細(xì)菌外膜囊泡調(diào)節(jié)宿主天然免疫反應(yīng)機(jī)制研究進(jìn)展

謝 臻，湯晶晶，沈錫輝，郭抗抗，徐 磊*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

許多在獸醫(yī)公共衛(wèi)生和食品安全中有巨大危害的革蘭氏陰性菌，如大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)等可以產(chǎn)生一種直徑約20 nm～300 nm的球形的雙層泡狀結(jié)構(gòu)，稱為外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)，在細(xì)菌多種生理活動和致病性中發(fā)揮重要作用。OMVs的數(shù)量和組成可能取決于細(xì)菌的不同生長條件，其可以在細(xì)菌生長的所有階段出現(xiàn)，且其釋放量受到多個基因的影響。OMVs在其分泌過程中，會攜帶大量細(xì)菌細(xì)胞成分并將其轉(zhuǎn)移至胞外或靶細(xì)胞內(nèi)，也被稱為細(xì)菌的0型分泌系統(tǒng)[1]。與其他分泌系統(tǒng)相比，OMVs可以分泌多種類型的生物大分子如脂多糖(LPS)、磷脂、肽聚糖、外膜蛋白、細(xì)胞壁成分、蛋白質(zhì)(周質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和膜結(jié)合)、核酸(DNA、RNA)等，還可以分泌一些小分子化合物和金屬離子至胞外。

OMVs是細(xì)菌多種生理活動的重要參與者，對細(xì)菌的生存至關(guān)重要。OMVs可以在細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)傳遞，其可以將自身所攜帶的生化大分子等轉(zhuǎn)移至環(huán)境或靶細(xì)胞內(nèi)。OMVs還可以殺死相互競爭的微生物，由一種細(xì)菌產(chǎn)生的OMVs可以殺死附近的其他競爭微生物，且當(dāng)靶標(biāo)細(xì)胞含有與OMVs產(chǎn)生菌相似的肽聚糖時殺滅效果最好。OMVs還可以包裝抗生素，并以非常高的濃度將其運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)位置。除了細(xì)菌種間競爭的作用之外，細(xì)菌還可以釋放OMVs來抑制噬菌體的感染，顯著提高自身生存能力[2]。OMVs也可通過膜融合將其裝載物轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞，其可以利用宿主細(xì)胞的內(nèi)吞作用向真核細(xì)胞傳遞生物大分子，這一過程并不依賴于OMVs和真核細(xì)胞細(xì)胞膜之間的融合，而是OMVs作為一個整體被轉(zhuǎn)移至真核靶細(xì)胞。其進(jìn)入真核細(xì)胞后，能夠?qū)⑵渌\(yùn)載的物質(zhì)在靶細(xì)胞內(nèi)釋放，進(jìn)而通過不同的方式調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生理活動。OMVs自身所含有的多種蛋白質(zhì)能夠顯著增強(qiáng)細(xì)菌感染宿主的能力。同時，OMVs所含大分子物質(zhì)如LPS、核酸等同樣可以參與調(diào)節(jié)宿主的天然免疫反應(yīng)。本文將對OMVs的結(jié)構(gòu)特征、分泌機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，并就OMVs及其裝載物影響宿主天然免疫系統(tǒng)的方式和機(jī)理進(jìn)行討論，最后對利用OMVs開發(fā)有效治療工具的可能性進(jìn)行展望。

1 OMVs的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)生

OMVs是由細(xì)菌外膜(OM)包裹周質(zhì)內(nèi)容物、肽聚糖(PG)片段和核酸通過出芽的方式形成的。細(xì)菌OM的獨(dú)特之處在于其脂質(zhì)部分的不對稱分布，其中外部富含脂多糖(LPS)，內(nèi)部主要含有甘油磷脂[3]。OMVs的球形結(jié)構(gòu)提供了更高的比表面積，因此LPS存在密度非常高。OMVs產(chǎn)生菌的體外生長條件主要有3種，即在固體和液體培養(yǎng)基上的生長、在生物膜中的生長以及在細(xì)菌感染宿主細(xì)胞期間的生長。細(xì)菌的生長條件對OMVs的形成過程有顯著的影響，生長后期的細(xì)菌OMVs產(chǎn)量最高。此外，細(xì)菌外部環(huán)境如溫度、營養(yǎng)耗竭和抗生素等因素會導(dǎo)致細(xì)菌增加OMVs的產(chǎn)生和OMVs中生化大分子的包裝[4]。由于宿主細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境對于細(xì)菌是十分惡劣的，宿主與病原菌的相互作用也會影響OMVs的組成和產(chǎn)生?？傊琌MVs的產(chǎn)生與組成十分不穩(wěn)定，對細(xì)菌生長的外環(huán)境依賴性很強(qiáng)。

OMVs的分泌并不局限于特定的生長條件，在體內(nèi)(生物膜介質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)物)和體外(固體或液體培養(yǎng)基)生長的細(xì)菌都可分泌OMVs。然而，細(xì)菌釋放OMVs可能隨著環(huán)境的變化而變化，特別是應(yīng)激因素的影響，例如溫度和酸堿度的變化、抗生素(慶大霉素和氯霉素)、某些微量營養(yǎng)素(如賴氨酸)、鐵和血紅素的限制或者噬菌體的感染[5]。通常當(dāng)外膜凸起一小部分時開始形成囊泡，隨后凸起的這一部分與外膜擠壓分裂并形成囊泡狀被釋放。擠壓分裂的過程尚不清楚，但是有一些因素如OM的組成和周質(zhì)內(nèi)分子的積累可能與這一過程有關(guān)。從熱力學(xué)的角度來看，囊泡的形成是一個非自發(fā)的過程，但是相關(guān)形成機(jī)制的研究還較為有限[6-7]。

盡管對OMVs的研究早在50多年前就開始了，但還沒有一個被廣泛接受的OMVs的形成機(jī)制?；贠MVs組分的傳遞和一些生化試驗(yàn)的研究已經(jīng)建立了一些假說，這些假說試圖從分子水平解釋OMVs的形成機(jī)制。一種假說認(rèn)為，OMVs在膜的納米區(qū)域內(nèi)形成，在這些區(qū)域中積累著許多錯誤折疊的蛋白質(zhì)或細(xì)胞膜的成分，如脂多糖和肽聚糖。當(dāng)這些分子沒有被細(xì)菌有效地內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行降解和再利用時，它們就會積累并產(chǎn)生膨脹壓力和OM的局部凸起[6]。一些科學(xué)家認(rèn)為，OM外層的磷脂積累導(dǎo)致膜腫脹時產(chǎn)生OMVs是革蘭氏陰性菌形成OMVs的普遍機(jī)制。OMVs的產(chǎn)生與磷脂運(yùn)輸系統(tǒng)的調(diào)節(jié)直接相關(guān)，磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以對鐵缺失做出反應(yīng)。這是一種非物種特異性的機(jī)制，不依賴于膜的完整性或任何類型的壓力[8]。目前關(guān)于OMVs的收集和純化已經(jīng)有了較為規(guī)范的方法，有助于OMVs的形成機(jī)制以及OMVs運(yùn)輸機(jī)制相關(guān)研究的開展。

2 OMVs調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞天然免疫的信號通路

2.1 OMVs激活宿主天然免疫反應(yīng)

近年來，對革蘭氏陰性菌OMVs的功能，特別是其影響宿主細(xì)胞功能的研究十分廣泛。OMVs因其攜帶有大量LPS，能夠顯著激活宿主細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)來源的OMVs能夠刺激人中性粒細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)[9]。這些反應(yīng)被γ干擾素(IFN-γ)進(jìn)一步增強(qiáng)，這表明在存在IFN-γ的慢性炎癥狀態(tài)下，腦膜炎奈瑟氏菌OMVs誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠被增強(qiáng)。細(xì)菌OMVs也可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)的形成[10]。

OMVs亦可引起巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。細(xì)菌OMV被巨噬細(xì)胞吞噬，然后通過NF-κB信號途徑激活TNF-β、IL-8和IL-1β的產(chǎn)生[11]。牙齦假單胞菌(Porphyromonasgingivalis)OMVs使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNF-α、IL-12p70、IL-6、IL-10、IFN-β和一氧化氮[12]。此外，嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)OMVs可促進(jìn)炎性因子的釋放，其在感染后期又可以促進(jìn)細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，從而有助于嗜肺軍團(tuán)菌在宿主中的擴(kuò)散[13]。淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、致尿性大腸埃希菌(uropathogenicE.coli)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)OMVs可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的線粒體凋亡和NLRP3炎癥小體激活[14]。除了免疫細(xì)胞外，許多其他類型的細(xì)胞也可以對OMVs做出反應(yīng)。嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)OMVs能在人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞中引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[15]。大腸埃希氏菌(E.coli)的OMVs可以在人體腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，并促進(jìn)IL-8的產(chǎn)生[16]。

2.2 OMVs調(diào)節(jié)宿主天然免疫反應(yīng)

除了能夠直接激活宿主天然免疫反應(yīng)之外，OMVs能夠在與宿主細(xì)胞的相互作用過程中，通過其多種內(nèi)含物調(diào)節(jié)宿主天然免疫系統(tǒng)[17]。下面將主要討論OMVs包含的蛋白質(zhì)、LPS、毒力因子、RNA等許多生化分子在調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞天然免疫中的作用。

2.2.1 OMVs攜帶的蛋白質(zhì)在宿主天然免疫中的作用 研究表明，OMVs中蛋白的缺失會顯著影響巨噬細(xì)胞對OMVs的炎癥反應(yīng)。例如，在肺炎克雷伯菌的克隆相關(guān)臨床分離株中，孔蛋白的丟失會顯著影響巨噬細(xì)胞對OMVs的炎癥反應(yīng)。與表達(dá)一種或兩種孔蛋白的菌株的OMVs相比，缺乏孔蛋白OmpK35和OmpK36的OMVs引起的促炎細(xì)胞因子分泌水平顯著降低[18]。這一研究表明孔蛋白損失對OMVs的組成及其與吞噬細(xì)胞的相互作用均具有廣泛而顯著的影響，這可能影響宿主中細(xì)菌存活和炎癥反應(yīng)。此外，研究表明革蘭氏陰性菌OMVs可以通過向宿主細(xì)胞傳遞鞭毛蛋白以激活NLRC4炎癥小體[19]。

2.2.2 OMVs攜帶的毒力因子在宿主天然免疫中的作用 導(dǎo)致2011年大面積腹瀉和溶血性尿毒癥綜合征暴發(fā)的高毒性大腸埃希氏菌O104∶H4菌株，在其生長過程中分泌的OMVs含有多種毒力因子。其主要包含志賀毒素(Shiga toxin，Stx)2a，是O104∶H4菌株的主要毒力因子，還包含志賀氏菌腸毒素1型、H4鞭毛蛋白和O104脂多糖。OMVs被內(nèi)吞后與人腸上皮細(xì)胞結(jié)合并被其內(nèi)化，向細(xì)胞內(nèi)傳遞與OMVs相關(guān)的毒力因子，并誘導(dǎo)caspase-9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和IL-8分泌。Stx2a是OMVs誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的關(guān)鍵成分，而鞭毛蛋白和脂多糖主要誘導(dǎo)IL-8的分泌。這項(xiàng)研究證明了大腸埃希氏菌O104∶H4分泌的OMVs攜帶多種毒力因子能夠?qū)е氯四c上皮細(xì)胞凋亡[20]。產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)中不穩(wěn)定的腸毒素(LT)經(jīng)由OMVs分泌，只有攜帶LT的囊泡才能以受體依賴的方式侵入細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)說明ETEC OMVs作為專門針對性的運(yùn)輸工具，可以介導(dǎo)活性腸毒素和其他細(xì)菌包膜成分進(jìn)入宿主細(xì)胞。

2.2.3 OMVs攜帶的LPS調(diào)節(jié)宿主天然免疫系統(tǒng)中的作用 LPS作為OMVs中最豐富的組分之一，在調(diào)節(jié)宿主的天然免疫系統(tǒng)中具有重要作用。胞外的LPS由細(xì)胞表面受體TLR4所識別，與MD2和CD14共同導(dǎo)致基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。近年研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)同樣具有非TLR4依賴的LPS的識別受體，炎性caspases(人類中為caspase-4和caspase-5，小鼠中為caspase-11)被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)LPS受體[21]。caspase-11結(jié)合胞質(zhì)LPS導(dǎo)致其自身激活，與NLRP3和ASC一起誘導(dǎo)caspase-1激活。因此，LPS進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)與細(xì)胞外LPS對TLR4激活導(dǎo)致的天然免疫反應(yīng)完全不同，說明LPS進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)是許多細(xì)菌感染的重要步驟。在感染伯克霍爾德氏菌和志賀氏菌等胞內(nèi)菌時，LPS可能會進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。然而，包括腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)、霍亂弧菌(V.cholerae)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)在內(nèi)的大多數(shù)胞外菌同樣可以激活caspase-11，而OMVs似乎在這一過程中發(fā)揮重要作用[22-23]。

此外，在被網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞吸收后，OMVs將LPS從早期內(nèi)吞隔室輸送到細(xì)胞質(zhì)中。因此，OMVs激活細(xì)胞質(zhì)LPS感受器，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡和caspase-1激活，從而證明了OMVs在細(xì)菌感染期間細(xì)胞內(nèi)LPS釋放的重要作用。這一發(fā)現(xiàn)證明了OMVs作為LPS在細(xì)菌感染期間進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的重要手段。從更廣泛的角度來看，該研究揭示了一種基本機(jī)制，該機(jī)制可以通過OMVs將病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)傳遞到細(xì)胞質(zhì)以激活天然免疫系統(tǒng)[24]。此外，大腸埃希氏菌OMV-LPS具有在膀胱細(xì)胞內(nèi)化時調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用[25]。

2.2.4 OMVs攜帶的RNA在調(diào)節(jié)宿主天然免疫系統(tǒng)中的作用 在革蘭氏陰性菌分泌的OMVs中發(fā)現(xiàn)了RNA從細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，并被包裝到OMVs中。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、牙齦假單胞菌和霍亂弧菌產(chǎn)生的OMVs中包含的細(xì)菌RNA對上皮細(xì)胞具有免疫刺激作用[26]。OMVs中所包含的RNA作為外源物質(zhì)，其進(jìn)入宿主細(xì)胞胞質(zhì)后應(yīng)該能夠被胞質(zhì)RNA感受器如RIG-I或MDA5所識別，激活宿主天然免疫反應(yīng)，但目前相關(guān)研究還較少。

另有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞中的小RNA(small RNA，sRNAs)能夠被包裝至OMVs中，這些sRNA與miRNA大小類似，能夠在銅綠假單胞菌分泌的OMVs中檢測到其存在[27]。有趣的是，這些sRNA可以調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)[26]。這項(xiàng)研究中作者通過RNA-Seq來鑒定銅綠假單胞菌OMVs中差異包裝的sRNA，并顯示OMVs sRNA向宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在OMVs中含量豐富的sRNA52320能抑制LPS和OMV誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞分泌IL-8。研究還發(fā)現(xiàn)sRNA52320能減輕OMVs誘導(dǎo)的KC細(xì)胞因子的分泌和小鼠肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤。此外，在幽門螺桿菌OMVs中富集的sRNAs可以轉(zhuǎn)移到人胃腺癌細(xì)胞中，并減少脂多糖或OMVs誘導(dǎo)的AGS細(xì)胞分泌IL-8[28]。OMVs還可以成功地將胞外sRNA輸送到腦單核細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞中并引起神經(jīng)炎癥，這暗示了神經(jīng)炎癥疾病中的一種新的致病機(jī)制[29]?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明經(jīng)由OMVs介導(dǎo)的sRNA轉(zhuǎn)移是一種新的宿主-病原體相互作用機(jī)制，在銅綠假單胞菌抑制宿主天然免疫過程中具有重要作用[27]。該研究不但能夠拓展當(dāng)前學(xué)術(shù)界對于細(xì)菌OMVs生理功能的認(rèn)識，同時也為深入認(rèn)識細(xì)菌-宿主相互作用方式提供新的思路。

3 OMVs的應(yīng)用

革蘭氏陰性菌OMVs被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)許多生理和病理過程。利用它們的生理特性，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了向組織輸送一系列治療性物質(zhì)(siRNA、microRNA和蛋白質(zhì))。OMVs具有被免疫細(xì)胞攝取的最佳大小，并且存在一系列天然構(gòu)象的表面暴露抗原和Toll樣受體(TLR)激活成分，因此它們在疫苗制備方面具有良好的潛力[30]。利用生物工程的方法設(shè)計有效的脂質(zhì)體納米載體來實(shí)現(xiàn)治療藥物的靶向性遞送以及同源和異源抗原修飾，可以顯著增強(qiáng)其免疫原性[31]。利用脂質(zhì)雙層拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，通過脂質(zhì)體包裹兩親性治療藥物，除了增加它們的穩(wěn)定性和減少副作用之外，還延長了藥物半衰期[32]。與使用阿霉素相比，用脂質(zhì)體包裹化療藥物阿霉素，可以最大限度地攜帶藥物，研究顯示其在腫瘤中的積累增加，而毒性顯著降低。用脂質(zhì)體包裹用作治療結(jié)直腸癌的輔助化療藥物被認(rèn)為是一種很有潛力的靶向藥物輸送系統(tǒng)[33]。OMVs可以是天然或工程的細(xì)胞保護(hù)因子或細(xì)胞毒因子的載體，并作為應(yīng)用于從再生醫(yī)學(xué)到靶向癌癥治療的一種新型治療工具[34]。為了在特定條件下促進(jìn)治療藥物的釋放，需要在OMVs的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行脂質(zhì)體納米載體的生物工程，以實(shí)現(xiàn)更好的靶向性和增加治療藥物的攝取。

OMVs作為一個復(fù)雜的球狀物質(zhì)，其包含有多種具有生物活性的大分子，這也提示研究者可以采用天然或者人工改造的OMVs作為基礎(chǔ)來生產(chǎn)疫苗，以利于刺激產(chǎn)生復(fù)雜多樣和更持久的保護(hù)性免疫反應(yīng)。第一種臨床許可的OMVs疫苗為防治B群腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidisserogroup B)的疫苗。百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)OMVs可以防止后續(xù)的致死性細(xì)菌感染，顯著降低小鼠的細(xì)菌感染量[35]。OMVs包裹的體外miRNA在腫瘤微環(huán)境(TME)中對腫瘤細(xì)胞的耐藥性和存活率起著至關(guān)重要的作用[36]。另有研究表明，應(yīng)用與納米顆粒結(jié)合的OMVs作為疫苗可以有效地預(yù)防小鼠感染耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌[37]。這種與納米顆粒結(jié)合的方法可以產(chǎn)生更高水平的抗體，并且在預(yù)防致死性感染方面更有效，這是由于OMVs與納米顆粒結(jié)合時具有更高穩(wěn)定性，這也為今后OMVs疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

4 展望

OMVs可以由多種致病菌和非致病菌產(chǎn)生。OMVs缺乏細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)組分，并且它們含有的生物大分子(蛋白質(zhì)和脂質(zhì))水平顯示出與它們來源的細(xì)菌OM擁有高度的相似性。OMVs作為細(xì)菌的一種分泌系統(tǒng)，其能夠?qū)?nèi)部包裝的生物大分子遞送至其定位到的不同宿主細(xì)胞。OMVs可以介導(dǎo)其產(chǎn)生細(xì)菌在游離態(tài)或生物膜結(jié)構(gòu)中生存期間的分子釋放，從而促進(jìn)細(xì)菌維持毒力、釋放壓力、轉(zhuǎn)化以及在不同宿主中的黏附與定植。此外，OMVs中存在酶降解機(jī)制，可以將復(fù)雜的物質(zhì)分解成營養(yǎng)物質(zhì)并運(yùn)送到細(xì)胞中，因此OMVs在細(xì)菌的生存維持中發(fā)揮著重要作用。OMVs在細(xì)胞間傳遞分子的能力可以在各種生物過程中促進(jìn)細(xì)胞間的交流。根據(jù)OMVs在營養(yǎng)獲取、細(xì)胞間交流、調(diào)節(jié)細(xì)菌生態(tài)位、調(diào)節(jié)宿主天然免疫反應(yīng)等過程中的多種多樣的功能，我們不難發(fā)現(xiàn)OMVs在生理過程中的物質(zhì)傳遞載體作用。因此，針對將OMVs作為藥物傳遞載體的相關(guān)研究是近年來的一大熱點(diǎn)。同時需要注意的是，在以O(shè)MVs為基礎(chǔ)進(jìn)行疫苗的制備過程中，需要仔細(xì)衡量免疫效果和潛在副作用之間的平衡。由于OMVs攜帶有大量的LPS，因此在大劑量注射的時候會誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。因此，需要對OMVs疫苗進(jìn)行嚴(yán)格而徹底的安全性測試，以排除與OMVs相關(guān)的毒素可能帶來的有害影響。