微管親和調(diào)節(jié)激酶4的生理功能及其在心血管疾病中的研究進展

于莉莉，尚莎莎，周 陽，關(guān)懷敏，陳玉善

1 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450000；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450008

心血管疾病是全球范圍內(nèi)首要致死因素，雖然人類在預(yù)防和治療心血管疾病方面取得了巨大的進步，但缺乏對其發(fā)生機制的全面了解仍是心血管疾病全球發(fā)病率和死亡率高居不下的主要原因[1]。受損的微管和線粒體是心肌細胞和內(nèi)皮功能障礙發(fā)病的關(guān)鍵因素[2]。有研究者發(fā)現(xiàn)微管親和調(diào)節(jié)激酶4(microtubule affinity-regulating kinase 4，MARK4)參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、炎癥、細胞周期進展和增殖、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激[3-4]，可導(dǎo)致心肌細胞和內(nèi)皮細胞功能障礙，影響心血管功能。因此全面了解MARK4的生理功能和作用機制至關(guān)重要，可能是治療心血管疾病的新思路。本文通過對MARK4的結(jié)構(gòu)、生理功能及其與心血管疾病相關(guān)性進行綜述，討論一種新的心血管疾病干預(yù)靶點。

1 MARK4的生理功能

1.1 MARK4的結(jié)構(gòu)和激活 MARK4是細胞微管相關(guān)蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(microtubule associated proteins，MAPs)家族的一員，由752個氨基酸殘基組成，分子量約85 kU[5]。MARK4的酶核心是典型的“銀杏葉”狀折疊的催化結(jié)構(gòu)域，沿著結(jié)構(gòu)域表面延伸的接頭序列通過疏水鍵與N末端的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-associated domains，UBA)相連，UBA通過間隔結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)合基序1(kinase-associated domain 1，KA1)的C端相連。大部分的N端由β-鏈組成，只有1個α-螺旋(αC-螺旋)，而C端由6個α-螺旋和1個延伸的環(huán)組成，稱為激活片段，αC-螺旋和活化片段是MARK4激酶核心最重要的部分[6]。MARK4在細胞中屬于結(jié)構(gòu)性激活，主要通過絲氨酸(serine，Ser)/蘇氨酸(threonine，Thr)磷酸化實現(xiàn)。MARK4可以控制其底物進入活化環(huán)發(fā)生磷酸化而被激活，在Thr214磷酸化后，激活結(jié)構(gòu)開始了一系列重排，形成保守且穩(wěn)定的活性構(gòu)象[7-8]。

1.2 MARK4與NLRP3炎癥小體 MARK4與NLRP3在巨噬細胞中共表達，并以微管依賴的方式參與調(diào)節(jié)NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)炎癥小體的定位和激活，NLRP3炎癥小體的激活促進動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)展[9]。MARK4將NLRP3傳遞到微管組織中心，NLRP3在活細胞中沿微管轉(zhuǎn)運，定位到特征斑點結(jié)構(gòu)，形成特定的炎癥體復(fù)合物，促進NLRP3炎癥小體向線粒體募集并激活，通過Toll樣受體和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factorκB，NF-κB)途徑啟動炎癥因子[10-11]。除微管依賴機制外，MARK4還通過調(diào)節(jié)C-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase，JNK)信號通路觸發(fā)NLRP3炎癥體的激活[12-13]。MARK4和NLRP3在AS病變中的表達與活性，可能與白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18的產(chǎn)生有關(guān)[11]。因此，探索MARK4對NLRP3炎癥小體的潛在機制對治療AS等心血管疾病意義重大。

1.3 MARK4與氧化應(yīng)激 研究發(fā)現(xiàn)，MARK4可以通過激活κB抑制蛋白激酶α(inhibitor kappa B kinase α，IKKα)/NF-κB信號通路促進線粒體氧化應(yīng)激和脂肪炎癥[3]。MARK4可以抑制細胞色素C(cytochrome C，CytC)的表達，通過增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的活性和降低抗氧化應(yīng)激相關(guān)的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性，降低膜電位和阻斷呼吸鏈從而損害線粒體氧化呼吸[14]。隨著炎癥因子IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1的升高，MARK4的表達水平和ROS的活性進一步升高，加重氧化應(yīng)激。大量研究表明NF-κB途徑相關(guān)炎癥在AS、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病中發(fā)揮重要作用，通過抑制MARK4減輕IKKα/NF-κB信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，這為心血管疾病分子機制的研究提供了新的思路。

1.4 MARK4與微管動力 MARK4的獨特之處在于它對心肌細胞微管結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)能力。MARK4可以磷酸化并識別其底物MAPs(包括軸突微管穩(wěn)定蛋白Tau、MAP2和MAP4)[15]。MARK4通過磷酸化MAP4，使人血管抑制蛋白(human vasohibin，VASH)進入微管，VASH2可與小分子血管抑制蛋白結(jié)合蛋白(small vasohibin binding protein，SVBP)結(jié)合形成復(fù)合物VASH2/SVBP，又稱為微管蛋白酪氨酸羧肽酶(tyrosine carboxypeptidase，TCP)[16-17]。TCP使VASH2與α-微管蛋白的C端尾部相互作用時發(fā)生去酪氨酸修飾，使微管結(jié)構(gòu)更緊密結(jié)合在心肌細胞的Z線上，限制心肌收縮[17-18]?？傊?，MARK4是通過磷酸化MAP4調(diào)節(jié)心肌細胞收縮力并控制VASH2對α-微管蛋白的去酪氨酸化來調(diào)節(jié)微管脫蛋白，導(dǎo)致MAP4在微管結(jié)構(gòu)上的讓位和脫落，使微管動力增加、細胞形狀改變[19-20]。此外，VASH1缺失會增加心肌細胞收縮和舒張的速度[21]。MARK4在心臟中表達增加會抑制心臟正常發(fā)揮功能，而MARK4缺失可能對心肌細胞功能具有良好的改善效果，使其更易收縮和舒張，為心肌梗死和心力衰竭患者帶來福音。MARK4特異性抑制劑的研發(fā)有望成為改善心肌收縮和舒張功能的新理念。

1.5 MARK4的其他功能 據(jù)報道，MARK4可以促進凋亡誘導(dǎo)因子與JNKs結(jié)合，激活JNKs/c-Jun信號通路，JNK1及激活蛋白1的磷酸化水平上調(diào)，阻斷抗凋亡基因的表達，磷酸化相關(guān)凋亡蛋白，導(dǎo)致線粒體功能障礙，促進細胞凋亡[22]。研究發(fā)現(xiàn)抑制JNK可減少心肌細胞的凋亡[22-23]，結(jié)合上述MARK4對細胞凋亡的調(diào)控作用，通過抑制MARK4抑制JNKs/c-Jun信號通路，可能是治療心肌細胞疾病的一種新方法。另外，Mark4缺失(Mark4-/-)小鼠的脂肪質(zhì)量含量、血液三酰甘油和膽固醇水平顯著降低，這些指標可通過其促炎和促凋亡特性誘導(dǎo)細胞線粒體功能障礙[5]。MARK4還可通過激活JNK1和抑制p38絲裂原活化蛋白激酶通路促進脂質(zhì)沉積和脂滴集聚[24]，脂質(zhì)沉積學(xué)說與高血壓、AS等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，通過抑制MARK4從而抑制脂質(zhì)積累可能是治療心血管疾病的新型藥物靶標。此外，Yang等[25]發(fā)現(xiàn)當細胞面臨“饑餓”或缺乏氨基酸時，MARK4可使單磷酸腺苷激活蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate [AMP]-activated protein kinase，AMPK)磷酸化，但抑制蛋白激酶B(protein kinase B，PKB；又稱AKT)磷酸化水平，通過激活A(yù)MPK途徑和抑制AKT/mTOR通路，可使mTOR復(fù)合物1(mTOR complex 1，mTORC1)從溶酶體中解離，促進血清饑餓誘導(dǎo)自噬[26-27]。自噬失調(diào)也與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，進一步挖掘MARK4調(diào)節(jié)自噬的心功能，將成為防治心血管疾病的潛在策略。雖然發(fā)現(xiàn)MARK4在參與體內(nèi)脂肪生成、細胞凋亡和自噬等相關(guān)過程，但現(xiàn)階段對MARK4在亞細胞定位和調(diào)控蛋白水平方面的了解仍然欠缺，探索其生理功能意義重大。對MARK4的全面了解會為防治心血管疾病指引新方向。

2 MARK4與心血管疾病

2.1 MARK4與動脈粥樣硬化 Clement等[11]為了評估MARK4在NLRP3炎癥體激活和AS形成中的作用，將低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)缺失的小鼠進行致命性輻射并用野生型和Mark4-/-小鼠骨髓細胞重建，給予高脂飲食9周后，發(fā)現(xiàn)Mark4-/-使粥樣斑塊顯著減小，斑塊泡沫細胞中IL-18和干擾素-γ(interferon γ，INF-γ)水平降低。此外，原代小鼠骨髓來源的巨噬細胞中Mark4-/-可阻止NLRP3炎癥體的激活，抑制Caspase1的激活并減少IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，參與不穩(wěn)定斑塊形成[28]，而MARK4與NLRP3在巨噬細胞中共表達，IL-1β和IL-18在AS巨噬細胞中高度表達，因此MARK4也促進AS斑塊的發(fā)展[29]。綜上，當MARK4高表達時，可激活NLRP3炎癥小體，通過上調(diào)INF-γ、IL-1β和IL-18在巨噬細胞中的表達水平，參與內(nèi)皮炎癥和不穩(wěn)定斑塊的形成過程，促進AS。而MARK4被抑制時，不穩(wěn)定斑塊的形成過程減緩或消失，這充分說明了MARK4在AS發(fā)生發(fā)展中的重要性。因此，把MARK4作為治療靶點，尋找其抑制劑阻斷NLRP3炎癥小體激活，將會成為限制AS和心血管并發(fā)癥發(fā)生的新理念，具有重要的醫(yī)學(xué)價值和科學(xué)意義。

2.2 MARK4與心肌缺血再灌注損傷 在一定時間內(nèi)解除冠脈梗阻，心肌血流恢復(fù)灌注后出現(xiàn)心肌損害、能量代謝和心電功能障礙加重的病理現(xiàn)象，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[30-31]。MARK4過表達可促進MIRI時缺氧/復(fù)氧刺激下ROS的產(chǎn)生和K+外流，激活NLRP3炎癥小體[32]。使線粒體損傷、促凋亡蛋白釋放、炎癥細胞浸潤，促進炎癥因子和趨化因子的釋放，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[33-34]。所以阻斷炎癥反應(yīng)，靶向調(diào)節(jié)MARK4可能是保護血管內(nèi)皮的有效方法。MARK4可與過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPARγ)相互作用，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[3]。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在MIRI過程中起關(guān)鍵作用，其炎癥因子水平與MIRI病情嚴重程度密切相關(guān)。基于抑制NLRP3炎癥體激活和促進PPARγ激活的治療策略研發(fā)MARK4抑制劑是改善MIRI和保護心臟的新途徑。

2.3 MARK4與缺血性心力衰竭 Yu等[35]為了評估MARK4在缺血性心臟病中的作用，使用左前降支冠狀動脈結(jié)扎(ligation of left anterior descending coronary artery，LAD)的小鼠模型，誘導(dǎo)大范圍心肌梗死。使用心肌細胞特異性敲除Mark4小鼠，發(fā)現(xiàn)Mark4-/-小鼠的左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)與第1天的同窩對照組小鼠相比，提高了56.8%(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明Mark4-/-在心肌梗死后的心功能調(diào)節(jié)中具有保護作用。接著從野生型小鼠和Mark4-/-的小鼠中分離出原代心肌細胞，進行單細胞收縮實驗，野生型小鼠心肌梗死后心肌細胞收縮減少、舒張速度較慢；而進行LAD手術(shù)的Mark4-/-小鼠則具有相反效應(yīng)，表明Mark4-/-改善心肌梗死后心肌細胞的收縮和舒張功能。MARK4調(diào)節(jié)缺血性心臟病中的微管去酪氨酸化，是調(diào)節(jié)心肌細胞收縮舒張的重要機制。微管化干擾心臟衰竭時心肌細胞的收縮功能，MARK4通過靶向控制缺血心臟中微管的去纖維化改變心肌細胞收縮力以改善心臟功能[36]。但Mark4-/-對心梗后心功能的保護作用有無不良反應(yīng)、是否能夠長期保持尚未可知，抑制MARK4能否改善非缺血性心力衰竭的心肌收縮功能需進一步探究。

3 MARK4在心血管疾病中的潛在抑制劑

MARK4具有結(jié)構(gòu)和化學(xué)多樣性，研究者通過高通量篩選或基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計來辨別具有結(jié)合親和力的分子，找到潛在靶標?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一些化合物和抑制因子具有抗氧化和抗炎活性，其潛在抑制劑已被用作藥物發(fā)現(xiàn)的先導(dǎo)。

Parveen等[37]通過光介導(dǎo)的氧化偶聯(lián)反應(yīng)使用2雜芳基色酮和苯胺形成碳-氮鍵合成新的3-N-芳基取代-2-雜芳基色酮，它可誘導(dǎo)細胞凋亡和降低Tau磷酸化，對MARK4表現(xiàn)出優(yōu)異的體外抑制作用。Manea等[38]和Sun等[39]證明了組蛋白去乙酰化酶抑制劑亞過氧基苯胺羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)通過下調(diào)MARK4表達抑制NF-κB介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，表明SAHA是MARK4/NF-κB信號通路的上游抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ是MARK4的一種新的轉(zhuǎn)錄抑制因子，它通過與MARK4啟動子區(qū)結(jié)合阻斷氧化應(yīng)激和炎癥[3]。首次證實SET8抑制MARK4/NLRP3炎癥體通路的激活，泛素特異性肽酶17樣家族成員通過穩(wěn)定SET8蛋白防止細胞衰老[40]。隨著對MARK4的研究，其潛在抑制劑不斷被發(fā)現(xiàn)，它們在癌癥、神經(jīng)退行性變和代謝性疾病的治療中效果顯著，在心血管疾病中也發(fā)揮一定效果，但在心血管疾病中并不具有特異性和高效性。即便開發(fā)小分子MARK4抑制劑的研究陸續(xù)出現(xiàn)，但由于不良的效力和選擇性，臨床上尚未發(fā)現(xiàn)治療心血管疾病的特異性抑制劑。全面了解MARK4將會給心血管疾病的防治帶來新希望。

4 結(jié)語

目前，對于MARK4生理功能和作用機制的研究較為局限，多集中于炎癥層面，其抑制劑的研究也處于起步階段，多聚集于阻斷炎癥激活，從其他機制切入的研究基本為零，探索其他層面機制可拓寬心血管疾病治療靶點的范圍。MARK4微管動力學(xué)新機制的發(fā)現(xiàn)具有里程碑意義，為研究改善心肌細胞收縮和舒張力的新型藥物提供合理出發(fā)點，為治療心血管疾病提供新方向。目前發(fā)現(xiàn)的MARK4相關(guān)選擇性抑制物尚未在人體內(nèi)得到驗證，其對心血管疾病的治療效果和敏感度仍未知，需要進一步大規(guī)模試驗來驗證其功效。MARK4在心血管疾病中的特異性抑制劑尚未發(fā)現(xiàn)，以抑制MARK4過表達為研究中心的治療模式會成為一個獨特的發(fā)展趨勢，探索MARK4的靶基因及其調(diào)控方式，特異性MARK4抑制劑的開發(fā)將在心血管疾病的研究中開辟新領(lǐng)域。綜上所述，我們可以更深層地挖掘MARK4在心血管疾病中潛在作用機制，MARK4有望成為心血管疾病防治的一個潛在藥物靶點。