適用于甲殼動(dòng)物細(xì)胞的緩沖液配方優(yōu)化

朱 坤，李 鈁，楊 豐

(自然資源部第三海洋研究所、海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

在對(duì)螯蝦、對(duì)蝦等甲殼動(dòng)物細(xì)胞的研究中，研究人員廣泛采用了適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者昆蟲細(xì)胞的各類緩沖液。例如，在研究血細(xì)胞凋亡時(shí)使用的各類細(xì)胞凋亡試劑盒[1-2]，血細(xì)胞體外吞噬時(shí)[3-6]以及血細(xì)胞分類時(shí)[7-9]使用的磷酸鹽緩沖液(PBS)等。除此之外，在甲殼動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中也經(jīng)常采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)液，例如Leibovitz’s L-15[10-13]、Medium-199[14-15]、Grace’s 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基[16-17]、Mitsuhashi and Maramorosch 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基[18]等。但是甲殼動(dòng)物的滲透壓與哺乳動(dòng)物、昆蟲等物種的滲透壓不同，而且會(huì)根據(jù)生活環(huán)境不同而變化，同時(shí)滲透壓對(duì)于甲殼動(dòng)物具有十分重要的生理作用，它的調(diào)節(jié)能使甲殼動(dòng)物很好地適應(yīng)各種水生環(huán)境，維持正常的生命活動(dòng)[19-22]，因此直接沿用哺乳動(dòng)物等物種的緩沖液配方是不合適的。

除了上述溶液之外,在甲殼動(dòng)物細(xì)胞研究中最常用的緩沖液還有抗凝劑?？鼓齽┦且环N能夠阻止血液凝固的緩沖液，它在進(jìn)行甲殼動(dòng)物血細(xì)胞等相關(guān)研究時(shí)是必不可少的[23-24]。一般甲殼動(dòng)物應(yīng)用較為廣泛的抗凝劑配方為0.45 mol/L NaCl，0.1 mol/L葡萄糖，30 mmol/L檸檬酸鈉，26 mmol/L檸檬酸，10 mmol/L EDTA[25]，其中的檸檬酸鈉、ETDA為主要的抗凝成分，通過螯合血淋巴中的Ca2+達(dá)到抗凝目的[24]，隨后相關(guān)的抗凝劑基本上都是在此基礎(chǔ)上發(fā)展而來，如中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[26]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[27]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[28]等。但是，不同的甲殼動(dòng)物的滲透壓也是不同的，它會(huì)隨著物種的差異、環(huán)境的改變而變化[19]，所以直接使用同一種抗凝劑配方也可能存在問題。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用常規(guī)PBS作為緩沖液來處理螯蝦和對(duì)蝦的血細(xì)胞,會(huì)造成細(xì)胞死亡率偏高、細(xì)胞狀態(tài)不好的現(xiàn)象。而這可能就是由于緩沖液滲透壓與體液滲透壓不一致引起的高滲或低滲對(duì)細(xì)胞造成的影響。

本研究以紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)、克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)3種實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象，優(yōu)化相應(yīng)的緩沖液配方。旨在通過改變NaCl的濃度來調(diào)整抗凝劑等緩沖液的滲透壓，使其與體液滲透壓近似，從而減緩?fù)獠凯h(huán)境對(duì)細(xì)胞的刺激，維持細(xì)胞正常的生理狀態(tài)，降低其死亡率。而結(jié)果表明優(yōu)化后的緩沖液能有效保持細(xì)胞的活性，更有利于細(xì)胞培養(yǎng)、核酸蛋白抽提等一系列后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

紅螯螯蝦購(gòu)于廣東省汕頭市，凡納濱對(duì)蝦、克氏原螯蝦購(gòu)于廈門市第八市場(chǎng)，購(gòu)買后暫養(yǎng)1周直至穩(wěn)定，期間每隔1 d換水喂食。Propidium Iodide(PI)購(gòu)買于生工生物工程有限公司，其余藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 滲透壓測(cè)量

選取健康的紅螯螯蝦、克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦各5只，用75%酒精擦拭消毒。用1 mL注射器從腹部第一節(jié)進(jìn)針，抽取500 μL血淋巴于1.5 mL離心管中，4 ℃過夜。隨后4 ℃，7 500 r/min離心20 min，吸取清液(即血清)。血清制備完成之后，用冰點(diǎn)滲透壓儀(L?ser，OM806)分別測(cè)試紅螯螯蝦、克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦血清的滲透壓。同時(shí)一并測(cè)量本實(shí)驗(yàn)室目前使用的抗凝劑(140 mmol/L NaCl，100 mmol/L葡萄糖，30 mmol/L檸檬酸，26 mmol/L檸檬酸鈉，10 mmol/L EDTA，pH 5.8)和PBS(140 mmol/L NaCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，2.7 mmol/L KCl)的滲透壓。

1.3 緩沖液配制

分別計(jì)算血清與目前使用的抗凝劑、PBS的滲透壓差值，以NaCl做為改變緩沖液滲透壓的溶質(zhì)。根據(jù)公式：

(1)

(2)

式(1)至(2)中:ΔΠ為毫滲透壓摩爾濃度差值(mOsmol/kg);Δm為溶質(zhì)質(zhì)量差值(g);M為摩爾質(zhì)量(g/mol);a為溶質(zhì)的離子數(shù);Δc為溶質(zhì)濃度差值(mmol/L);V為溶液體積(L)。

計(jì)算出理論上緩沖液滲透壓與血清滲透壓相等情況下所需要NaCl的濃度差值Δc，進(jìn)而算出配制所需要的NaCl濃度；并根據(jù)這個(gè)理論值，設(shè)置NaCl濃度梯度。緩沖液的其他成分不變，依據(jù)設(shè)置好的NaCl濃度梯度，配制具有不同滲透壓的抗凝劑以及PBS緩沖液。此時(shí)，設(shè)含140 mmol/L NaCl的抗凝劑和含140 mmol/L NaCl的PBS分別為未優(yōu)化組。

1.4 血細(xì)胞死亡率統(tǒng)計(jì)

選取健康的紅螯螯蝦、克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦，用1 mL注射器抽取250 μL“1.3”中配制的具有不同滲透壓的抗凝劑后，抽取血淋巴(抗凝劑與血淋巴的體積比為1∶1)待用。樣品分別室溫放置15、30 min，然后加入PI至終濃度為5 μg/mL，室溫染色2 min。隨后用直徑70 μm的濾網(wǎng)過濾染色的血淋巴，濾出液用流式細(xì)胞儀(BD FASC Calibur)分析血細(xì)胞在抗凝劑中的死亡率。

如上所述，抽取血淋巴(使用對(duì)應(yīng)的最優(yōu)抗凝劑，抗凝劑和血淋巴體積比為1∶1)，2 000 r/min水平離心3 min，去上清液，然后用“1.3”中配制的具有不同滲透壓的PBS緩沖液重懸，孵育一段時(shí)間后用流式細(xì)胞儀測(cè)定血細(xì)胞在PBS中的死亡率。同時(shí)，以上實(shí)驗(yàn)均使用熒光顯微鏡(Leica)觀察血細(xì)胞的PI染色結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有血細(xì)胞死亡率數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=5)表示，并使用Origin軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05時(shí)表示具有差異顯著，用星號(hào)“*”表示(“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01,“***”表示P<0.001)。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲殼動(dòng)物血清及常用緩沖液滲透壓的測(cè)定

本研究首先測(cè)定了紅螯螯蝦、克氏原螯蝦，與飼養(yǎng)在鹽度30海水中的凡納濱對(duì)蝦的血清滲透壓，以及目前本實(shí)驗(yàn)室正在使用的抗凝劑、PBS的滲透壓。結(jié)果如表1所示，紅螯螯蝦、克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦的血清滲透壓分別為(409±12)、(465±8)、(704±15) mOsmol/kg。而抗凝劑以及PBS的滲透壓則分別為(489±12)、(288±2) mOsmol/kg。

表1 紅螯螯蝦、克氏原螯蝦和凡納濱對(duì)蝦的血清滲透壓值Tab.1 Serum osmolality of C. quadricarinatus, P. clarkii and L. vannamei

2.2 緩沖液滲透壓的調(diào)整

由于在抗凝劑和PBS中，NaCl均為調(diào)節(jié)滲透壓的主要成分，因此我們通過改變NaCl的濃度來調(diào)節(jié)緩沖液滲透壓使之與血清滲透壓保持基本一致。根據(jù)“1.3”方法配置緩沖液，并測(cè)定新配制好的緩沖液的滲透壓值，最終結(jié)果如表2所示，對(duì)于紅螯螯蝦，含70 mmol/L NaCl的抗凝劑及含200 mmol/L NaCl的PBS的滲透壓值與其血清滲透壓值近似，分別為(411±5)、(411±12) mOsmol/kg；對(duì)于克氏原螯蝦，含100 mmol/L NaCl的抗凝劑以及含230 mmol/L NaCl的PBS的滲透壓值與其血清滲透壓值近似，分別為(468±3)、(460±1) mOsmol/kg；而對(duì)于凡納濱對(duì)蝦，則是含220 mmol/L NaCl的抗凝劑以及含360 mmol/L NaCl的PBS的滲透壓值與其血清滲透壓值近似，分別為(704±4)、(701±1)mOsmol/kg。

表2 各物種改進(jìn)后緩沖液滲透壓值Tab.2 Optimized buffer osmolality for C. quadricarinatus,P. clarkii and L. vannamei

2.3 緩沖液對(duì)血細(xì)胞存活情況的影響

研究進(jìn)一步分析了血細(xì)胞在不同滲透壓的緩沖液中的存活情況，評(píng)估不同滲透壓緩沖液對(duì)細(xì)胞的影響。一般來說，進(jìn)行甲殼動(dòng)物細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，時(shí)間通常不會(huì)太長(zhǎng)，因此將血細(xì)胞在緩沖液中的時(shí)間設(shè)置為15、30 min。其中，抗凝劑的測(cè)定實(shí)驗(yàn)直接用預(yù)裝了抗凝劑的注射器抽取血淋巴(抗凝劑與血淋巴的體積比為1∶1)并混勻，分別室溫靜置15、30 min，隨后進(jìn)行PI染色并測(cè)試死亡率。PBS的測(cè)定實(shí)驗(yàn)在確定最優(yōu)抗凝劑配方之后，抽取血淋巴，按體積比1∶1與該抗凝劑混合，立即離心，用PBS重懸細(xì)胞，同樣室溫靜置15、30 min后測(cè)定細(xì)胞死亡率。

首先，可以發(fā)現(xiàn)無(wú)論是紅螯螯蝦、克氏原螯蝦還是凡納濱對(duì)蝦，抗凝劑對(duì)其血細(xì)胞的影響都不會(huì)隨滲透壓的改變而有明顯的變化(圖1至圖6)。在紅螯螯蝦中，抗凝劑優(yōu)化前后的血細(xì)胞死亡率基本都維持在0.5%(靜置15 min)和1.0%(靜置30 min)左右，優(yōu)化前后沒有顯著性差異[P>0.05，圖1(a)、(b),圖2(a)]。而在克氏原螯蝦中，其血細(xì)胞在未優(yōu)化的抗凝劑中以及含100 mmol/L NaCl的抗凝劑中的死亡率均分別為0.5%(靜置15 min)和1.0%(靜置30 min)左右。雖然與未優(yōu)化的抗凝劑和含100 mmol/L NaCl的抗凝劑中的死亡率相比，它在含110、120 mmol/L NaCl的抗凝劑時(shí)的死亡率較高，但是優(yōu)化前后并沒有顯著性差異[P>0.05,圖3(a)、(b),圖4(a)]。最后，在凡納濱對(duì)蝦中，抗凝劑優(yōu)化前后的血細(xì)胞死亡率則基本都維持在0.8%(靜置15 min)和1.5%(靜置30 min)左右，優(yōu)化前后同樣沒有顯著性差異[P>0.05,圖5(a)、(b),圖6(a)]。因此，我們認(rèn)為抗凝劑的滲透壓對(duì)于血細(xì)胞的影響并不顯著。

圖1 紅螯螯蝦血細(xì)胞死亡率Fig.1 Mortality rate of haemocyte from C. quadricarinatus(a)與(b)分別在具有不同滲透壓值的抗凝劑中15、30min時(shí)的死亡率；(c)與(d)分別為在具有不同滲透壓值的PBS中15、30 min時(shí)的死亡率。死亡率表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5，同時(shí)進(jìn)行單因素方差分析，“*”表示具有顯著性差異(P<0.05)，下同。

而PBS的滲透壓變化則能顯著影響血細(xì)胞的存活狀態(tài)。無(wú)論是紅螯螯蝦、克氏原螯蝦還是凡納濱對(duì)蝦，它們的血細(xì)胞在未優(yōu)化的PBS中的死亡率均達(dá)到最高，靜置15 min時(shí)，紅螯螯蝦、克氏原螯蝦、凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞的死亡率分別為4.5%[圖1(c)]、2.2%[圖3(c)]、10.0%[圖5(c)]，靜置30 min時(shí)，則分別上升到4.8%[圖1(d)]、2.8%[圖3(d)]、21.2%[圖5(d)]。在紅螯螯蝦中，血細(xì)胞死亡率在含200 mmol/L NaCl的PBS中達(dá)到最低，靜置15 min時(shí)為1.0%，與未優(yōu)化的PBS相比具有顯著性差異[P<0.01,圖1(c)]，靜置30 min時(shí)為1.1%，也具有顯著性差異 [P<0.05,圖1(d)]。在

圖2 紅螯螯蝦血細(xì)胞在優(yōu)化前后的抗凝劑與PBS中死亡率的流式細(xì)胞儀檢測(cè)與熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig.2 Mortality rates of haemocyte from C. quadricarinatus observed with flow cytometry and fluorescence microscope in anticoagulant and PBS before and after optimization(a)和(b)分別表示血細(xì)胞在優(yōu)化前后抗凝劑和PBS中15、30 min時(shí)的死亡率;流式分析散點(diǎn)圖中，縱坐標(biāo)表示顆粒度，橫坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，紅色矩形R2區(qū)域表示分布的死亡血細(xì)胞；鏡檢圖中，死亡血細(xì)胞經(jīng)PI染色呈紅色，Bar=10 μm，下同。

圖3 克氏原螯蝦血細(xì)胞死亡率Fig.3 Mortality rate of haemocyte from P. clarkii

克氏原螯蝦中，血細(xì)胞死亡率在含230 mmol/L NaCl的PBS中達(dá)到最低，靜置15、30 min時(shí)分別為0.5%、0.7%，與未優(yōu)化的PBS相比均具有顯著性差異[P<0.001,圖3(c)、(d)]。而在凡納濱對(duì)蝦中，血細(xì)胞死亡率則在含360 mmol/L NaCl的PBS中達(dá)到最低，靜置15、30 min時(shí)分別為1.2%、2.1%，其與未優(yōu)化的PBS相比同樣均具有顯著性差異[P<0.001,圖5(c)、(d)]。同時(shí)，熒光顯微鏡觀察結(jié)果也與以上結(jié)果基本保持一致[圖2(b)、圖4(b)、圖6(b)]。

圖4 克氏原螯蝦血細(xì)胞在優(yōu)化前后的抗凝劑與PBS中死亡率的流式細(xì)胞儀檢測(cè)與熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig.4 Mortality rates of haemocyte from P. clarkii observed with flow cytometry and fluorescence microscope in anticoagulant and PBS before and after optimization

圖5 凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞死亡率Fig.5 Mortality rates of haemocyte from L. vannamei

圖6 凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞在優(yōu)化前后的抗凝劑與PBS中死亡率的流式細(xì)胞儀檢測(cè)與熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig.6 Mortality rates of haemocyte from L. vannamei observed with flow cytometry and fluorescence microscope in anticoagulant and PBS before and after optimization

2.4 確定緩沖液配方

最終確定紅螯螯蝦抗凝劑(Cq-抗凝劑)中NaCl的濃度取70 mmol/L，PBS(Cq-PBS)中NaCl的濃度取200 mmol/L；克氏原螯蝦抗凝劑(Pc-抗凝劑)中NaCl的濃度取100 mmol/L，PBS(Pc-PBS)中NaCl的濃度取230 mmol/L；鹽度30時(shí)，凡納濱對(duì)蝦抗凝劑(Lv-抗凝劑)中NaCl的濃度取220 mmol/L，PBS(Lv-PBS)中NaCl的濃度取360 mmol/L(表3)。

表3 優(yōu)化后的抗凝劑與PBS配方Tab.3 Optimized formulation of anticoagulant and PBS

2.5 討論

抗凝劑與PBS是我們進(jìn)行甲殼動(dòng)物細(xì)胞研究時(shí)必不可少的兩種緩沖液，其中抗凝劑起到阻止血淋巴凝固的作用，而PBS則能提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的緩沖體系。但是，以往許多研究在使用這兩種緩沖液時(shí)，對(duì)于抗凝劑通常只注重它對(duì)于血淋巴的抗凝效果，而對(duì)于PBS更是直接沿用適用于哺乳動(dòng)物等其他物種的緩沖配方，往往忽略了緩沖液滲透壓這個(gè)指標(biāo)以及其是否適用于甲殼動(dòng)物[3-4,7,29]。這使得我們?cè)谶M(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，讓細(xì)胞暴露在一個(gè)滲透壓不同于體液滲透壓的環(huán)境中，這在一定程度上會(huì)影響細(xì)胞生理狀態(tài)，進(jìn)而影響包括RNA提取、蛋白抽提、原代培養(yǎng)等在內(nèi)的后續(xù)一系列的實(shí)驗(yàn)操作。因此本研究的目的在于通過改變抗凝劑以及PBS中NaCl的濃度使其滲透壓值接近甲殼動(dòng)物體內(nèi)體液的滲透壓值，營(yíng)造出一個(gè)滲透壓接近真實(shí)體液環(huán)境的緩沖體系，使得包括血細(xì)胞在內(nèi)的眾多細(xì)胞在體外時(shí)也能處于類似于生物真實(shí)體內(nèi)環(huán)境的體系中，而這將有利于我們后續(xù)的眾多實(shí)驗(yàn)。

從整體的結(jié)果來看，抗凝劑滲透壓對(duì)于血細(xì)胞的影響較小，在一定范圍內(nèi)改變抗凝劑的滲透壓，紅螯螯蝦與凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞死亡率也沒有明顯的變化；而克氏原螯蝦的血細(xì)胞死亡率雖然稍有波動(dòng)，但是它在優(yōu)化前后的抗凝劑中的死亡率同樣也沒有顯著性差異。然而PBS對(duì)于紅螯螯蝦、克氏原螯蝦和凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞的影響則比較明顯。上述甲殼動(dòng)物的血細(xì)胞對(duì)于PBS的滲透壓均比較敏感，它們?cè)谖锤淖儩B透壓的PBS中的死亡率均達(dá)到最高，而在調(diào)節(jié)PBS滲透壓至接近血清滲透壓后，其死亡率全部降至最低。并且紅螯螯蝦、克氏原螯蝦和凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞在未優(yōu)化PBS中的死亡率分別約是優(yōu)化后PBS中的死亡率的4.5、4.0、10.0倍，優(yōu)化前后具有顯著性差異。研究表明，當(dāng)外界環(huán)境鹽度變化時(shí)，中華絨螯蟹、克氏原螯蝦等甲殼動(dòng)物能夠明顯調(diào)節(jié)自身的血淋巴滲透壓以保持等滲，從而維持正常生理活動(dòng)[30-31]。這說明甲殼動(dòng)物細(xì)胞無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外對(duì)于滲透壓的感知都有相當(dāng)?shù)拿舾行裕S持PBS等緩沖液滲透壓與血淋巴滲透壓等滲，這對(duì)于甲殼動(dòng)物細(xì)胞在體外保持正常狀態(tài)具有十分重要的意義。

3 結(jié)論

在綜合比較各物種血細(xì)胞在不同NaCl濃度抗凝劑和PBS中孵育一段時(shí)間后的死亡率以及滲透壓后，我們最終確定對(duì)于紅螯螯蝦抗凝劑中NaCl的濃度取70 mmol/L，PBS中NaCl的濃度取200 mmol/L；對(duì)于克氏原螯蝦抗凝劑中NaCl的濃度取100 mmol/L，PBS中NaCl的濃度取230 mmol/L；而鹽度30時(shí)，對(duì)于凡納濱對(duì)蝦抗凝劑中NaCl的濃度取220 mmol/L，PBS中NaCl的濃度取360 mmol/L。

綜上所述，通過調(diào)節(jié)緩沖液的滲透壓使其接近體液滲透壓，能顯著改善細(xì)胞狀態(tài)并降低細(xì)胞在體外時(shí)的死亡率。而這能大大提高我們實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，尤其是在涉及活細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，比如體外吞噬實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞的原代培養(yǎng)等等。優(yōu)化后的緩沖液能更好地為我們的實(shí)驗(yàn)服務(wù)。