PCSK9與動脈粥樣硬化的研究進(jìn)展

逯朝陽，姚瑤，2，郭春玲,2 綜述 楊濱，李保 審校

1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，山西 太原 030013；

2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一種慢性進(jìn)行性心血管系統(tǒng)疾病，其特征是大動脈內(nèi)脂質(zhì)和纖維成分的積累，是老年人最常見的死亡原因之一。脂蛋白代謝紊亂和炎癥相關(guān)的機(jī)制一直是As研究領(lǐng)域的熱點[1]。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)作為血漿脂蛋白的重要組成部分，參與了As發(fā)生發(fā)展的過程，是As發(fā)生的主要危險因素[2]。LDL-C主要通過低密度脂蛋白受體(LDLR)途徑從血漿中清除，LDLR 主要位于肝臟中，其升高在增強(qiáng)LDL-C 清除率方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與降低心血管系統(tǒng)疾病的風(fēng)險有關(guān)[3-4]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是前蛋白酶轉(zhuǎn)化酶家族蛋白酶K 亞家族的第9 個成員，目前已證實，PCSK9可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝而影響血脂，主要是在細(xì)胞表面與LDLR 的表皮生長因子前體同源結(jié)構(gòu)域A(EGF-A)相互作用，強(qiáng)力抑制LDLR水平，限制LDLR介導(dǎo)的脂蛋白攝取，使得LDL-C在血漿中堆積，參與As的發(fā)生發(fā)展[3，5]。PCSK9還通過其他多種途徑參與As的發(fā)生發(fā)展，本文對PCSK9 作為重要調(diào)控因子如何介導(dǎo)As的發(fā)生發(fā)展，以及對試圖通過干預(yù)PCSK9 來防治As的相關(guān)研究進(jìn)行了綜述與展望。

1 PCSK9概述與表達(dá)

PCSK9 基因于2003 年初首次被報道[6]，前蛋白是生物活性蛋白和多肽通過有限的蛋白質(zhì)水解而獲得的基本單位，前蛋白轉(zhuǎn)化酶是一組絲氨酸蛋白酶，其特點是能夠水解同源底物中的肽鍵并激活本身[7]。自1990 年以來，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8 種負(fù)責(zé)組織特異性處理分泌前體的哺乳動物前蛋白轉(zhuǎn)換酶(PCs)，PCSK9則是前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的第9個成員。

PCSK9 主要在肝、胸腺和脾臟、胰腺等中表達(dá)。在嚙齒動物中，PCSK9 主要在成年肝細(xì)胞中表達(dá)，在小腸和腎臟中表達(dá)較少，在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中短暫表達(dá)[8]。在KIM 等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，PCSK9 與胸腺和脾臟CD4+T細(xì)胞群的改變有關(guān)，小鼠中PCSK9的缺失導(dǎo)致循環(huán)中IL-17 的減少和脾臟中Th17 細(xì)胞數(shù)量的減少。PCSK9 在胰腺中也控制LDLR 的表達(dá)，可能有助于維持適當(dāng)?shù)纳砥胶猓韵拗萍?xì)胞中膽固醇超載，而這種效應(yīng)與循環(huán)PCSK9 無關(guān)，可能與局部產(chǎn)生的PCSK9有關(guān)[10]。

2 PCSK9與脂代謝紊亂

2003年前，已知的高膽固醇血癥只有兩種常染色體顯性形式：家族性高膽固醇血癥(FH)，由編碼LDL受體(LDLR)的基因突變引起；家族性載脂蛋白-100(APOB-100)突變引起的載脂蛋白-b100缺陷(FDB)，該突變破壞了LDL與LDLR的結(jié)合。這兩種疾病都會導(dǎo)致血漿LDL-C水平升高和動脈中膽固醇的積累，特別是冠狀動脈(冠狀動脈粥樣硬化)。2003年，ABIFADEL等[6]發(fā)現(xiàn)PCSK9基因后，多項研究證實，PCSK9突變在顯性高膽固醇血癥中所占的比例遠(yuǎn)低于LDLR 和APOB突變，因PCSK9突變而導(dǎo)致高膽固醇血癥的受試者中，僅有的臨床試驗發(fā)現(xiàn)與脂蛋白代謝相關(guān)，提示PCSK9主要在膽固醇代謝通路中發(fā)揮作用[11-13]。

已有證據(jù)表明，血漿脂蛋白a[Lp(a)]濃度與冠狀動脈疾病發(fā)生密切相關(guān)[1，14]。Lp(a)是一種密度介于高密度和低密度之間的特殊脂蛋白，是一種類似低密度脂蛋白(LDL)的顆粒，含有載脂蛋白(a)(apoA)與載脂蛋白b(apoB)[15]。Lp(a)富含膽固醇，可以沉積于血管壁，促使動脈粥樣硬化形成血栓，是冠心病的獨立風(fēng)險因子。LDL-C 主要通過LDLR 途徑從血漿中清除。LDL-C 與LDLR 結(jié)合后，LDL 和LDLR 被內(nèi)化到網(wǎng)格蛋白包覆的凹坑中，并在溶酶體中降解。當(dāng)LDLR 被循環(huán)回細(xì)胞膜時，PCSK9與LDLR結(jié)合，介導(dǎo)LDLR在溶酶體中的內(nèi)化和降解，減少LDLR的循環(huán)，進(jìn)而減少血漿中LDL-C的清除[3，16]。此外，O'DONOGHUE 等[15]匯總了25 096 例患者參與傅里葉試驗結(jié)果，在接受依洛尤單抗[evolocumab(一種PCSK9 抑制劑)]治療48 周的患者測試血漿脂質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，Lp(a)和LDL-C 水平從基線到48 周后相比，百分比均有下降，變化呈中度正相關(guān)性，且Lp(a)和LDL-C 水平較低的患者發(fā)生主要冠脈事件的風(fēng)險也會降低，由此證實PCSK9 抑制劑可以通過降低基線Lp(a)濃度減少主要冠狀動脈疾病的發(fā)生。此外，載脂蛋白b(apoB)是除了高密度脂蛋白以外的其他脂蛋白的主要結(jié)構(gòu)蛋白，起細(xì)胞識別和攝取LDL 的作用，PCSK9 的缺失降低了apoB 的生物合成率[17]。

除上述外，ASON 等[18]發(fā)現(xiàn)在CETP 轉(zhuǎn)基因小鼠中，PCSK9抑制劑介導(dǎo)的動脈粥樣硬化疾病程度的減輕需要LDLR和載脂蛋白e(apoE)的共同參與，增加肝臟LDLR的表達(dá)。TAVORI等[19]發(fā)現(xiàn)人PCSK9 也會在動脈壁內(nèi)積聚，直接影響動脈粥樣硬化病變的大小和組成，而不依賴于這種血脂和脂蛋白的變化，這些作用依賴于LDLR，但與apoE無關(guān)。

3 PCSK9與炎癥

3.1 內(nèi)皮細(xì)胞 內(nèi)皮功能障礙和炎癥是As早期發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵。研究表明，凝集素樣氧化LDL受體-1 (LOX-1)與氧化LDL (ox-LDL)在血管中結(jié)合，在內(nèi)皮損傷中發(fā)揮重要作用，高水平的LDL-C，特別是以ox-LDL 形式出現(xiàn)的LDL-C，會通過激活LOX-1 增加細(xì)胞內(nèi)活性氧應(yīng)激(ROS)的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)炎癥的發(fā)展[20]。SUN等[17]證實，缺乏PCSK9 的誘導(dǎo)時，內(nèi)皮細(xì)胞中TLR2、LOX-1、ICAM-1、CCL2、CCL7、IL-6、IL-1 蛋白、Beclin-1、p62和TRAF6 編碼基因的表達(dá)會顯著降低(＞4 倍)。此外，高脂肪飲食喂養(yǎng)的apoE 基因敲除小鼠，沉默PCSK9 基因可以在不影響其血漿膽固醇水平的情況下，直接抑制As血管炎癥進(jìn)程及抑制Toll 樣受體4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信號通路[21]?；谏鲜鲎C據(jù)，有理由認(rèn)為，在內(nèi)皮細(xì)胞中，PCSK9可以通過除LDLR和apoE 以外的途徑啟動促進(jìn)As 的進(jìn)程，既可以激活目前已證實的LOX-1途徑，又可以影響未明確的炎癥因子調(diào)控途徑，共同促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生發(fā)展，啟動并加劇As的進(jìn)程。

3.2 單核/巨噬細(xì)胞 當(dāng)血管中炎癥發(fā)生時，單核細(xì)胞可浸潤動脈粥樣硬化病變部位，分泌大量促炎細(xì)胞因子，成熟為活化的巨噬細(xì)胞，加速動脈炎癥和動脈粥樣硬化進(jìn)程。據(jù)報道，在動脈粥樣硬化過程中起核心作用的為兩種不同的巨噬細(xì)胞群體：促炎(M1細(xì)胞)和抗炎(M2細(xì)胞)[22]，其中M1 巨噬細(xì)胞表達(dá)多種促炎介質(zhì)，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素家族如IL-1、IL-6、IL-12和蛋白水解酶3。研究證實，PCSK9 與NLRP3/Caspase-1 的作用是相互的[23-24]，一方面，PCSK9 通過啟動線粒體DNA (mtDNA)損傷，激活NLRP3 炎癥小體信號(NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1 和IL-18)，進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase-1 依賴的焦解作用，同時在決定PCSK9 分泌方面，NLRP3炎癥小體可以通過IL-1小分子細(xì)胞發(fā)揮重要作用，特別是在高脂肪飲食的情況下更為顯著。但是PCSK9 與線粒體損傷、分裂或融合等，及其在巨噬細(xì)胞參與動脈粥樣硬化的進(jìn)程中的具體作用機(jī)制，目前該方面的研究尚屬空缺，需要更多的實驗結(jié)果予以補(bǔ)充。此外，NADPH 氧化酶是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)的一種獨特的酶源，ROS 參與了腫瘤壞死因子α(TNF-α)介導(dǎo)的PCSK9 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)清道夫受體(SRs)的表達(dá)[25]。SRs 是巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL 的主要受體，巨噬細(xì)胞釋放的PCSK9 具有生物活性，在DING等[26]實驗中，TNF-α誘導(dǎo)的小鼠以劑量依賴的方式增加了PCSK9 和所有SRs 的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控ox-LDL 的攝取。以上可見，活化后的單核/巨噬細(xì)胞中，PCSK9 確實有促進(jìn)炎癥發(fā)展的作用，同時炎癥因子也在促進(jìn)PCSK9 的表達(dá)，比如PCSK9 與NLRP3/Caspase-1，鑒于巨噬細(xì)胞有多種促炎介質(zhì)表達(dá)，有理由相信其中還有更多作用機(jī)制值得去探究。總的來說，單核/巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中有著舉足輕重的作用，尤其是可以表達(dá)多種促炎介質(zhì)的M1 巨噬細(xì)胞，一方面，活化后的巨噬細(xì)胞可以釋放多種促炎因子通過各種途徑與PCSK9 有著交叉相互作用，兩者相互影響，共同促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程，另一方面，PCSK9 對巨噬細(xì)胞線粒體的影響也值得注意及進(jìn)一步研究。另一項研究指出，PCSK9轉(zhuǎn)導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸激酶25 (STK25)轉(zhuǎn)基因小鼠的主動脈中巨噬細(xì)胞浸潤水平更高[27]，且STK25 蛋白在主動脈各層均有表達(dá)，由此可見，STK25 在巨噬細(xì)胞炎癥過程中起著不可忽視的作用，也進(jìn)一步可以看到其在調(diào)節(jié)心血管疾病風(fēng)險中或許可發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過藥物抑制STK25 功能可能為預(yù)防及治療動脈粥樣硬化提供新的可能性，STK25 在動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮作用所涉及的信號通路可以為進(jìn)一步尋找相關(guān)的治療提供思路。

3.3 血管平滑肌細(xì)胞 在血管平滑肌細(xì)胞中，PCSK9 受Toll樣受體4-c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(TLR4-SAPK/JNK)信號通路的調(diào)控[28]，而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、p38 或磷脂酰肌醇三激酶(PI3-kinase)通路則對其沒有作用。TLR4 配體LPS可上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中PCSK9基因和蛋白水平，這是一個在炎癥和代謝中重要的通路，血管平滑肌細(xì)胞來源的PCSK9 會降低單核細(xì)胞LDLR 表達(dá)，影響LDL-C/LDLR 介導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化因子受體(CCR2)表達(dá)，而后者對細(xì)胞運(yùn)動和As發(fā)生至關(guān)重要。另外，溶血磷脂酸受體4 (LPAR4)[29]在腺相關(guān)病毒表達(dá)PCSK9 會降低LDLR 水平的作用，在暴露于ox-LDL后，平滑肌細(xì)胞上調(diào)炎癥標(biāo)志物IL-6 和CD68 的基因表達(dá)，且在敲除該基因的細(xì)胞中，編碼促生長因子-平滑肌肌動蛋白A2(Acta2)的表達(dá)在基線水平較低。其他研究表明，IL-17 可通過增強(qiáng)TGF-β信號通路和血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生膠原來穩(wěn)定斑塊的形態(tài)，并且在有促炎因子IFN-α存在的情況下，伴隨的IL-17 的增加可能會促進(jìn)As，但是抑制PCSK9 表達(dá)在上述通路中所起作用還未有試驗進(jìn)行證明[30]。根據(jù)目前所有證據(jù)，有理由推測PCSK9 的升高會促進(jìn)IL-6、IL-17、CD68、IFN-α等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)As的發(fā)生發(fā)展。

3.4 血管成纖維細(xì)胞 血管成纖維細(xì)胞是形成血管外膜的主要細(xì)胞，血管功能障礙曾一度被認(rèn)為是血管的一個“由內(nèi)而外”的過程，但目前有更多證據(jù)表明，病理條件下，冠狀動脈外膜重構(gòu)先于內(nèi)皮功能障礙的存在，最終導(dǎo)致血管壁增厚和功能障礙[31]。新生內(nèi)膜形成的部分特征是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后獲得了遷移和增殖能力，表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白如α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)和纖維連接蛋白等基質(zhì)成分的過度合成和分泌，這些表型改變允許外膜成纖維細(xì)胞持續(xù)向腔內(nèi)遷移，促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成和內(nèi)膜增厚[32]。轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-β1)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在組織修復(fù)中起著核心作用[33]。所以誘導(dǎo)TGF-β的表達(dá)可能為外膜成纖維細(xì)胞成為肌成纖維細(xì)胞提供分化信號。另外，血管外膜成纖維細(xì)胞在血管緊張素Ⅱ(ANG Ⅱ)刺激下合成并釋放內(nèi)皮素-1(ET-1)，且釋放的ET-1具有生物活性，ET-1可能通過刺激外膜細(xì)胞表明ETA受體促進(jìn)膠原合成[34]。由于目前PCSK9與成纖維細(xì)胞炎癥方面的研究還屬空白，所以列出了以下猜測。REY等[35]研究表明，炎癥發(fā)生時血管成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的NADPH氧化酶衍生的活性氧(ROS)，參與成纖維細(xì)胞增殖，結(jié)締組織沉積，可能還有血管張力，但特異性氧化還原敏感信號通路的參與導(dǎo)致細(xì)胞增殖尚不清楚。關(guān)于ROS，巨噬細(xì)胞部分也有提及，一方面其會參與TNF-α介導(dǎo)的PCSK9 表達(dá)，另一方面參與調(diào)節(jié)SRs 的表達(dá)，那么血管成纖維細(xì)胞來源的ROS是否有同樣作用呢？此外，缺氧條件下，前脂肪細(xì)胞增殖顯著增加，IL-6、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，人硒蛋白P(SePP1)的表達(dá)量顯著降低，與血管成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，血管成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，遷移增加，Ⅰ型膠原表達(dá)升高[36]。由此可見，缺氧可脂肪積累，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致SePP1表達(dá)降低，可能參與了As的發(fā)生發(fā)展。這項發(fā)現(xiàn)與平滑肌細(xì)胞炎癥時的所涉及的炎癥因子有不謀而合之處，是否這些炎癥因子會共同作用于平滑肌細(xì)胞和血管成纖維細(xì)胞，同時接受PCSK9的調(diào)控呢。

彈性假黃瘤(PXE)是由ABCC6 突變引起的常染色體隱性疾病，以動脈粥樣硬化和軟組織鈣化為特征。據(jù)KUZAJ等[37]研究發(fā)現(xiàn)，PXE成纖維細(xì)胞中膽固醇生物合成增加與PCSK9 水平升高有關(guān)，且ABCC6表達(dá)的增加伴隨著膽固醇生物合成的誘導(dǎo)，據(jù)此可以推測ABCC6 在人體脂蛋白和膽固醇穩(wěn)態(tài)中具有功能作用，但是具體機(jī)制還未有研究闡明。

4 調(diào)控PCSK9水平在治療動脈粥樣硬化疾病中的臨床意義

PCSK9 作為動脈粥樣硬化性心血管疾病治療靶點的發(fā)現(xiàn)，使得抑制其作用的單克隆抗體被開發(fā)，而循環(huán)的肝臟來源的PCSK9 是單克隆抗體的主要靶點[10]。兩種針對PCSK9的人單克隆抗體：依洛尤單抗(evolocumab)和阿莫羅布單抗(alirocumab)在臨床應(yīng)用最為廣泛，SABATINE等[38]研究共納入27 564例患者，證明了evolocumab在他汀類藥物治療背景下可以顯著降低LDL-C 水平至30 mg/dL(0.78 mmol/L)，并且會顯著降低心血管風(fēng)險，同樣，TAVORI等[19]研究共納入25 096 例患者，觀察使用48 周依洛尤單抗的患者發(fā)現(xiàn)，依洛尤單抗將冠心病死亡、心肌梗死或緊急血運(yùn)重建的風(fēng)險降低了23%。除PCSK9 的人單克隆抗體之外，一種名為Inclisiran 的新型的通過降低膽固醇從而治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的藥物也即將問世，該藥是一種化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)分子，靶向于肝臟生成PCSK9，其降低LDL-C 的效果和降低心血管風(fēng)險的潛力目前正在臨床試驗中[39]。除上述兩類調(diào)控PCSK9 水平的藥物外，WANG 等[40]對7030B-C5藥理作用和分子機(jī)理進(jìn)行詳細(xì)研究后，確定其為一種潛在的小分子PCSK9抑制劑。

5 結(jié)語

PCSK9 雖然發(fā)現(xiàn)較晚，但不可否認(rèn)它是As 中一個重要的信號調(diào)控因子。雖然臨床試驗已經(jīng)證明PCSK9 是降低血脂和預(yù)防和治療的As進(jìn)展的生物靶點，但其生理作用尚不完全清楚。LDLR和apoE 介導(dǎo)的PCSK9對血漿脂質(zhì)的影響是目前已被證實的，但是目前越來越多的證據(jù)表明，PCSK9是通過各種炎癥因子的介導(dǎo)促進(jìn)As的發(fā)生與發(fā)展，但其具體機(jī)制還未明確。希望通過本文的梳理可以提供新的思路去考慮PCSK9與As的關(guān)系。