東北林蛙源致病性嗜水氣單胞菌的分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)

孟 欣 ， 孫大慶 ， 康元環(huán) ， 張冬星 ， 單曉楓 ， 錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

東北林蛙(Ranadybowskii) 是蛙科、林蛙屬無尾兩棲動(dòng)物，主要分布于我國東北地區(qū)和內(nèi)蒙古東北部，其具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值，是我國重要的野生藥用動(dòng)物[1]。由于大量的人為捕殺、自然生態(tài)的破壞、外來物種的侵入等外界因素影響[2]，導(dǎo)致野生東北林蛙的數(shù)量驟減，其已經(jīng)被列入《世界瀕危動(dòng)物紅皮書》二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，為易危(V)物種[3]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)隸屬于氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、氣單胞菌屬，廣泛存在于淡水、污水和土壤中[4]，可誘發(fā)恒溫動(dòng)物、變溫動(dòng)物的全身性疾病，是一種典型的人—畜—魚共患的致病菌[5-6]。因其可在多種水體以及水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)寄生，可引起蛙類致病甚至死亡，給蛙類人工養(yǎng)殖業(yè)和野生蛙類的生存均造成了嚴(yán)重的威脅，引起了眾多國內(nèi)外學(xué)者的高度重視[7-8]。嗜水氣單胞菌能夠引起以蛙紅腿和皮膚潰爛壞死為特征的細(xì)菌性傳染病，常可引起急性出血性敗血癥等，病程短，傳播能力強(qiáng)，近年來此類病例正在以驚人的速度增多，造成了極高的死亡率[9-11]。本試驗(yàn)對(duì)從吉林市某林蛙養(yǎng)殖場(chǎng)患病的東北林蛙臟器中分離純化出的病原菌進(jìn)行培養(yǎng)與鑒定，并對(duì)其致病性和耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，以期為東北林蛙的疾病防控與嗜水氣單胞菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 患病林蛙和健康林蛙，均購自吉林市某林蛙養(yǎng)殖場(chǎng)；斑馬魚，購自長(zhǎng)春某花鳥魚市場(chǎng)。

1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(杭州天和生物試劑有限公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(長(zhǎng)春飛凱生物有限公司)；藥敏紙片(杭州濱河微生物試劑有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離培養(yǎng) 觀察病蛙體表以及大腿根部等出現(xiàn)病灶的部位，無菌操作取其病料在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)；同時(shí)對(duì)病蛙麻醉后在無菌條件下進(jìn)行剖檢，采集病蛙的肝臟、腎臟、脾臟和心臟，充分研磨制成混懸液，接種于LB培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)18 h。挑取不同顏色、形態(tài)、大小的優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。培養(yǎng)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)菌溶血活性檢測(cè) 將LB平板中的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行純化后，接種至哥倫比亞羊血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察溶血圈，用毫米尺測(cè)量溶血圈的直徑，評(píng)價(jià)各優(yōu)勢(shì)菌群的溶血活性。

1.3.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 選擇具有溶血活性的菌株用PBS稀釋至相同濃度1×108CFU/mL，選擇健康林蛙作為試驗(yàn)動(dòng)物，腹腔注射稀釋菌液(100 μL/只)，連續(xù)觀察7 d，記錄死亡情況，對(duì)菌株致病性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 斑馬魚半數(shù)致死濃度(LD50)測(cè)定 將分離的溶血活性及致病性兼有的菌株接種于LB培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)24 h，用PBS進(jìn)行稀釋，稀釋濃度依次為1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10 CFU/mL和1 CFU/mL。選擇斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，按照菌液稀釋梯度數(shù)將健康斑馬魚分為7個(gè)濃度組，每組10尾，以0.2 mL/尾的劑量對(duì)斑馬魚進(jìn)行腹腔注射。每天觀察各組魚的發(fā)病情況和死亡情況，并進(jìn)行記錄，計(jì)算菌株的LD50。

1.3.5 生理生化鑒定 將分離到的病原菌純培養(yǎng)物分別接種至生化反應(yīng)管內(nèi)，30 ℃溫箱中孵育12～24 h。根據(jù)說明書進(jìn)行結(jié)果對(duì)比，進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.6 分子生物學(xué)鑒定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，離心收集菌體，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書操作，提取細(xì)菌的總DNA。利用PCR對(duì)菌株的16S rDNA基因與gyrB管家基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，出現(xiàn)預(yù)期目的條帶后，按照試劑盒說明書進(jìn)行膠回收，純化后送至長(zhǎng)春庫美生物測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。將分離菌株的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列經(jīng)NCBI中的BLSAT檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析后，選取對(duì)比匹配度較高的幾組基因，利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.7 毒力基因檢測(cè) 以分離菌株DNA為模板，采用PCR方法對(duì)氣溶素(aer)、細(xì)胞毒性腸毒素(act)、黏附素(Aha)、核酸酶(exu)、絲氨酸蛋白酶(ser)、脂肪酶(Lip)、密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控基因(LuxS)這7種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，引物信息見表1。

1.3.8 藥敏試驗(yàn) 采用改良K-B紙片擴(kuò)散法，取20 μL純化后的分離菌株，用接種環(huán)在培養(yǎng)基中均勻涂布，將制備好的藥敏片分別按標(biāo)記好的位置緊貼在培養(yǎng)基的表面。將培養(yǎng)皿放置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)8～12 h后，觀察其抑菌圈的直徑(mm)，以抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)，判斷病原菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 分離優(yōu)勢(shì)菌株 觀察病蛙體表并無明顯病灶，但上肢及大腿根部出現(xiàn)了損傷以及不同程度的腫大現(xiàn)象。無菌條件下對(duì)病蛙進(jìn)行剖檢，使用接種環(huán)劃線分離培養(yǎng)臟器中的病原菌。挑選形態(tài)不同的優(yōu)勢(shì)菌株接種于培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，結(jié)果得到5株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，分別命名為R1、R2、R3、R4和R5。

2.2 細(xì)菌溶血活性檢測(cè) 對(duì)R1～R5菌株進(jìn)行溶血活性檢測(cè)，測(cè)量其溶血圈的直徑，結(jié)果顯示：R1、R2菌株并無溶血活性；R3、R4、R5菌株均出現(xiàn)了溶血環(huán)，表明R3、R4、R5菌株均具有溶血活性。

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 使用PBS將R3、R4、R5三株細(xì)菌的菌落數(shù)統(tǒng)一調(diào)至1×108CFU /mL，以100 μL/只的注射量對(duì)健康林蛙進(jìn)行腹腔注射。結(jié)果顯示，只有注射R5菌株的林蛙出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象，注射R1～R4菌株的林蛙均未出現(xiàn)死亡。根據(jù)回歸試驗(yàn)結(jié)果，可以初步證明R5菌株具有較強(qiáng)致病性。

2.4 斑馬魚LD50測(cè)定 通過人工感染斑馬魚發(fā)現(xiàn)，注射1×106CFU/mL R5菌液的斑馬魚組在第1天就出現(xiàn)了死亡情況，并出現(xiàn)了明顯的行動(dòng)緩慢、精神不振的現(xiàn)象，第2天死亡4尾，1周內(nèi)死亡率達(dá)到80%。經(jīng)計(jì)算，R5菌株對(duì)于斑馬魚的LD50達(dá)到1.26×103CFU，說明R5菌株具有較強(qiáng)的致病性。

2.5 生理生化鑒定 結(jié)果如表2所示，R5菌株可分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；可分解賴氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧酶；可利用葡萄糖、阿拉伯糖等；不利用明膠、山梨醇等。符合嗜水氣單胞菌生理生化特征，判定分離菌為嗜水氣單胞菌。

表2 生化反應(yīng)結(jié)果Table 2 Biochemical reaction results

2.6 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)R5菌株的16S rDNA和gyrB基因進(jìn)行PCR鑒定，測(cè)序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果如圖1和圖2所示，分離菌R5與嗜水氣單胞菌(GenBank登錄號(hào)：CP046954.1)的同源性高達(dá)98%。結(jié)果表明R5菌株與嗜水氣單胞菌親緣關(guān)系最近。綜合生化反應(yīng)和分子水平鑒定結(jié)果，確定R5菌株為嗜水氣單胞菌。

圖1 R5菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA of R5 strain▲：本試驗(yàn)分離的菌株；下同▲：Strain isolated in this experiment. The same as below

圖2 R5菌株gyrB系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of gyrB of R5 strain

2.7 毒力基因檢測(cè) PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，R5菌株攜帶6種毒力因子，分別是Lip、act、aer、ser、LuxS和Aha，大小分別為247、232、431、128、369 bp和1 082 bp。

圖3 毒力基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of virulence genesM：DL2 000 DNA Marker; 1：Lip; 2：act; 3：aer;4：exu; 5：ser; 6：LuxS; 7：Aha

2.8 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，R5菌株對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、頭孢拉啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、復(fù)方新諾明敏感；對(duì)丁胺卡那、氯霉素中介；對(duì)氨芐西林具有耐藥性。

表3 分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)Table 3 Antibiotic sensitivity test of the isolated strains

3 討論

嗜水氣單胞菌是淡水養(yǎng)殖類動(dòng)物暴發(fā)性傳染病的主要病原菌之一，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，此前即有水生動(dòng)物感染嗜水氣單胞菌的病例報(bào)道[12-13]。由于嗜水氣單胞菌的生存條件與蛙類的生活環(huán)境極為相似，所以其對(duì)蛙類是一種致病力強(qiáng)大的致病菌，主要導(dǎo)致蛙類的皮膚潰爛以及紅腿病，進(jìn)而導(dǎo)致敗血癥等疾病[14-15]。東北林蛙作為典型的陸生蛙類，在水中繁殖后再登陸入林，其生活環(huán)境不僅復(fù)雜并且對(duì)飼養(yǎng)要求高，極易受到外界環(huán)境的影響。由于兩棲動(dòng)物的特殊習(xí)性，相較于其他動(dòng)物更易出現(xiàn)群體間的疾病傳播，所以對(duì)于其疾病的防控不容小覷[16]。Huys等從出現(xiàn)出血性敗血癥的虎紋蛙體內(nèi)分離出1株嗜水氣單胞菌，說明嗜水氣單胞菌易使蛙類感染致病，蛙類是該菌的主要宿主之一[17]。林蛙?；嫉募膊〈蟛糠志哂袀魅拘?，但針對(duì)林蛙的特效治療藥甚少，所以應(yīng)重視林蛙的疾病防控，要做到最大程度上減少林蛙染病概率，制定多種疾病治療方案，才能有效提高林蛙人工養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[18]。

本試驗(yàn)從吉林市養(yǎng)殖場(chǎng)患病林蛙體內(nèi)分離到5株優(yōu)勢(shì)菌株，通過溶血活性檢測(cè)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)分別檢測(cè)其致病性，結(jié)果顯示菌株R5對(duì)于東北林蛙具有較強(qiáng)的致病性，結(jié)合生理生化鑒定初步確定該菌株為嗜水氣單胞菌。由于不同來源的嗜水氣單胞菌具有不同的理化特性，所以有必要在生化鑒定的基礎(chǔ)上進(jìn)行16S rDNA基因序列的分析鑒定[19]。目前，公認(rèn)16S rDNA基因檢測(cè)技術(shù)可對(duì)微生物進(jìn)行快速、精準(zhǔn)的鑒定分析，是常用于鑒定病原菌的檢測(cè)方法之一，但由于該方法具有高度保守性，使其對(duì)于相似度很高的同屬物種的分辨能力較弱[20-21]。RNA聚合酶基因gyrB，與16S rDNA基因相比具有較高的替換率，在以核苷酸序列為基礎(chǔ)的細(xì)菌類別鑒定中可作為靶分子，有助于更加準(zhǔn)確地確定種屬分類以及新物種的發(fā)現(xiàn)，可更準(zhǔn)確地區(qū)分同源性較高的親緣物種[22-24]。因此，本試驗(yàn)選取構(gòu)建16S rDNA基因和gyrB管家基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)菌株R5進(jìn)行后續(xù)的分子水平鑒定。結(jié)果顯示，R5菌株16S rDNA和gyrB基因序列與嗜水氣單胞菌(GenBank登錄號(hào)：CP046954.1)的同源性高達(dá)98%，進(jìn)一步確定嗜水氣單胞菌是引起該養(yǎng)殖場(chǎng)東北林蛙患病的病原菌。

動(dòng)物回歸試驗(yàn)和斑馬魚LD50測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)人工感染純化后的R5菌株，可使東北林蛙和斑馬魚在短時(shí)間內(nèi)死亡，證明該菌具有較強(qiáng)的致病性。嗜水氣單胞菌與其他病原微生物的致病過程基本一致，大致分為黏附、入侵、定植、增殖、產(chǎn)生毒素，其利用不同毒力因子調(diào)節(jié)自身的基因，從而來適應(yīng)不同的要求[25]。一般認(rèn)為，嗜水氣單胞菌致病作用與其攜帶的多種毒力因子(外毒素、胞外蛋白酶、黏附素)密切相關(guān)，可能是多功能和多因子相互協(xié)同作用的結(jié)果，毒力基因分布不同的菌株，致病性也存在一定的差異[26-28]。本試驗(yàn)毒力因子檢測(cè)結(jié)果顯示，R5菌株可攜帶Lip、act、aer、ser、LuxS、Aha這6種毒力因子。嗜水氣單胞菌所產(chǎn)生的氣溶素和細(xì)胞毒性腸毒素，已被確定為主要的致病因子[29-30]，二者為典型的外毒素，具有腸毒性、溶血活性、細(xì)胞毒性等生物學(xué)特性，與動(dòng)物出血病和敗血癥有關(guān)。氣溶素作為一種水溶性蛋白質(zhì)，可在細(xì)胞表面形成具有通道孔的七聚體，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，表現(xiàn)出血癥狀[31]，與本試驗(yàn)林蛙體表出現(xiàn)紅腫的結(jié)果一致。絲氨酸蛋白酶廣泛存在于原核和真核細(xì)胞中，可以參與菌體的一些生化反應(yīng)，進(jìn)而影響菌株的毒力。研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶的表達(dá)與氣溶素的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系[32-33]。LuxS基因可以促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，進(jìn)而影響?zhàn)じ侥芰σ约叭苎钚?，使?xì)菌的感染能力增強(qiáng)[34]。脂肪酶在激活氣單胞菌的氣溶素活性、增強(qiáng)細(xì)菌在宿主細(xì)胞中黏附能力等方面均具有重要作用[35]。當(dāng)嗜水氣單胞菌侵襲機(jī)體時(shí)，其會(huì)在體內(nèi)快速、大量繁殖，所產(chǎn)生的毒力因子單獨(dú)或協(xié)同作用，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)細(xì)胞破壞，從而導(dǎo)致機(jī)體抵抗力降低，出現(xiàn)出血、敗血等病癥，嚴(yán)重時(shí)可引起死亡[36]。因此，進(jìn)一步研究嗜水氣單胞菌的致病機(jī)制對(duì)于該菌的防治具有重要的意義。

目前關(guān)于嗜水氣單胞菌疫苗的研究已經(jīng)有了顯著的進(jìn)展，但由于制作成本以及技術(shù)等方面的原因，在水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治中，傳統(tǒng)藥物和抗菌藥物依舊是常用的方法之一[37]。王闖等的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，東北林蛙源嗜水氣單胞菌對(duì)氟喹諾酮類、氨基糖苷類抗菌藥以及部分頭孢類藥物敏感[38]，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，可見東北林蛙感染嗜水氣單胞菌可使用慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢拉啶等藥物嘗試治療。但菌株R5對(duì)于氨芐西林耐藥，說明此次引發(fā)東北林蛙致病的病原菌具有較高的耐藥性，可能與曾長(zhǎng)期使用或不科學(xué)使用抗菌藥，導(dǎo)致該病原菌株產(chǎn)生多重耐藥性相關(guān)。由于近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中濫用抗菌藥的現(xiàn)象層見迭出，其所導(dǎo)致的水環(huán)境污染以及大量耐藥菌株的產(chǎn)生成為了科研人員與養(yǎng)殖戶所要面臨的嚴(yán)峻問題[39]。所以在養(yǎng)殖過程中要有針對(duì)性地選擇敏感性藥物，并交替使用不同類別的抗菌藥物，盡可能避免抗藥菌株的產(chǎn)生。利用抗菌藥對(duì)感染嗜水氣單胞菌的蛙類進(jìn)行治療只是權(quán)宜之計(jì)，嗜水氣單胞菌的防治仍需不斷地進(jìn)行探索和改進(jìn)，需要“以防為主，防治結(jié)合”的綜合防治方法[40]。尋找替代抗菌藥物的相關(guān)研究也成為了當(dāng)下水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)動(dòng)物疾病防治的重要研究方向，這也對(duì)我國綠色健康的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的形成有著重大的意義。