基于測(cè)量不確定度評(píng)定啤酒中雙乙酰合格率的研究

郭 勝，閆俊鋒，楊 瑩，徐 程，李文慧，黃婷婷，介恬靜，龔 琛，朱桂生

（1.襄陽(yáng)市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北襄陽(yáng) 441000；2.榆林市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西榆林 719000）

雙乙酰是酵母進(jìn)行纈氨酸合成代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物（α-乙酰乳酸）積累并分泌到酵母細(xì)胞外，通過(guò)氧化脫羧反應(yīng)而產(chǎn)生[1]，屬于啤酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的不良風(fēng)味物質(zhì)[2]。在啤酒中,雙乙酰的風(fēng)味閾值為0.15 mg/L，飲用雙乙酰含量超標(biāo)的啤酒時(shí)會(huì)有一種餿飯味，嚴(yán)重影響口感[3]。為保證啤酒的良好風(fēng)味，雙乙酰已成為啤酒的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。

測(cè)量往往會(huì)產(chǎn)生測(cè)量不確定度[4-5]，啤酒中雙乙酰的測(cè)量也不例外。當(dāng)存在測(cè)量不確定度時(shí)，真值在一定的置信概率下落在“測(cè)量值±測(cè)量不確定度”所構(gòu)成的區(qū)間里[6]。當(dāng)測(cè)量值處在容許限附時(shí)，真值可能落在限量值內(nèi)，也可能超出限量值，這時(shí)測(cè)量值有一定的合格概率，測(cè)量結(jié)果的符合性判定存在一定的誤判概率[7]。CNAS-TRL-010：2019《測(cè)量不確定度在符合性判定中的應(yīng)用》[8]給出了通過(guò)測(cè)量不確定度評(píng)定合格概率的理論以及詳細(xì)計(jì)算步驟。

啤酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4927—2008《啤酒》[9]規(guī)定啤酒中雙乙酰的檢驗(yàn)方法為GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[10]，GB/T 4928—2008[10]中雙乙酰的檢驗(yàn)采用紫外分光光度法。紫外分光光度法定量分析的常規(guī)方法是先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品濃度。GB/T 4928—2008[10]中雙乙酰的測(cè)定方法并沒(méi)有繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而是直接測(cè)定樣品吸光值求得的雙乙酰含量，在這種情況下如何計(jì)算紫外分光光度計(jì)引入的不確定度是當(dāng)前需要解決的問(wèn)題。目前針對(duì)這類(lèi)測(cè)量不確定度評(píng)定的研究很少，本次測(cè)量不確定度評(píng)定對(duì)單次測(cè)量吸光度得到測(cè)量結(jié)果的檢驗(yàn)具有一定的參考意義。在測(cè)量不確定度評(píng)定之后，本研究基于測(cè)量不確定度計(jì)算了啤酒中雙乙酰含量的合格概率，并給出了計(jì)算指定合格概率下，啤酒中雙乙酰的控制方法。本研究對(duì)啤酒生產(chǎn)企業(yè)控制雙乙酰含量具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：啤酒（一級(jí)），市售。

試劑：鹽酸（分析純），西隴科學(xué)股份有限公司；鄰苯二胺（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2550），日本島津公司；AG135 電子天平（Max=101 g，d=0.1 mg），METTLER TOLEDO Made in Switzerland。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 啤酒中雙乙酰的測(cè)定方法[10]

安裝好雙乙酰蒸餾器，將蒸氣發(fā)生瓶加熱至沸騰。通氣預(yù)熱，將25 mL 容量瓶置于冷凝器出口收集餾出液。在100 mL量筒中加入1滴消泡劑，加入未經(jīng)除氣、冷卻至5 ℃的啤酒試樣100 mL，立即轉(zhuǎn)移至蒸餾器內(nèi)蒸餾，在3 min內(nèi)完成樣品蒸餾，收集餾出液至25 mL容量瓶中，定容，搖勻。

吸取10 mL 餾出液于2 支25 mL 比色管中，于其中1支比色管中加入鄰苯二胺溶液0.5 mL，另1支不加，作為空白。蓋塞搖勻，置于暗處反應(yīng)20 min。于樣品管中加4 mol/L 鹽酸溶液2 mL，于空白管中加4 mol/L 鹽酸溶液2.5 mL，蓋塞混勻。用10 mm石英比色皿，在335 nm 下，以空白管做參比，測(cè)定試樣的吸光度。

1.2.2 啤酒中雙乙酰的測(cè)量不確定度評(píng)定

依據(jù)JJF 1059.1—2012[6]評(píng)定不確定度。

1.2.3 啤酒中雙乙酰的合格概率評(píng)定

依據(jù)CNAS-TRL-010：2019[8]中的計(jì)算公式計(jì)算合格概率。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒中雙乙酰含量的測(cè)量結(jié)果

在重復(fù)性條件下，對(duì)樣品進(jìn)行10 次測(cè)量，測(cè)量結(jié)果分別為0.120 mg/L、0.139 mg/L、0.162 mg/L、0.131 mg/L、0.157 mg/L、0.170 mg/L、0.146 mg/L、0.132 mg/L、0.150 mg/L、0.126 mg/L，測(cè)量平均值為0.143 mg/L，吸光度平均值為：0.0597。

2.2 測(cè)量不確定度的評(píng)定

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中雙乙酰含量的數(shù)學(xué)模型為：

式中：X 為試樣中雙乙酰的含量(mg/L)；A 為樣品吸光度；2.4為吸光度與雙乙酰含量的換算系數(shù)。

2.2.2 測(cè)量不確定度來(lái)源分析

分析檢驗(yàn)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型，試樣中雙乙酰含量的測(cè)量不確定度來(lái)源見(jiàn)圖1。

圖1 啤酒中雙乙酰含量的測(cè)量不確定度來(lái)源

2.2.3 取樣體積引入的相對(duì)不確定度Urel(V1)

查詢JJG 130—2011《工作用玻璃液體溫度計(jì)》[11]，100 mL 量筒量取5 ℃的酒樣時(shí)，溫度計(jì)測(cè)量酒樣的溫度誤差為±0.5 ℃；酒樣的膨脹系數(shù)按照水膨脹系數(shù)考慮，為2.1×10-4℃-1；溫度波動(dòng)引入的誤差按照均勻分布考慮，包含因子k取。

查詢JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[12]，得到玻璃量器的容量允差。CNAS-GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[13]推薦玻璃量器的容量誤差概率密度函數(shù)采用三角分布,包含因子k取。

記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)為20 ℃±4 ℃。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由玻璃量器容量誤差與溫度誤差引入的相對(duì)不確定度見(jiàn)表1。

表1 玻璃量器容量誤差與溫度誤差引入的相對(duì)不確定度

由檢驗(yàn)過(guò)程取樣體積引入的不確定度來(lái)自（1）100 mL量筒量取100 mL酒樣引入的誤差；（2）25 mL容量瓶定容體積誤差；（3）移液管吸取10 mL 餾出液的體積誤差。

取樣體積引入的相對(duì)不確定度Urel(V1)：

2.2.4 定容體積引入的相對(duì)不確定度Urel(V2)

由檢驗(yàn)過(guò)程可知用于比色的液體總體積（定容體積）引入的不確定度來(lái)自（1）移液管吸取10 mL餾出液的體積誤差；（2）移液管吸取0.5 mL 鄰苯二胺溶液的體積誤差；（3）移液管吸取2 mL的4 mol/L鹽酸溶液的體積誤差。

定容體積引入的相對(duì)不確定度urel(V2)：

2.2.5 分光光度計(jì)引入的不確定度

朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式在JJG 178—2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)檢定規(guī)程》[14]條款“3 概述”中有具體定義，數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A1=-lgT；式中：A1為吸光度；T為透射比。

對(duì)試樣重復(fù)測(cè)量10 次，10 次測(cè)量的平均吸光度為0.0597，代入公式，計(jì)算得出透射比T 的平均值為0.8752。分光光度計(jì)計(jì)量性能級(jí)別為Ⅱ級(jí)，檢定合格，查詢JJG 178—2007[14]得知儀器透射比最大誤差為±0.5%，誤差概率密度函數(shù)分布假設(shè)為均勻分布，包含因子k取。則由儀器透射比引入的不確定度為u(T)==2.526×10-3。

吸光度的靈敏度系數(shù)：

分光光度計(jì)誤差引入的不確定度分量：

2.2.6 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度分量[6]

重復(fù)性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度：

測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度：

2.2.7 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.8 標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.9 擴(kuò)展不確定度和結(jié)果表示

在95 %包含概率下，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度：U＝k×u＝2×0.006＝0.012 mg/L。

雙乙酰含量測(cè)量結(jié)果表示為：X＝(0.143±0.012)mg/L，k＝2。

2.3 計(jì)算雙乙酰含量的合格概率

查詢啤酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4927—2008[9]，得到一級(jí)啤酒雙乙酰的限量值為≤0.15 mg/L，依據(jù)CNAS-TRL-010：2019[8]中的合格概率公式，求得合格概率：

查閱GB 4086.1—1983《統(tǒng)計(jì)分布數(shù)值表正態(tài)分布》[15]標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布表，合格概率Pc=87.9%。

3 結(jié)論與討論

GB/T 4928—2008[10]中雙乙酰的測(cè)定方法并沒(méi)有繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線而是直接測(cè)定樣品吸光值求得雙乙酰含量，對(duì)于其測(cè)量不確定度的評(píng)定，本研究通過(guò)朗伯-比爾定律計(jì)算公式解決了這一問(wèn)題。本次測(cè)量不確定度的評(píng)定過(guò)程對(duì)與同類(lèi)型檢驗(yàn)的測(cè)量不確定度評(píng)定也具有一定參考意義。

本次測(cè)量測(cè)量值小于限量值，在不考慮測(cè)量不確定度時(shí)，符合性判定可判定為合格；在考慮測(cè)量不確定度時(shí)，測(cè)量真值在95 %的置信概率下處于區(qū)間[0.131,0.155]。同樣的樣本，經(jīng)由其他實(shí)驗(yàn)室測(cè)量或者改變測(cè)量條件時(shí)，測(cè)量值可能超過(guò)0.15 mg/L，此時(shí)就有可能給出不合格的符合性判斷結(jié)論。依據(jù)上文中計(jì)算，啤酒試樣中雙乙酰合格概率為87.9%，所以有12.1%的概率超過(guò)0.15 mg/L。

為便于啤酒生產(chǎn)企業(yè)控制雙乙酰的含量，以確保在給定的合格概率下符合性判定為合格，給定一個(gè)合格概率，計(jì)算出雙乙酰的控制值是迫切需要關(guān)注的問(wèn)題，接下來(lái)展開(kāi)討論：

CNAS-TRL-010：2019[8]步驟5.4 指出：在通常情況下選取95 %合格概率下的保護(hù)帶。查詢GB 4086.1—1983[15]中的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布表，當(dāng)合格概率大于95%時(shí)，函數(shù)取值需≥1.65，若測(cè)量不確定度按照本次的評(píng)定值來(lái)考慮，則≥1.65，求得y≤1.49 mg/L。也就是說(shuō)當(dāng)雙乙酰的測(cè)量值≤1.49 mg/L時(shí)，雙乙酰含量的合格概率≥95%。

對(duì)于啤酒或者白酒等產(chǎn)品質(zhì)量控制中的其他檢驗(yàn)項(xiàng)目（如酒精度、原麥汁、總酸、氰化物、甜蜜素、甲醇等），企業(yè)可以根據(jù)實(shí)際工作需要確定其合格概率，參考文中的方法制定控制值。