胞內菌與宿主自噬的相互作用

吳移謀， 黃燕茹， 盧思敏， 王建業(yè)

(南華大學衡陽醫(yī)學院病原生物學研究所，湖南省衡陽市421001)

自噬是一種保守的細胞降解途徑，由自噬相關基因(autophagy-related genes，ATG)編碼的蛋白介導。自噬發(fā)生時，會在錯誤折疊的蛋白質，功能失調的細胞器或入侵的病原體等細胞質組分周圍形成雙層膜結構的囊泡(自噬體)，將其包裹并轉運至溶酶體進行降解。這些物質被溶酶體蛋白酶降解成氨基酸和脂肪酸等小分子物質后，被細胞循環(huán)利用，進而維持細胞穩(wěn)態(tài)[1]。自噬不僅有利于細胞分解代謝，也是抵抗病原體感染的重要防御機制，自噬體捕獲入侵的細菌，將其遞送到溶酶體中進行降解，限制病原體在細胞內的生存與繁殖[2]。而另一方面，胞內菌也演化出了一系列逃逸宿主細胞自噬的策略。甚至一些胞內菌可調控自噬，利用自噬機制形成復制生態(tài)位，促進自身在細胞內的生長。隨著細胞自噬在病原體感染過程中的研究進展，發(fā)現(xiàn)胞內菌與宿主細胞自噬的相互作用復雜多變。全面系統(tǒng)的闡明自噬發(fā)生發(fā)展的分子機制以及與胞內菌的相互作用將有助于理解胞內菌感染的免疫逃逸機制，為胞內菌感染治療提供理論基礎和有效的治療靶點。

1 細胞自噬

1.1 細胞自噬的分類

自噬分為經典自噬與非經典自噬。其中，根據自噬底物的特點、轉運類型及調控機制的不同，經典自噬可分為分子伴侶介導的自噬、微自噬和巨自噬[3]。巨自噬即通常所指的自噬(下文簡稱自噬)，在遺傳學中定義為依賴于ATG調控，在形態(tài)學上表現(xiàn)為雙層膜結構的自噬體在細胞質中出現(xiàn)且能與溶酶體融合[4]。自噬從酵母到哺乳動物體內均是高度保守的，可分為以下幾個步驟：自噬信號誘導，前體物質形成，吞噬泡延伸，自噬體與溶酶體的融合以及自噬溶酶體的降解[5]。

而非經典自噬途徑主要是指以胞內大分子為目標的LC3相關吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)。細胞吞噬病原體后，將其隔離在LC3陽性的單膜隔室中，稱為LAPosome。LAPosome將病原體運輸至溶酶體進行降解并清除。細胞自噬水平與感染性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，其中巨自噬和LAP在抗病原體感染中發(fā)揮重要作用。因此，本文主要討論巨自噬與LAP在細胞防御中的作用[6]。

1.2 細胞自噬的發(fā)生與調控

自噬體的誘導受到一系列信號通路的嚴格調控，包括ATG蛋白的亞細胞定位和翻譯后修飾。ULK-51樣激酶1(UNC-51-like kinase 1，ULK1)復合物是自噬信號起始復合物，主要受到哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin complex 1，mTOR)和腺苷酸激活激酶(AMP-activated kinase，AMPK)兩個上游因子的調節(jié)[7]。在細胞內營養(yǎng)充足的情況下，mTOR具有活性，通過磷酸化ULK1 Ser 757抑制自噬。當細胞內營養(yǎng)缺乏或病原體感染時，mTOR處于非活性狀態(tài)，AMPK通過磷酸化ULK1的Ser 317和Ser 777啟動自噬體形成[8]。同時，ULK復合物調節(jié)Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3，PI3KC3)復合物的磷酸化和募集，進而促進磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phophate，PI3P)的產生，并在內質網-線粒體接觸位點開始形成吞噬泡，完成吞噬體前體物質的合成。

兩種獨立泛素樣連接系統(tǒng)(ubiquitin-like conjugation，UBL)控制ATG12-ATG5-ATG16L1復合物和(LC3-phosphatidylethanomine，LC3-PE)的產生，這對于吞噬泡的伸長和閉合至關重要。ATG16L復合物促進LC3-PE的形成，并將LC3-PE錨定在自噬體膜上。ATG4可解偶聯(lián)一部分LC3-PE復合物，從而促進LC3的再循環(huán)，以形成新的自噬體。最終，在Rab7，syntaxin 17，囊泡相關膜蛋白8(vesicle-associated membrane protein 8，VAMP8)和溶酶體相關膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2，LAMP2)等多種蛋白的參與下，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體[8]。自噬溶酶體內容物被肽酶、脂肪酶和水解酶降解后再循環(huán)回細胞質。

2 細胞利用自噬抵抗胞內菌感染

2.1 異體自噬

巨自噬可分為選擇性自噬和非選擇性自噬。選擇性自噬靶向特定的底物進行降解。根據選擇性自噬降解的底物來劃分，選擇性自噬包括：聚集體自噬，脂噬，溶酶體自噬，線粒體自噬，過氧化物酶體自噬和異體自噬等[8]。其中異體自噬作為抵抗細菌感染的先天免疫機制，可以靶向胞內細菌以限制它們的生長。

當胞內菌逃逸到細胞質或含病原體的液泡(pathogen-containing vacuole，PV)受損時，暴露的微生物會被E3連接酶識別并泛素化[9-11]。隨后，線性聚泛素體在細菌上沉積，誘導IKKα/IKKβ活化并最終激活NF-κB通路，促進促炎細胞因子的分泌以限制細菌生長[12-13]。除泛素化外，自噬受體NDP52還可與半乳糖凝集素8結合，半乳糖凝集素8是一種胞質凝集素，可在囊泡受損時識別暴露于胞質的β-半乳糖苷[14]。多種受體分子在細菌附近募集自噬蛋白以構建有利于自噬體形成的支架。

此外，細胞表面模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別并結合病原微生物特定的分子結構，激活下游信號通路，誘導異體自噬。Toll樣受體(Tolllike receptors，TLRs)是一種經典的PRR，病原體激活TLRs后，髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)和β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)與Beclin-1相互作用，破壞Beclin-1與Bcl2的結合，從而誘導自噬的發(fā)生。核苷酸結合寡聚結構域蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain protein 1，NOD1)和NOD2是可識別細菌肽聚糖的胞內識別受體，可直接將ATG16L1募集至胞內病原體來誘導異體自噬發(fā)生[15]。而當胞內菌在細胞內過度繁殖引起細胞氨基酸缺乏時，細胞也可通過抑制mTOR觸發(fā)異體自噬，限制胞內菌的生長。

2.2 LC3相關吞噬作用

在吞噬細胞的TLR或Fc受體介導的吞噬過程中，自噬組分(LC3，beclin-1，PtdIns3KC3和ATG12-ATG5)易位至吞噬體膜，促進吞噬體與溶酶體的融合。該過程不涉及雙膜自噬體的形成，被稱為LAP。LAP需要PI3K活性和LC3綴合機制，但與常規(guī)自噬不同，LAP依賴于由NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)和Rubicon產生的活性氧[16]，而不需要ULK1復合物。研究表明，LAP是抵抗多種病原體的有效宿主防御機制。例如，肺炎鏈球菌成孔毒素溶血素(pore-forming toxin pneumolysin，PLY)誘導小鼠巨噬細胞發(fā)生LAP，LAP可限制肺炎鏈球菌在細胞內的生長[17]。巨噬細胞通過LAP促進含單核細胞增生李斯特氏菌的吞噬體與溶酶體融合來清除單核細胞增生李斯特氏菌[18]。由此可見，LAP與異體自噬一樣在微生物防御和維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

2.3 非降解性自噬途徑

異體自噬和LAP都涉及自噬囊泡的酸化，與溶酶體融合后內容物的降解。然而，近期研究表明，自噬在宿主防御中具有獨立于溶酶體的功能，即通過非降解性自噬途徑來清除宿主細胞內病原體。其主要包括：自噬蛋白靶向(targeting by autophagy proteins，TAG)的作用和分泌性自噬[19]。

TAG主要指的是LC3綴合系統(tǒng)將IFN誘導型GTP酶等免疫效應物募集至PV膜上，靶向破壞PV中的病原體，而此過程與溶酶體融合無關[20]。在干擾素激活的細胞中，LC3偶聯(lián)系統(tǒng)將含有衣原體[21]的包涵體進行LC3標記，發(fā)動干擾素誘導型GTP酶、IRG酶和GBP酶靶向破壞LC3標記的包涵體。在分泌性自噬過程中，自噬蛋白和參與自噬底物靶向的三結構域(tripartite motif，TRIM)家族蛋白介導囊泡內病原體的清除。例如，致病性大腸桿菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)能夠中和膀胱上皮細胞溶酶體的酸性壞境而避免被自噬靶向降解，宿主細胞為清除胞內病原體，通過活化自噬蛋白TRPML3啟動溶酶體胞吐作用，誘導UPEC的排出，減少胞內細菌負荷[22]。因此，當自噬溶酶體降解被抑制時，分泌性自噬能夠替代異體自噬發(fā)揮作用。

3 胞內菌逃逸宿主細胞自噬

依據胞內菌在宿主細胞外增殖的能力，可將胞內菌分為兼性胞內菌和專性胞內菌兩類，其中兼性胞內菌可在宿主細胞外存活并復制。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)，許多細胞外病原體，如金黃色葡萄球菌和大腸桿菌能夠侵入哺乳動物細胞，在細胞內存活和繁殖[23]。為確保在宿主細胞內增殖，胞內菌需建立有效的策略來對抗細胞各種防御機制。針對自噬防御，細菌可通過以下幾個方面來抑制或操控自噬：抑制自噬信號的誘導；抑制自噬體的形成；阻斷自噬體與溶酶體的融合；利用宿主蛋白掩蓋自身以逃避自噬識別和利用細胞自噬進行繁殖[24]。

3.1 抑制自噬起始

一些細菌通過抑制自噬信號傳導逃避宿主自噬。例如，鼠傷寒沙門氏菌感染宿主后，依賴自身T3SS系統(tǒng)將宿主Sirt1，肝激酶B1和一磷酸腺苷激酶靶向溶酶體快速降解，導致mTOR被激活，抑制自噬的發(fā)生[25]。此外，鼠傷寒沙門氏菌效應因子SseF和SseG通過與宿主Rab1A GTP酶的相互作用抑制自噬起始。這種相互作用破壞了鳥嘌呤核苷酸交換因子與轉運蛋白顆粒Ⅲ復合物的相互作用，阻礙了Rab1A的激活，從而抑制了ULK1的募集和激活[26]。結核分枝桿菌分泌的促存活因子(enhanced intracellular survival,EIS)能促進宿主組蛋白H3的乙酰化，導致IL-10的上調和mTOR活化，進而抑制自噬起始[27]。

3.2 抑制自噬體的形成

參與自噬體形成的核心自噬機制是自噬消除細胞內細菌所必需的，一些細菌通過直接干擾核心自噬機制來操縱自噬。嗜肺軍團菌毒力因子RavZ通過水解LC3-PE中甘氨酸羧基與芳香族殘基之間的酰胺鍵，產生不能被ATG7和ATG3重新綴合的LC3蛋白，抑制自噬體的形成[28]。此外，軍團菌另一毒力因子Lpg1137可降解syntaxin 17，減少PI3P的形成，干擾自噬體的形成[29]。結核分枝桿菌可調節(jié)宿主細胞miRNA-155的表達，miRNA-155通過靶向人樹突細胞中的ATG3，破壞LC3的脂化和自噬體的形成[30]。

3.3 阻斷自噬體與溶酶體融合

自噬識別病原體后將其隔離在自噬體中，自噬體將病原菌轉運至溶酶體降解清除。細菌為避免自噬殺傷，可阻斷或延遲自噬體成熟為可降解的自噬溶酶體。例如，結核分枝桿菌效應物：磷酸酶SapM和激酶PknG抑制自噬體的成熟，促進結核分枝桿菌在宿主細胞中的存活和復制[31]。金黃色葡萄球菌通過激活MAPK14，將ATG5磷酸化，抑制自噬體與溶酶體的融合，使其在自噬體中復制后逃逸到細胞質中引起自噬依賴性細胞死亡[32]。除了影響自噬體與溶酶體的融合，直接影響溶酶體的正常功能也是病原菌干擾自噬的經典方式。副溶血弧菌三型效應蛋白VopQ能在溶酶體上形成離子通道，阻斷自噬流，導致自噬體的累積[33]。

3.4 掩飾細菌表面逃避自噬識別

為了對抗宿主防御系統(tǒng)，細菌對含有病原體的吞噬泡進行修飾來逃避自噬識別。研究表明，弗氏志賀氏菌毒力因子IcsB可通過干擾自噬靶向分子與宿主蛋白Atg5的相互作用，以及對宿主帶電多囊體蛋白5(charged multivesicular body protein 5，CHMP5)進行修飾，進而隱藏自身逃逸自噬[34-35]。腸道沙門氏菌去泛素化酶SseL可去除細胞對胞內沙門菌的泛素化修飾，影響受體蛋白p62的結合，抑制自噬對沙門菌的識別與清除[36]。此外，單核細胞增生李斯特氏菌毒力因子InlK和ActA蛋白共同作用，幫助單核細胞增生李斯特氏菌逃逸泛素識別和自噬靶向，其中，InlK將宿主主要拱頂?shù)鞍啄技良毦砻?，掩蓋胞質內細菌的自噬識別，ActA蛋白則通過募集宿主細胞骨架蛋白至細菌表面來掩蓋自身表面抗原[37]。

3.5 利用自噬進行自我復制

胞內寄生菌不僅能夠干擾自噬的形成與識別，還能借助自噬以利胞內生長和感染，例如貝納柯克斯體，土拉弗朗西斯菌等。大多數(shù)情況下，這些細菌主動誘導自噬，并阻斷自噬體與溶酶體的融合，利用自噬體作為其生長的復制生態(tài)位[24]。貝納柯克斯體是革蘭氏陰性專性胞內菌，吞噬溶酶體內低pH環(huán)境有助于其生殖代謝。研究表明，貝納柯克斯體空泡蛋白CvpF可特異性地與宿主GTP酶RAB26相互作用，將自噬體標記物LC3B募集到含貝納柯克斯體的囊泡上，進而有利于貝納柯克斯體的胞內存活[38]。土拉弗朗西斯菌感染小鼠胚胎成纖維細胞后，過度消耗細胞內營養(yǎng)物質，導致胞內氨基酸缺乏而誘導自噬，土拉弗朗西斯菌則利用該自噬過程降解宿主蛋白質產生氨基酸以維持自身生長和增殖[39]。

4 結語與展望

細胞自噬作為機體免疫防御的一部分，可通過異體自噬、LAP、非降解性自噬等途徑清除胞內病原菌。但由于細胞自噬在進化過程中具有高度的保守性，胞內病原菌逐漸進化出不同逃逸宿主自噬的機制，主要包括干擾自噬信號傳導、破壞自噬蛋白、利用毒力因子偽裝細菌表面、模擬自噬組分修飾物將自噬蛋白募集到細菌囊泡上以促進其生長。盡管對于胞內病原菌和宿主細胞自噬之間的相互作用機制研究已取得較大進展，但仍有問題亟待解決。例如，到目前為止，大多數(shù)研究都基于細菌-宿主體外系統(tǒng)來闡明細菌干擾宿主自噬的機制，從而可能過度簡化宿主先天反應，低估自噬與宿主其他信號通路之間的復雜交織。病原體與宿主細胞自噬之間的相互作用已成為近年來研究的熱點，了解病原體與自噬相互作用的機制為藥物設計和細菌感染的治療提供理論依據。