細胞制劑支原體檢測方法概述

陳耐寒， 撒亞蓮

（昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院 云南省第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，云南 昆明 650032）

細胞治療是除藥物、手術(shù)、放化療外，以活細胞制劑為主要成分來治療或預(yù)防疾病的技術(shù)[1]。目前，細胞治療領(lǐng)域的研究熱點是干細胞和免疫細胞，均需遵照中國國家法律、法規(guī)與行政管理規(guī)定，其細胞來源、生產(chǎn)工藝和臨床應(yīng)用過程均需在符合倫理要求的前提下開展臨床研究[2-4]。

支原體（Mycoplasma）是細胞培養(yǎng)過程中常見的外源性污染物[5]，開展支原體污染檢測是細胞質(zhì)量控制微生物學(xué)安全性評價體系中的一項重要內(nèi)容[6]。由于活細胞制劑終產(chǎn)品不能滅菌處理，且《中華人民共和國藥典》[7]規(guī)定的培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法（DNA染色法）檢測支原體所需的時間較長，在細胞制劑終產(chǎn)品進入人體前不能獲得檢測結(jié)果，因而非常有必要建立細胞制劑放行檢測的高時效性支原體檢測方法。本文對支原體的生物學(xué)特性，以及支原體的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)法和核酸檢測法的特點進行綜述，為開展細胞制劑質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)評價體系建設(shè)提供參考。

1 支原體的生物學(xué)特性

支原體是一類廣泛存在于自然界的、最小的、沒有細胞壁的原核細胞型微生物，大小為0.1～0.3 μm，可通過細胞培養(yǎng)技術(shù)中常使用的0.22～0.45 μm濾器，導(dǎo)致預(yù)防支原體污染的難度增加。支原體于1956年被正式命名，自1898年法國科學(xué)家Nocard和Roux首次分離該類微生物以來，現(xiàn)已分離出近200種支原體[8]。支原體為柔膜體綱（Mycoplasmas），在支原體目里有支原體科（Mycoplasmataceae）、無膽甾原體科（Cholesterogen free）和螺原體科（Spiroplasmataceae），其中支原體科由支原體屬（Mycoplasma）與脲原體屬（Ureaplasma）組成，支原體屬有肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）、人型支原體（Mycoplasma hominis）、生殖支原體（Mycoplasma genitalium）、穿透支原體（Mycoplasma penetrating）和發(fā)酵支原體（Mycoplasma fermentans）等75余種。支原體革蘭染色為陰性，吉姆薩染色為陽性[8-9]。

支原體生長緩慢，適宜的生長溫度為35 ℃，pH值為7.6～8.0；但脲原體的最適pH值為6.0～6.5。支原體抵抗力較弱，對熱、干燥、75%乙醇、煤酚皂溶液敏感，對紅霉素、螺旋霉素、四環(huán)素、卡那霉素和鏈霉素等抗菌藥物敏感，對青霉素類抗菌藥物不敏感。支原體廣泛存在于自然界，種類繁多，但僅部分支原體對人類有致病性，一般通過黏附在宿主上皮細胞表面成為人類、動物和植物的寄生物，通過攝取宿主細胞的膽固醇等營養(yǎng)物質(zhì)和/或代謝產(chǎn)生的毒素、過氧化氫等有毒物質(zhì)危害人類和動植物，給細胞制劑和科研工作帶來負面影響。有的支原體可以進入人類細胞，如滲透支原體，可通過胞內(nèi)定位能力保護其免受宿主免疫系統(tǒng)和藥物的清除，導(dǎo)致隱性感染和慢性感染，使細胞培養(yǎng)物中的支原體污染難以清除[5，8-10]。由此可見，細胞制劑支原體污染監(jiān)測及防治工作具有重要意義。

2 支原體污染對細胞的影響

培養(yǎng)細胞被支原體污染是世界范圍的共性問題。有研究結(jié)果表明，在污染細胞中發(fā)現(xiàn)了口腔支原體（Mycoplasma oral）、豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）、精氨酸支原體（Mycoplasma arginine）、萊氏無膽甾原體（Acholeplasma laidlawii）等20余種支原體，有的細胞株可以同時被2種及以上的支原體污染[8-9，11]。支原體污染細胞初期一般不容易觀察到細胞增殖和形態(tài)的改變；但被支原體嚴重污染，會導(dǎo)致細胞生長緩慢，折光性降低，細胞間出現(xiàn)膜片狀的黏附結(jié)構(gòu)；宿主細胞的核酸蛋白合成受到抑制會產(chǎn)生影響細胞存活的某些酶和細胞因子，使細胞的增殖受到抑制甚至停止，細胞體積變大，細胞碎片越來越多，最終導(dǎo)致細胞死亡。由此可見，支原體污染存在潛在的巨大危害，因此，開展支原體污染檢測是細胞制劑質(zhì)量保障的重要措施，是細胞制劑原材料制備、生產(chǎn)過程和終產(chǎn)品質(zhì)量控制的核心指標。

支原體污染與細胞質(zhì)量管理的5個影響因素（人員、設(shè)備、材料、方法和環(huán)境）密切相關(guān)，其來源包括污染的培養(yǎng)基、動物血清、胰蛋白酶，已污染的培養(yǎng)物氣溶膠、已污染的培養(yǎng)箱以及操作人員等[5，8-9]；預(yù)防支原體污染涉及生產(chǎn)過程中的每個環(huán)節(jié)，必須嚴格執(zhí)行質(zhì)量管理規(guī)定，嚴格按照生產(chǎn)工藝和作業(yè)指導(dǎo)書要求進行細胞制劑的生產(chǎn)，重視原材料、生產(chǎn)過程和終產(chǎn)品的質(zhì)量與監(jiān)測是預(yù)防支原體污染的重要前提和有效措施。

3 支原體的檢測方法

3.1 支原體的形態(tài)學(xué)檢測

支原體大小為0.1～0.3 μm，形態(tài)各異，有球狀、環(huán)狀、絲狀、分枝狀；支原體無細胞壁，有細胞膜，胞內(nèi)有核糖體、線粒體、多種酶類、RNA以及環(huán)狀雙鏈DNA。細胞制劑如果被支原體污染，用透射/掃描電鏡可觀察到在細胞表面和/或細胞核外、細胞周圍、細胞間隙有支原體黏附，透射電鏡可以觀察到支原體胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)[10]，但是電鏡觀察結(jié)果與操作者的技能和經(jīng)驗有關(guān)，而且耗時長，儀器昂貴。桂馨等[12]用二苯甲酰胺熒光染料（Hoechst33342）直接染色活細胞后，在熒光顯微鏡下觀察到細胞周圍或細胞膜上有大小不等、不規(guī)則的熒光著色顆?；蚪z狀物，推測為支原體，但在污染初期不易被發(fā)現(xiàn)，易出現(xiàn)假陰性；細胞碎片因容易被染料著色，而出現(xiàn)假陽性。支原體經(jīng)吉姆薩染色后，在光學(xué)顯微鏡下呈淡紫色，染色方法簡便、快捷；用相差顯微鏡如觀察到細胞表面和細胞之間有暗色微小顆粒，可判讀為支原體陽性。但是支原體形態(tài)學(xué)檢測方法需要技術(shù)人員有豐富的經(jīng)驗，結(jié)果重復(fù)性差，支原體污染的直接證據(jù)是分離、培養(yǎng)到支原體，因此需要采用培養(yǎng)法進一步判定是否為支原體污染。

3.2 支原體的培養(yǎng)法檢測

《中華人民共和國藥典》規(guī)定的支原體檢測方法培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法（DNA染色法）是檢測支原體的“金標準”，能夠檢測不同生長特性的支原體，具有廣譜性，但敏感性低，耗時長[7，11，13]。

支原體生長緩慢，能夠在無生命培養(yǎng)基生長、繁殖；有的可在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長，如肺炎支原體；有的在細胞上生長得更好，如豬鼻支原體；有的尚不能培養(yǎng)，如植原體。但由于支原體DNA中編碼氨基酸和輔助因子的基因極少，缺乏糖異生、三羧酸循環(huán)等代謝途徑中的許多重要基因，使得支原體生長對營養(yǎng)的需求比一般細菌要高，除需要含有牛肉浸液、酵母浸粉、豬胃消化液、葡萄糖、精氨酸等蛋白胨的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)外，還需加入10%～20%人或動物血清，用于提供支原體生長、繁殖所需的膽固醇。基于支原體是分解葡萄糖還是利用精氨酸，分為2類支原體培養(yǎng)體系。解脲支原體雖然不能利用葡萄糖或精氨酸，但可以利用精氨酸水解生成的尿素；另外，根據(jù)培養(yǎng)體系中是否有瓊脂及其含量又可分為液體、半固體與固體培養(yǎng)體系[5，7，9，11，13]。

在富含葡萄糖的支原體肉湯培養(yǎng)基中，支原體可因分解葡萄糖產(chǎn)酸，從而使液體培養(yǎng)基顏色變黃（pH值下降為酸性）；精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基顏色變?yōu)樘壹t色可提示有支原體生長，其可分解尿素，產(chǎn)生氨，使pH值上升為堿性；在半固體培養(yǎng)基中如觀察到沿接種線呈煙霧狀，則提示有支原體生長；在支原體瓊脂固體培養(yǎng)基上可觀察到圓形房頂樣菌落，隨著傳代培養(yǎng)可觀察到“油煎荷包蛋”樣菌落，呈圓形，核心部分較厚，向下長入培養(yǎng)基，周邊為1層薄的透明顆粒區(qū)。

指示細胞培養(yǎng)法（DNA染色法）是用已被證實無支原體污染的Vero細胞或其他傳代細胞作為指示細胞，將待檢測細胞（供試品）經(jīng)無抗菌藥物培養(yǎng)液至少傳1代，然后取細胞長滿，且3 d未換液的細胞培養(yǎng)上清液2 mL，加入到有指示細胞的培養(yǎng)孔，孵育3～5 d，傳代到有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)3～5 d，再用固定液固定，熒光染料（Hoechst33342）染色，通過熒光顯微鏡觀察，陰性對照組僅指示細胞核有熒光染色，支原體污染組可在細胞核或細胞周圍觀察到大小不等、不規(guī)則的熒光著色顆粒，或絲狀的熒光帶[12]。

培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法（DNA染色法）檢測到的支原體均為活的支原體，一旦檢測結(jié)果是陽性，即可證明樣本中確實存在支原體污染。但是這2種方法仍具有一定的局限性：（1）2種檢測方法都需要較長時間，培養(yǎng)法需要進行次代培養(yǎng)，耗時28 d；指示細胞培養(yǎng)法（DNA染色法）從指示細胞復(fù)蘇，再經(jīng)過盲傳，約需14 d；（2）2種方法成本均較高，要求檢測人員具有熟練技術(shù)；（3）2種方法均不能明確支原體的亞型。鑒于此，培養(yǎng)法雖然是檢測支原體的“金標準”，但不適用于細胞制劑終產(chǎn)品的放行檢測。當然，這并不意味著應(yīng)取消細胞制劑終產(chǎn)品的支原體培養(yǎng)法檢測，其檢測結(jié)果可用于細胞制劑放行檢測的驗證。因此，選擇和/或建立適宜的細胞制劑終產(chǎn)品放行檢測的快捷、特異、敏感的支原體檢測方法非常必要。

3.3 支原體的核酸檢測

目前，核酸擴增檢測技術(shù)（nucleic acid amplification technique，NAAT）因快速、特異、敏感、高效已成為支原體快速檢測的首選方法[5，9，13-15]。世界衛(wèi)生組織建議建立以核酸檢測為基礎(chǔ)的快速放行檢測方法，并要求進行定量分析[16]。支原體的核酸檢測主要是基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴增支原體基因組中某段特異性核酸保守序列來判斷是否有支原體污染。近年來，隨著NAAT的發(fā)展，在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上建立了巢式PCR、實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基因芯片、滾環(huán)復(fù)制擴增（rolling circle amplification，RCA）、數(shù)字PCR、PCR產(chǎn)物-直接測序與高通量測序[又稱“下一代”測序（next generation sequencing，NGS）]等檢測技術(shù)[13-23]。每種方法各有其優(yōu)點與缺點，NGS通量高，無需設(shè)計特定的探針，在短時間內(nèi)可獲得支原體基因組的全部信息，且準確度高、成本相對低，但操作復(fù)雜，需有專門的分析軟件和操作系統(tǒng)，且設(shè)備昂貴。

NAAT檢測結(jié)果僅可提示細胞制劑中存在支原體基因組，但不能判斷支原體是否存活，是否為支原體相近種屬的微生物污染；也不能排除是否存在環(huán)境和/或試劑中的支原體核酸或質(zhì)粒污染；且支原體種類繁多，設(shè)計擴增廣譜性與特異性目的片段的PCR擴增引物有難度。支原體核酸提取、PCR擴增反應(yīng)體系與擴增程序等均對擴增目的片段的效率有影響，可因無法檢測到個別基因丟失或未轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致假陰性。另外，在支原體與環(huán)境的交互作用中，容易出現(xiàn)基因組DNA變異，為設(shè)計特異性引物帶來困難。因而，基于PCR技術(shù)的支原體核酸檢測尚不能代替“金標準”方法，但可作為細胞制劑的快速放行檢測方法。值得注意的是，開展支原體核酸檢測時，需要對同一份樣本采用支原體“金標準”方法檢測，以驗證PCR結(jié)果的準確性，方能確定其能否成為支原體的快速檢測方法。

3.4 支原體的其他檢測方法

支原體細胞膜有3層，厚度為7.5～10.0 nm，內(nèi)外2層主要為蛋白質(zhì)和多糖，中間層以含膽固醇的脂質(zhì)成分為主。檢測支原體細胞膜蛋白的Western blot技術(shù)是研究支原體致病機制的切入點，可確定是否存在支原體污染，但該技術(shù)耗時長、操作流程多，不適宜用于細胞制劑質(zhì)量評價技術(shù)體系中的支原體檢測。支原體能在孵化10～12 d的雞胚絨毛尿囊膜中生長，但實驗周期等因素會影響其在細胞制劑放行檢測中的使用。尿核苷/尿嘧啶吸附比率、放射自顯影法、支原體RNA聚丙烯酰胺法、瓜氨酸測定法、酶聯(lián)免疫吸附試驗等支原體檢測方法[24]，也不適宜用于細胞制劑的檢測。

4 總結(jié)

支原體是介于細菌和病毒間的、能獨立存活的一類最小的原核細胞型微生物，廣泛存在于自然界，種類繁多，是生物制品與細胞制劑中最常見的外源性微生物污染因子。支原體污染的直接證據(jù)是分離培養(yǎng)到支原體，培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法（DNA染色法）是支原體檢測的“金標準”，但其檢測時間長；基于PCR技術(shù)的NAAT快速、特異、敏感、高效，但有假陰性的可能；NGS越來越廣泛地被應(yīng)用于微生物宏基因組學(xué)研究，在1次測序反應(yīng)中可獲取支原體類型、耐藥與毒力等相關(guān)基因信息，對細胞制劑質(zhì)量監(jiān)測及其評價體系的建立具有重要意義，或可成為檢測細胞制劑終產(chǎn)品微生物污染的新型工具。支原體污染重在預(yù)防，對于細胞制劑生產(chǎn)過程中的原材料、生產(chǎn)過程的關(guān)鍵節(jié)點與細胞庫的樣品與活細胞制劑的放行檢測，建議采用經(jīng)過驗證的PCR快速檢測或NGS，聯(lián)合支原體的“金標準”檢測方法。圍繞人員、設(shè)備、物料、方法、環(huán)境開展好細胞制劑的質(zhì)量管理工作是預(yù)防支原體污染的關(guān)鍵；嚴格執(zhí)行細胞制備相關(guān)的管理制度和操作規(guī)程是保證細胞質(zhì)量的核心要素[25-26]。生物學(xué)領(lǐng)域科技水平飛速發(fā)展，相信快速、高效、特異性好、靈敏度高，兼顧廣譜性的支原體檢測方法會不斷被開發(fā)出來。