雄黃外用對三陰性乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用研究

王春暉,楚愛景,朱振宇,裴曉華

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)房山醫(yī)院,北京 102400;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)廈門醫(yī)院,福建 廈門 361001;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床學(xué)院,北京 100020)

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,乳腺癌的治療日臻成熟和完善,早期診斷和治療使乳腺癌患者獲益,但統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明:超過90%乳腺癌相關(guān)死亡并不是由于原發(fā)腫瘤引起的,而是因?yàn)槌霈F(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性乳腺癌通常被認(rèn)為是不能治愈的,因此治療后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的首要原因[1]。由此可見,抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移是提升療效和延長患者生存期的關(guān)鍵。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞失去上皮特征而獲得間質(zhì)特征,細(xì)胞黏附喪失,表型由典型的長方體變?yōu)榧?xì)長紡錘形,導(dǎo)致細(xì)胞遷移、侵襲、抗凋亡、免疫抑制等能力增強(qiáng)[2-3]。在乳腺癌轉(zhuǎn)移早期的原發(fā)腫瘤細(xì)胞中,隨著細(xì)胞增殖、微環(huán)境變化以及其他外部因素刺激等,EMT過程啟動(dòng),導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞表型發(fā)生變化、新血管生成和基底膜重建[4],細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng),進(jìn)而乳腺癌細(xì)胞可作為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)進(jìn)入血液或淋巴管系統(tǒng)[5],CTCs在血管和淋巴管中存活并突破屏障,發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化,腫瘤細(xì)胞重新獲得上皮細(xì)胞增殖特性,最終到肺、骨骼、大腦等部位,形成轉(zhuǎn)移灶[6]。由此可見,EMT在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中作用關(guān)鍵,抑制EMT發(fā)生是抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

中醫(yī)典籍中有關(guān)雄黃治療惡瘡及惡性腫瘤的治法由來已久,雄黃作為攻毒類中藥代表之一,具有拔毒化腐、祛瘀消癥功效,常用于治療癰腫疔瘡、癌性翻花,如將雄黃與青黛、三七配伍,研粉口服治療骨髓增殖性腫瘤[7];或使用雄黃外敷治療乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、腸癌等多種腫瘤潰破創(chuàng)面[8],均獲得良好效果。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，雄黃可通過上調(diào)凋亡因子Caspase-3、Bax、Bid,下調(diào)抑凋亡因子Survivin、Bcl-2抑制乳腺癌[9]。因此,我們設(shè)計(jì)本研究,進(jìn)一步探討雄黃抗乳腺癌的藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購于國家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫。

Balb/c雌性裸小鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量16～20 g,5～6周齡,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理號(hào):2021B129,飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要藥品 雄黃:主要成分為二硫化二砷,約200目,粒徑小于76 μm,純度98%,批號(hào)：140408(長沙市醫(yī)藥公司);卡培他濱片:0.5 g×12片,批號(hào):H20073024(上海羅氏制藥有限公司)。

1.2.2 主要試劑 1640培養(yǎng)基原液(Gibco,C11875500BT);胎牛血清(Gibco,10099-141);RIPA裂解液(艾旗,S1004);細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天,P0033);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天,P0012);上皮鈣黏蛋白(E-cadherin),rabbit pAb(Proteintech,20874-1);波形蛋白(Vimentin),rabbit mAb(Cell Signaling,5741T);Vimentin,mouse mAb(Cell Signaling,5741T);TGF-β1, rabbit mAb(Abcam, ab215715);Twist1, mouse mAb(Proteintech, 60330-1);Slug, mouse mAb(Abcam, ab51772);VEGFA,mouse mAb(Proteintech, 66828-1);GAPDH,mouse mAb(Proteintech,60004-1);蛋白質(zhì)常規(guī)分子量標(biāo)記(10～180 kDa)(Proteintech,PL00001); HRP-conjugated affinipure goat anti-mouse IgG(H+L)(Proteintech,SA00001-1);HRP-conjugated affinipure goat anti-rabbit IgG(H+L)(Proteintech, SA00001-2);超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(NCM Biotech,P10100)。

1.2.3 主要儀器 高分辨顯微分析系統(tǒng)(DM4B，德國LEICA);蛋白質(zhì)印跡定量分析儀(c600,美國Azure biosytems)；熱循環(huán)PCR儀(T100 Thermal Cycler，美國Bio-rad)；熒光定量PCR儀(CFX96 touch,美國Bio-rad)。全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(ASP200S,德國Leica),石蠟切片機(jī)(RM2235，德國Leica)，全自動(dòng)血液檢測儀(BC6600，中國邁瑞)。

1.3 造模及干預(yù)方法

取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的MDA-MB-231細(xì)胞,用胰酶常規(guī)消化后,以1∶1比例與無血清培養(yǎng)基RPMI1640混勻制成單細(xì)胞混懸液,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×106mL-1,冰上放置保存。將細(xì)胞懸液混勻后,用1 mL注射器注入雌性裸小鼠左側(cè)第二對乳房墊內(nèi),每只0.1 mL。細(xì)胞懸液注入后,可見局部卵圓形皮膚隆起,以乳頭位于隆起中心為準(zhǔn)。每日觀察乳房墊內(nèi)情況,第7～10天以裸鼠注射區(qū)域可見芝麻樣隆起腫物為造模成功(15 mm3或瘤體大小為3 mm×3 mm)。造模成功后,隨機(jī)分組進(jìn)行藥物干預(yù)。

根據(jù)小鼠與人的用藥劑量換算公式計(jì)算給藥劑量?？ㄅ嗨麨I片給藥量為:7.8 mg·d-1;雄黃外用為探討性研究,藥物濃度的設(shè)定為自擬,以醋調(diào)雄黃,濃度為0.5 g·mL-1。具體分組及干預(yù)方法見表1。

表1 分組及干預(yù)措施

1.4 一般狀態(tài)觀察

觀察不同組別裸小鼠一般狀態(tài),體質(zhì)量變化,詳細(xì)記錄、繪制體質(zhì)量變化曲線。造模成功后,干預(yù)第0、7、14、21、28、35、42天用游標(biāo)卡尺測量體表腫瘤橫軸、縱軸長度,計(jì)算體表腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線。取材后腫瘤組織稱質(zhì)量,根據(jù)以下公式并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.5 HE染色

石蠟包埋腫瘤組織樣本,進(jìn)行組織切片,烤片機(jī)烘烤切片,二甲苯脫蠟處理后無水乙醇浸泡,然后進(jìn)行梯度乙醇水化,自來水沖洗,加入蘇木素染色,自來水沖洗,75%鹽酸乙醇溶液分化,自來水沖洗后返藍(lán)液處理,自來水沖洗后用0.5%伊紅染色,水沖洗后繼續(xù)梯度乙醇脫水,再經(jīng)二甲苯透明處理后,加入樹脂封片后風(fēng)干,顯微鏡下篩選觀察。

1.6 免疫組化

烘烤切片,二甲苯脫蠟,無水乙醇浸泡,梯度乙醇水化后再用自來水沖洗。放入檸檬酸緩沖液高壓煮沸,進(jìn)行抗原修復(fù),冷卻后PBS沖洗,滴加3%過氧化氫酶浸泡,PBS反復(fù)沖洗,滴加血清封閉,吸去封閉液后,滴加一抗,4 ℃過夜。復(fù)溫后使用含有1%BSA的PBS沖洗,加入二抗37 ℃孵育,再使用含有1%BSA的PBS沖洗,DAB顯色后自來水沖洗,蘇木素浸染→自來水沖洗→分化液→自來水沖洗→返藍(lán)液→自來水沖洗→梯隊(duì)乙醇脫水→二甲苯透明化,樹脂封片后風(fēng)干,顯微鏡下觀察篩選。

1.7 血常規(guī)和肝、腎功能檢測

利用血液細(xì)胞分析儀、生化分析儀檢測白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)等血常規(guī)檢測項(xiàng)目及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)含量。

1.8 Western blot檢測

提取腫瘤組織蛋白,然后用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白上樣,配置10%分離膠,5%濃縮膠。電泳、電轉(zhuǎn)后,5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗4 ℃過夜;TBST清洗,加入二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(HRP)或辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG 1∶8 000室溫孵育1 h,TBST清洗。用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液顯現(xiàn)條帶,并用生物成像系統(tǒng)拍照,Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.9 qPCR檢測

按照試劑盒指示對腫瘤組織進(jìn)行RNA提取,最后加入30 μL RNase free water溶解RNA,吹打混勻。利用紫外分光光度計(jì)分析對總RNA進(jìn)行定量。反轉(zhuǎn)錄cDNA,利用PCR熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用相對定量2-ΔΔCt法進(jìn)行qPCR結(jié)果分析。所用引物序列如表2。

表2 引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 雄黃外用對荷瘤裸鼠一般情況及移植瘤生長的影響

各組裸鼠隨著觀察時(shí)間延長,呈現(xiàn)不同程度的反應(yīng)遲緩、活動(dòng)減少、食欲減退、精神萎靡,脊骨突出等表現(xiàn),個(gè)別裸鼠因瘤體較大,癥狀較重。在觀察3周后,個(gè)別裸鼠腫瘤部位出現(xiàn)皮膚潰破,表面顏色為黑褐色。各組裸鼠體質(zhì)量雖呈上升趨勢,但均伴有不同程度的腫瘤惡病質(zhì)表現(xiàn),組間體質(zhì)量未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見圖1。

注：Mod.模型組；Cap.卡培他濱片組；XHWY.雄黃外用組

各組裸鼠腫瘤體積隨時(shí)間延長而逐漸增大,自第14天起至第42天,卡培他濱組腫瘤體積明顯小于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。自第35天起至第42天,雄黃外用組腫瘤體積明顯小于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？ㄅ嗨麨I組和雄黃外用組相比,腫瘤體積無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見圖2。

注：Mod.模型組；Cap.卡培他濱片組；XHWY.雄黃外用組

與模型組相比,卡培他濱片組瘤體質(zhì)量明顯小于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);雄黃外用藥組瘤體質(zhì)量小于模型組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？ㄅ嗨麨I片抑瘤率為65.88%,雄黃外用抑瘤率為30.2%。見圖3。

注：Mod.模型組；Cap.卡培他濱片組；XHWY.雄黃外用組；與模型組比較,*P<0.05。

2.2 雄黃外用對裸鼠腫瘤組織病理變化的影響

如圖4所示,HE染色可見在各組腫瘤組織中,癌細(xì)胞排列雜亂不規(guī)則,緊湊成巢狀,細(xì)胞大小形態(tài)不一,細(xì)胞核核仁較大,異型性明顯。模型組癌細(xì)胞幾乎未見明顯壞死,細(xì)胞擁擠,排列雜亂無序,細(xì)胞核深染,且呈多核及異形。與模型組相比,卡培他濱片組和雄黃外用組可見不同程度的癌細(xì)胞壞死,壞死區(qū)域呈粉紅色,細(xì)胞形態(tài)失常,細(xì)胞核減少或幾乎見不到細(xì)胞核,卡培他濱片組壞死區(qū)域最為廣泛及明顯。

圖4 各組腫瘤組織HE染色比較

2.3 雄黃外用對裸鼠腫瘤組織中E-cadherin、Vimentin的影響

圖5所示,E-cadherin蛋白在模型組中表達(dá)較低,卡培他濱片和雄黃均能上調(diào)E-cadherin表達(dá)(P<0.05),其中卡培他濱片組表達(dá)最強(qiáng);模型組中Vimentin呈強(qiáng)表達(dá),卡培他濱片及雄黃均可不同程度地降低Vimentin表達(dá)(P<0.05)。

注：Mod.模型組；Cap.卡培他濱片組；XHWY.雄黃外用組；與模型組比較,*P<0.05；與卡培他濱片組比較,#P<0.05。

2.4 雄黃外用對裸鼠血常規(guī)和肝、腎功能的影響

各組之間AST、ALT、BUN、CRE、WBC、RBC、HGB、PLT等數(shù)值未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.5 雄黃外用對裸鼠乳腺癌EMT相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與模型組比較,雄黃外用組和卡培他濱片組腫瘤組織中E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),Vimentin、Slug、Twist1、TGF-β1蛋白表達(dá)明顯減弱,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？ㄅ嗨麨I片對E-cadherin和TGF-β1調(diào)控作用優(yōu)于雄黃外用。

注：Mod.模型組；Cap.卡培他濱片組；XHWY.雄黃外用組；與模型組比較,*P<0.05；與卡培他濱片組比較,#P<0.05。

2.6 雄黃外用對裸鼠乳腺癌EMT相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

如圖7所示，與模型組比較,雄黃外用組腫瘤組織中E-cadherin(CDH1)mRNA表達(dá)增強(qiáng),Twist1、Vimentin、TGF-β1 mRNA表達(dá)減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對于Slug mRNA表達(dá)則僅呈現(xiàn)減弱趨勢,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對于TGF-β1 mRNA的調(diào)控,雄黃外用組的效果優(yōu)于卡培他濱片組(P<0.05)。

注：Mod.模型組；Cap.卡培他濱片組；XHWY.雄黃外用組；與模型組比較,*P<0.05；與卡培他濱片組比較,#P<0.05。

3 討論

中醫(yī)外治法歷史悠久,在癰疽腫瘍方面甚為普遍。在《靈樞·癰疽》中就有記載:“發(fā)于腋下赤堅(jiān)者,名曰米疽,治之以砭石,欲細(xì)而長,疏砭之,涂以豖膏?！盵10]廣義的中醫(yī)外治法是指在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下,將中藥或其他器具作用于皮膚、孔竅、經(jīng)絡(luò)、俞穴等部位,發(fā)揮疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)氣血、解毒化瘀、扶正祛邪等作用的治療方法;狹義的中醫(yī)外治法則是指利用中藥藥粉或新鮮藥草加入蜂蜜、醋等調(diào)成膏狀,敷于局部起到治療作用的治療方法[11]。中醫(yī)外治法廣泛運(yùn)用于抑制腫瘤、改善癌痛、減輕放化療不良反應(yīng)等方面,其方式主要包括敷、貼、涂、擦、熏、蒸、洗、浴等,其目的是為了使藥物通過皮膚腺體直達(dá)淺層腫瘤病灶,直達(dá)靶區(qū);同時(shí)使藥物經(jīng)皮下毛細(xì)血管進(jìn)入人體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng),在血液、淋巴及其周圍發(fā)揮抗腫瘤的作用。

“癌毒”這一概念是中醫(yī)對腫瘤病因病機(jī)認(rèn)知的新理論,許多醫(yī)家都認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及患者預(yù)后都與“癌毒”存在關(guān)聯(lián)性[12]。乳腺癌屬于中醫(yī)“乳巖”范疇,縱觀其發(fā)病過程,與“毒聚”關(guān)聯(lián)密切,其易發(fā)生轉(zhuǎn)移多是由于“余毒”流竄。由此可見,“癌毒”不僅是乳腺癌發(fā)生的重要條件之一,亦與其進(jìn)展密切相關(guān),是乳腺癌轉(zhuǎn)移不可缺少的重要因素[13]。EMT是乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素,它使乳腺癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力,這也與中醫(yī)“癌毒”走竄性特點(diǎn)具有相似之處。因此,我們假定EMT為“癌毒”的組成部分,抑制EMT發(fā)生則相當(dāng)于攻伐限制“癌毒”。中醫(yī)素有攻毒治法之說,常用于惡性腫瘤的治療,它包括廣義和狹義兩個(gè)范疇:廣義的攻毒治法是以攻為治,指針對毒邪而施治的特殊治療手段與方法;狹義的攻毒治法則是指以有毒之藥治病的方法[14]。有毒中藥即中毒劑量和治療使用劑量相接近的一類中藥,亦稱攻毒類中藥?！吨嗅t(yī)大辭典》中治法術(shù)語“以毒攻毒”是指使用有毒藥物治療惡瘡病毒的方法[15]。由此可見,攻毒治法可理解為應(yīng)用有毒中藥治療腫瘤以達(dá)到祛除癌毒、調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽平衡的目的。綜上所述,我們選擇雄黃外用為治療方法,并以醋調(diào)和雄黃制成糊狀外敷腫瘤處,取醋散瘀解毒之功,共奏箍集圍聚,收束癌毒作用,觀察其對乳腺癌EMT的作用,以驗(yàn)證我們的假設(shè)。

EMT是一個(gè)復(fù)雜的過程,E-cadherin和Vimentin常被用作為乳腺癌EMT標(biāo)志物:E-cadherin的主要作用為促進(jìn)上皮細(xì)胞之間的黏附,它常被作為EMT典型改變的上皮標(biāo)物[16-17],也與乳腺癌的侵襲力、腫瘤分級(jí)以及預(yù)后關(guān)系密切[18],E-cadherin功能或表達(dá)被抑制時(shí),可能導(dǎo)致間質(zhì)形態(tài)的改變,增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[19];Vimentin作為間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物,其表達(dá)與腫瘤侵襲力呈正相關(guān),也常被用為腫瘤發(fā)生EMT的標(biāo)志物[20]。EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(EMT-Transcription factors,EMT-TFs),包括Snail1/Slug家族[21]、Twist[22]、dEF1/ZEB1和SIP1/ZEB2[23-24]等,它們以各種組合方式誘導(dǎo)促進(jìn)間充質(zhì)形態(tài)的基因表達(dá),并抑制維持上皮狀態(tài)的基因表達(dá)。本研究中經(jīng)過雄黃干預(yù)后,腫瘤組織中E-cadherin表達(dá)增強(qiáng),Vimentin、Slug、Twist1、TGF-β1表達(dá)減弱,說明雄黃外用在一定程度上可維持乳腺癌組織中上皮狀態(tài),抑制間質(zhì)化的發(fā)生,具有一定的抗腫瘤作用和抗轉(zhuǎn)移潛力。但是雄黃外用在調(diào)控TGF-β1蛋白表達(dá)和Slug mRNA表達(dá)方面,效果弱于作為對照藥的卡培他濱片,但與模型組相比整體效果與抑制EMT相符合,說明雄黃外用對乳腺癌EMT的整體調(diào)控作用是有效的。另外,研究結(jié)果顯示對于TGF-β1因子,在蛋白表達(dá)層面雄黃外用效果弱于卡培他濱片,但在基因表達(dá)層面雄黃外用效果優(yōu)于卡培他濱片,這個(gè)效果差異可能與TGF-β1因子在細(xì)胞分布位置或藥物作用細(xì)胞位置有關(guān),有待于進(jìn)一步研究探討。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各組裸鼠的肝、腎功能和血常規(guī)指標(biāo)無差別,在一定程度上可以說明外用雄黃的安全性,但是并沒有進(jìn)一步深入地探討其毒理,關(guān)于雄黃安全劑量有待于進(jìn)一步探討和驗(yàn)證。

綜上所述，雄黃外用可在一定程度上抑制人三陰性乳腺癌裸鼠模型中腫瘤的發(fā)展,可通過上調(diào)E-cadherin表達(dá),下調(diào)Vimentin、Slug、Twist1、TGF-β1表達(dá),實(shí)現(xiàn)對乳腺癌EMT的調(diào)控作用,具有一定抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛力,但具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。