萊菔硫烷對肝損傷的保護作用及相關機制研究進展

馬欣雨， 段婷婷， 徐敬婭， 趙佳鶴， 張春蕾， 李寶龍

1 黑龍江中醫(yī)藥大學 藥物安全性評價中心， 哈爾濱 150040；2 黑龍江中醫(yī)藥大學 佳木斯學院， 黑龍江 佳木斯 154000

萊菔硫烷(sulforaphane，SFN) 是富含于十字花科植物的一類異硫氰酸鹽[1]，在西蘭花、卷心菜等蔬菜中含量較高[2-3]。研究[4-7]表明，SFN作為保護酶誘導物在抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、抗炎抗菌等方面發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。近年來大量研究證實，SFN可通過抗氧化應激、抑制炎癥細胞因子釋放、抑制肝細胞凋亡等機制，對化學性、藥物性、酒精性以及肝缺血-再灌注等多種類型的實驗性肝損傷發(fā)揮較好的防治作用。

1 SFN對化學性肝損傷的保護作用

1.1 四氯化碳(CCl4)誘導的肝損傷 CCl4誘導的肝損傷是常見的化學性肝損傷模型之一，其損傷機制為CCl4在肝臟經細胞色素P450(CYP450)代謝產生自由基從而引起膜系統(tǒng)發(fā)生鏈式脂質過氧化反應，造成肝超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性降低，脂質過氧化物增加，導致肝細胞及線粒體的脂質溶解，破壞肝細胞機能[8]。Baek等[9]通過對C57BL/6小鼠灌胃CCl44 g/kg復制肝損傷模型，結果顯示CCl4模型組動物血清ALT水平顯著升高，肝細胞出現(xiàn)明顯的膠原沉積和脂肪變性，且有炎癥和壞死，肝臟的纖維化程度明顯。SFN有效阻止了ALT的升高，降低了肝細胞內的脂滴和壞死區(qū)的數量。與對照組(采用CCl4灌胃)相比，SFN組肝臟的醌還原酶活性明顯較高，高劑量的SFN能顯著增強肝臟中谷胱甘肽S-轉移酶活性。ALT在肝組織中大量存在，可作為確定肝損傷的標志物，肝損傷后ALT由肝細胞入血，引起血清ALT升高?？寡趸瘎⒐入赘孰腟-轉移酶(GST)和醌還原酶(QR)等Ⅱ相酶的作用可以防止氧化應激，SFN可提高谷胱甘肽S-轉移酶和醌還原酶的活性以減輕CCl4誘導的肝損傷。

1.2 鎘誘導的肝損傷 SFN對鎘誘導的肝損傷也有一定程度的改善作用。徐冬輝等[10]研究發(fā)現(xiàn)，各劑量氯化鎘染毒組大鼠肝組織中還原型谷胱甘肽(GSH)水平、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、SOD活性均下降，丙二醛(MDA)水平升高，高劑量染鎘組(6 μmol/kg)大鼠肝組織中NF-E2相關因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA 的表達水平均升高。與高劑量氯化鎘染毒組比較，SFN干預組大鼠肝組織GSH水平、GSH-Px活性、SOD活性均升高，MDA水平下降，肝組織中Nrf2、HO-1和γ-GCS mRNA的表達水平升高。氧化應激是指體內氧自由基生成能力大于清除能力，SOD、GSH-Px和谷胱甘肽還原酶對氧自由基起到清除作用，谷胱甘肽還原酶可將氧化型谷胱甘肽變成GSH。Nrf2是氧化應激的重要調節(jié)因子，以胞漿蛋白伴侶分子-Nrf2-抗氧化反應元件(Keap1-Nrf2-ARE)信號通路介導抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表達[11]，是細胞抗氧化的重要通路。HO-1是血紅素代謝過程中的重要酶，主要應對肝腎細胞的氧化應激損傷，可通過Nrf2啟動發(fā)揮抗氧化作用。γ-GCS是抗氧化應激的一種重要Ⅱ相解毒酶，在Nrf2的調控下, γ-GCS表達發(fā)生變化, 其轉錄和表達水平反映機體抗氧化能力。SFN對鎘誘導的大鼠肝臟氧化損傷有一定拮抗作用。

1.3 微囊藻毒素誘導的肝損傷 微囊藻毒素是一種分布很廣泛的肝毒素[12]，它能夠強烈抑制蛋白磷酸酶的活性，還是強烈的肝臟腫瘤促進劑，已成為世界范圍內的環(huán)境危害。長期飲用受微囊藻毒素污染的水可能會導致肝損傷、肝癌甚至死亡。加強水污染治理是控制肝臟疾病發(fā)病率的重要手段之一[13]。

Sun等[14]通過對BALB/c小鼠腹腔注射微囊藻毒素LR，結果顯示SFN顯著提高了小鼠的存活率。與模型組比較，SFN預處理組Nrf2、醌氧化還原酶1(NQO1)和HO-1的mRNA及蛋白質水平都顯著增加，證明SFN對Nrf2相關下游基因有影響。

Lu等[15]發(fā)現(xiàn)在小鼠體內過表達Nrf2能對微囊藻毒素誘導急性肝毒性起到一定的保護作用。因此認為Nrf2的誘導是細胞防護微囊藻毒素誘導肝損傷的一種適應性機制。由此可推測SFN對Nrf2通路的激活與調控是其在微囊藻毒素誘導肝細胞損傷中發(fā)揮保護作用的主要原因。

2 SFN對藥物性肝損傷的保護作用

藥物性肝損傷是由藥物本身或其代謝產物或機體本身原因引起的肝損傷。CYP450參與了藥物在人體肝臟內的幾乎所有氧化代謝反應[16]，是參與藥物Ⅰ相代謝的主要酶系。有些藥物本身就具有一定的肝毒性，而有一部分藥物是在經酶催化后會轉化成肝毒性物質，肝臟本身有一定的解毒能力，小劑量肝毒性藥物或藥物轉化物可通過與GSH結合解毒，但當其劑量過大、GSH耗竭而超過肝臟的解毒能力時，就會引起一系列肝損傷反應[17]。

2.1 對乙酰氨基酚(APAP)誘導的肝損傷 常見的止痛藥APAP，在治療劑量下無毒[18]，過量服用會引起嚴重的肝損傷，氧化應激與APAP誘導的毒性密切相關。HO-1是一種抗氧化防御酶，已被證明能保護氧化劑誘導的組織損傷。

Noh等[19]對小鼠在SFN(5 mg/kg)灌胃給藥30 min后腹腔注射APAP(300 mg/kg)，6 h后處死。APAP導致血漿AST和ALT水平升高、GSH耗竭、細胞凋亡和4-羥基壬醛形成。SFN預處理可顯著減輕肝損傷。此外，APAP暴露提高肝活性氧(ROS)水平，SFN完全預處理抑制了ROS的形成。結果表明：SFN通過HO-1誘導的抗氧化作用對APAP介導的肝毒性起保護作用。SFN作為HO-1誘導劑在體外和體內對APAP肝毒性均有保護作用。通過SFN誘導原代肝細胞的預處理，促使Nrf2靶基因表達，特別是HO-1 mRNA和蛋白表達，抑制APAP誘導的GSH耗竭和脂質過氧化。

2.2 異煙肼(INH)誘導的肝損傷 INH是臨床抗結核化療中應用最為廣泛且不可替代的一線藥物，但INH引起的肝臟毒性嚴重限制了其臨床應用。傳統(tǒng)觀點認為，INH的肝毒性與其在肝臟代謝過程中產生的強氧化活性產物及ROS所致氧化損傷有關。

張?zhí)熳g等[20]連續(xù)4周每日1次給小鼠灌胃INH(150 mg/kg)建立INH肝損傷模型，結果顯示：SFN預處理激活了肝臟Nrf2-ARE信號通路，Nrf2總蛋白與核蛋白水平均顯著增加，Nrf2下游靶基因NQO1、HO-1、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基的表達水平均顯著升高，小鼠臟器系數顯著降低，肝組織脂肪變性病變明顯減輕；SFN預處理可明顯抑制INH誘導的CYP2E1高表達，MDA水平升高及GSH活性的降低[21]。CYP2E1酶是CYP酶體系的一員，是藥物代謝的核心體系成員，主要分布于肝臟。SFN通過上調下游抗氧化基因的表達可能會減輕INH所致肝損傷，并提示Nrf2-ARE信號通路可作為臨床防治INH肝毒性的潛在靶標。

2.2 阿霉素(ADM)誘導的肝損傷 ADM常用于治療各種惡性腫瘤，在肝癌化療過程中，肝損傷是阿霉素的主要不良反應之一。ADM對正常細胞(心臟、肝臟、腎臟等細胞)的不良反應嚴重制約其臨床應用。ADM可使小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的組織空泡，引起肝損傷。臨床上大劑量使用ADM，引起肝細胞功能障礙，通常表現(xiàn)為急性過程，多見既往有活動性肝炎等肝病患者。

紀倩等[22]通過連續(xù)4 d對小鼠腹腔注射ADM(20 mg/kg)建立肝損傷模型，SFN能明顯緩解阿霉素引起的體質量減輕，降低阿霉素誘導的肝、心、腎指數升高。各預保護組能明顯緩解ADM致小鼠血清ALT、AST水平升高，明顯減輕肝組織損傷；預保護組和SFN干預組過氧化物酶體增殖物激活受體α mRNA顯著升高，核轉錄因子(NF-κB)mRNA顯著降低。結果表明，炎癥與氧化應激可能有復雜的相關性，激活NF-κB是觸發(fā)炎癥應答及伴發(fā)的氧化應激的主要信號通路[23]，SFN通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α能夠抑制 NF-κB信號，抑制炎癥反應，由此減輕氧化應激進而達到防治ADM誘導的急性肝損傷。

3 SFN對酒精性肝損傷的保護作用

乙醇進入體內部分經過 CYP2E1代謝，適度的飲酒一般不會對肝臟造成損害。但酗酒無度會引起酒精性肝損傷，其很大程度上與肝臟的氧化應激反應、炎癥反應有關。而長期酒精攝入過量還會造成肝臟代謝紊亂，脂肪在肝臟代謝障礙并堆積，引起肝臟脂質變性，從而進一步造成酒精性脂肪肝。激活Nrf2-ARE通路并增加其下游相關基因的表達能發(fā)揮抗氧化作用[24]，從而減少酒精對肝臟的損傷。

李寶龍等[25]發(fā)現(xiàn)SFN能顯著減輕酒精對肝臟的損傷，且隨著濃度的增加，減輕效果顯著；與模型組(選用雄性C57BL16小鼠酒精灌胃，每12 h 1次，共給予3次)比較，SFN組血清甘油三酯和總膽固醇水平明顯降低；研究表明SFN可激活Nrf2的表達，使其下游谷胱甘肽S-轉移酶及GSH活性均升高；且SFN能明顯降低酒精刺激的固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c的表達。提示SFN通過激活Nrf2增強抗氧化作用，同時通過抑制固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c的機制來改善酒精所致的肝臟脂肪代謝異常。

有研究[26]發(fā)現(xiàn)中、高劑量SFN能夠明顯的保護酒精對GSH-Px活性的抑制作用，SFN對SOD活性的保護作用呈現(xiàn)劑量依賴性，使MDA產生減少。SFN能對酒精性肝損傷發(fā)揮保護作用，其主要作用機制與SFN提高了酒精代謝的關鍵酶SOD和GSH-Px活性有關[27]。

4 SFN對免疫性肝損傷的保護作用

免疫性肝損傷是肝臟內免疫細胞被致病因子激活，肝組織內大量炎癥細胞浸潤，產生免疫炎癥應答，導致免疫反應為基礎的肝損傷[28]。Lee等[29]對小鼠腹腔注射細菌內毒素(LPS，15 mg/kg)建立免疫性肝損傷模型，結果顯示，SFN能夠劑量依賴性地降低血清ALT、AST活性。SFN高、中、低劑量組腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL4)、髓樣分化因子(MyD88)、NF-κB P65蛋白均不同程度降低,且SFN高劑量組作用效果最明顯。TIL4、MyD88、NF-κB是Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB所介導的信號通路中的重要蛋白，提示SFN的治療機制可能與調控TLR4所介導的信號通路有關。SFN減輕炎癥反應所帶來的肝損傷，可能通過抑制TLR4/NF-κB所介導的信號通路，從而使炎癥基因如TNFα和IL-6的表達減少[30]。

地塞米松對急性肝損傷有保護作用。陳盛[31]通過給Wistar大鼠腹腔注射亞致死量的LPS(50 μg/kg)+D-GaLN(300 mg/kg),構建肝損傷模型，SFN干預組與地塞米松干預組均能使血清ALT、AST、TBil水平下降,兩組比較無顯著性差異。在IL-1β、TNFα、UGT1A1 RNA檢測結果中顯示，僅SFN干預組能降低IL-1β的生成；SFN干預組與地塞米松干預組均能降低TNFα mRNA的表達，且兩者均能增強UGT1A1 mRNA的表達，效果無顯著差異。在降低TNFα mRNA表達方面SFN強于地塞米松。提示在保護內毒素急性肝損傷時SFN較地塞米松效果更好,具有良好的應用價值。

5 SFN對缺血再灌注肝損傷的保護作用

缺血后再灌注可能導致代謝和結構性肝損傷，并可能繼發(fā)于創(chuàng)傷、膿毒癥、肝移植。缺血后再灌注機制復雜，部分機制與氧化應激損傷、炎癥因子釋放、微循環(huán)障礙及細胞凋亡等有關[32]。在肝臟缺血再灌注過程中，會產生大量氧自由基，導致脂質過氧化反應，造成肝細胞腫脹、變性、壞死以及肝細胞凋亡。在大鼠肝部分缺血再灌注模型中，模型組大鼠肝臟缺血再灌注后發(fā)生了顯著的細胞凋亡現(xiàn)象，凋亡基因 Caspase-3 表達升高，抑制凋亡基因 bcl-2 蛋白表達減少，SFN組前者表達降低，而后者表達上調，明顯減輕肝細胞凋亡。

腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后,SFN會通過上調肝組織Nrf2下游基因SOD的表達,增強對ROS的清除作用,降低肝的過氧化損傷程度。何煒等[33]用Wistar大鼠建立腎缺血再灌注損傷模型并分為SFN 1組與SFN 2組，SFN 1組在夾閉左腎動脈后立即給予SFN,SFN 2組在腎缺血再灌注損傷大鼠模型恢復血液再灌注后給予SFN，SOD活性結果顯示SFN 1組活性高于SFN 2組，缺血后即刻給予SFN更能很好的降低氧化應激水平，減輕過氧化損傷程度,從而更好的保護肝臟。

6 小結

近年來，大量實驗性肝損傷研究證實，SFN對各種類型的實驗性肝損傷均有不同程度保護作用。綜合來看，SFN的保肝作用與其抗炎、抗氧化特性密不可分，主要表現(xiàn)為抑制炎癥細胞因子的釋放，減輕炎癥反應；清除自由基，抑制脂質過氧化，提高機體抗氧化水平；抑制肝細胞凋亡等。但是關于SFN對肝病作用的臨床試驗相對較少。肝損傷作為常見疾病，嚴重危害人類的生命健康，一直備受關注。SFN作為一種天然的植物化學物在實驗性肝損傷治療方面效果顯著。闡明SFN的肝損傷保護作用機制，將為其在肝損傷方面的深入研究提供參考，也為今后開展相關的人群試驗提供了可靠的理論依據。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李寶龍、馬欣雨負責課題設計，資料分析，撰寫論文，修改論文；趙佳鶴、徐敬婭、段婷婷參與收集資料；李寶龍、張春蕾負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。