工作。因此，在當(dāng)前形勢(shì)下，養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)加強(qiáng)豬場(chǎng)的生物安全防護(hù)水平，提高自主防護(hù)意識(shí)，是最現(xiàn)實(shí)且最經(jīng)濟(jì)有效的選擇。當(dāng)然，我們也希望安全性更高、免疫效果確實(shí)的非洲豬瘟疫苗能夠盡早批準(zhǔn)上市，造福養(yǎng)殖業(yè)。