微流控器官芯片與類器官在眼科的應用

黃濤*，馬淑嫻* 綜述 邵毅 審校

(南昌大學第一附屬醫(yī)院眼科，南昌 330006)

以往大多使用體外細胞培養(yǎng)或動物模型研究眼的生理結構和疾病病理機制，但是由于體外細胞環(huán)境與體內無法完全一致，且不同物種間存在較大差異，使得這些研究在臨床轉化時受到一定限制。此外，臨床疾病新型藥物的研究十分緩慢，首先要通過動物試驗再進入臨床人體1～3期試驗后才可能批準通過，耗資巨大且存在風險，制約了臨床相關的藥物研究。更為重要的是，由于存在倫理問題，動物實驗和人體試驗都面臨著諸多限制，受到廣泛爭議。

這類問題催生出了類器官與微流控芯片技術，以滿足更精準的臨床前實驗的需求。類器官是由原代組織、胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)或誘導多能干細胞(induced-pluripotent stem cells，iPSCs)衍生的體外三維結構，具有自我更新和自組織能力，并表現出與起源組織相似的器官功能[1]。微流控芯片是一種基于微流控技術，用于模擬人體器官生理環(huán)境的仿生系統(tǒng)，通過細胞生物學、工程學和生物材料技術的結合，可以調節(jié)濃度梯度、剪切力、細胞模式、組織邊界和組織-器官相互作用等關鍵因素，從而模擬人體組織的結構和功能特征。類器官芯片與器官芯片的研究應用相似，都以微流控系統(tǒng)為基礎，基于微流控技術用于模擬人體器官生理環(huán)境的仿生系統(tǒng)。不同之處在于器官芯片是指將人體某器官的代謝微環(huán)境在體外模擬，主要用于藥物研發(fā)及篩選方面。類器官芯片是指由原代組織、ESCs或iPSCs在芯片微環(huán)境中衍生發(fā)育的各種類器官模型，可用于發(fā)育生物學、細胞生物學、疾病模型、精準醫(yī)療、新藥研發(fā)及篩選、藥物實驗、再生醫(yī)學等方面。微流控芯片是實現微流控技術的平臺，二者的組合被稱為組織芯片或生理微系統(tǒng)，其上由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學或生物實驗室的各種功能[2]。由上述技術在體外模擬構建的三維人體器官模型，具有接近人體水平的生理功能，同時能精確地控制多個系統(tǒng)參數，在疾病模擬和新藥研發(fā)以及精準醫(yī)療等領域擁有廣闊的發(fā)展前景。

目前已有許多模型開始應用類器官與微流控芯片，包括腸胃、肝、腦、腎等器官組織[3]，在眼科方面主要應用于角膜、淚腺、視網膜、晶狀體等結構。本文主要綜述這些技術在眼科的應用，包括眼的發(fā)育、生理、疾病病理機制、個性化醫(yī)學診斷和治療方法等方面，旨在探究眼科類器官與微流控芯片的應用前景和現有缺陷。

1 類器官

1.1 角膜類器官

角膜類器官是用于發(fā)育研究、角膜疾病建模的3D角膜模型，具有角膜移植的潛在價值，由ESCs和iPSCs分化出的各種角膜細胞所組成。

2014年，劉奕志教授團隊等[4]在體外無滋養(yǎng)細胞的條件下成功擴增了角膜緣干細胞。通過轉錄因子PAX6的轉導，可以將皮膚上皮干細胞轉變?yōu)榻悄ぞ壐杉毎麡蛹毎?，并能用于移植修復損傷的大鼠角膜。2016年，Hayashi等[5]利用誘導多能干細胞產生的眼部細胞可產生自我形成的外胚層自主性多區(qū)(self-formed ectodermal autonomous multizone，SEAM)，其不同區(qū)內的細胞指示著眼睛的多種細胞系，反映了眼睛發(fā)育的復雜性，且利用人誘導多能干細胞產生的角膜上皮細胞可在體外培養(yǎng)，并用于修復受損的兔眼前部。這些角膜上皮的突破性研究為角膜類器官的出現奠定了良好的基礎。

2017年，Foster等[6]首次利用人多能干細胞培育出了角膜類器官。這些類器官包含角膜上皮細胞、角膜基質細胞和角膜內皮細胞，并能通過免疫熒光染色檢測到相應的標志物，如角膜上皮標志物KPT3、KPT14、p63，角膜基質標志物CD34，角膜內皮標志物COL8A1、F11R、S100A4等。此后，Susaimanickam等[7]使用更為簡單有效的方法培育出了更為復雜的三維微型角膜類器官，一定情況下能形成完整的眼球樣結構。后續(xù)的檢測顯示微型角膜與人體角膜的形態(tài)結構一致，并能表達角膜特異性標志物。近年的研究[8]發(fā)現：ABCB5可以用于對人多能干細胞來源的角膜類器官克隆細胞進行直接檢測鑒定，并已開始逐步應用于臨床。

雖然角膜類器官可以為移植提供細胞來源，但較長的分化時間和較大的可變性限制了這方面的應用。同樣，角膜類器官能重現角膜的組織結構，但是由于相應的可變性，難以用于臨床前實驗。相反，類器官分化不同時期表達的不同標志物有利于角膜發(fā)育的研究，并可能用于闡明以往無法用其他方法模擬的疾病機制[9]。同時，角膜類器官各層含有不同的胞外基質膠原和蛋白聚糖等重要基質成分，外層含有基底膜蛋白聚糖和VIII型膠原蛋白，深層為基質蛋白LUM、KERA及I型和V型膠原蛋白，這些相近的組成可以用于研究角膜的生理結構和組織層次。

1.2 淚腺類器官

近年來，利用再生醫(yī)學(包括多能干細胞的類器官)修復功能性淚腺的治療理念已成為治療重度干眼的考慮方向。

Bannier-Hélaou?t等[10]將類器官細胞及其對應組織與單細胞測序技術相結合，創(chuàng)建了一個穩(wěn)定的實驗平臺。他們培育出源于小鼠和人的淚腺導管類器官，使用神經遞質進行刺激流淚，通過對組織和類器官的單細胞mRNA測序揭示淚腺的細胞異質性。這項研究發(fā)現：Pax6基因對于維持淚腺功能關鍵基因的表達和類器官的生長發(fā)育是必須的，對于淚腺發(fā)育有著不可或缺的作用。同時，通過對900多個細胞進行單細胞測序，檢測LTF、LCN1、LYZ、LACRT等多種蛋白的表達水平，該研究發(fā)現不同的淚腺細胞亞群表達不同的產物。此外，通過神經遞質的刺激還可以模擬流淚的過程，將人的類器官移植到小鼠體內也可以基本發(fā)揮淚腺的功能。

Jeong等[11]著重探究淚腺類器官應用于干眼器官替換治療的可行性。他們使用匹羅卡品處理，通過鈣內流或蛋白質組學分析證實淚腺類器官具有分泌功能。通過制備小鼠衍生的淚腺類器官并將其移植到干眼小鼠模型的淚腺組織中，最終證實小鼠淚腺類器官與在體正常淚腺組織特征相似，并可用于治療干眼。

1.3 視網膜類器官

視網膜類器官(retinal organoid，ROs)來自干細胞，在誘導因子作用下可自發(fā)形成三維組織結構，與人體視網膜結構非常相似，對移植治療和疾病建模領域是一大技術突破[12]。然而，ROs應用在現階段仍存在各種缺陷，包括培養(yǎng)過程長、產量不足、不同條件下產生的ROs存在巨大異質性等。具有里程碑的實驗代表是Sasai實驗室研究培養(yǎng)出的ROs，近年來，通過對Sasai實驗的不斷優(yōu)化，人胚胎干細胞來源的ROs逐漸發(fā)展，縮短了視網膜類器官培養(yǎng)的時間[13-14]。

ROs有助于理解視網膜的發(fā)育生理和轉錄機制[15]。例如由甲狀腺激素調節(jié)的錐細胞分化機制已被闡明[16]。ROs模型還可研究不同基因在眼形成和神經視網膜分化中的作用。ROs可用于觀察視網膜細胞類型的動態(tài)轉錄過程，有絲分裂和視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)減少，隨后依次形成錐細胞和桿細胞、Müller膠質細胞[17]。

1.3.1 視網膜類器官的應用

1.3.1.1 疾病模型

近年來，關于眼部疾病的ROs模型已經相繼建立，既可以研究疾病的病理機制還可以用于治療。視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)是兒童最常見的眼內惡性腫瘤，傳統(tǒng)模型無法準確模擬人類Rb的起源和發(fā)展，利用基因工程人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)建立的Rb器官模型與人類原發(fā)性Rb一致性高，可用于研究Rb的起源和發(fā)病機制[18]。盡管先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)、視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP[19])、RB、X連鎖視網膜劈裂癥(X-linked retinoschisis，XLRS)等模型已被建立并深入研究，利用ROs模型能發(fā)現各個疾病有相對應的基因突變，但這項技術仍存在許多挑戰(zhàn)。由于ROs是相對不成熟的結構，且缺乏視神經、視網膜血管系統(tǒng)和小膠質細胞，建立晚期疾病的模型十分困難。Achberger等[20]將ROs與視網膜芯片中人誘導多能干細胞(human inducedpluripotent stem cells，hiPSC)衍生視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)相結合，這種新型的微生理平臺能夠增強視網膜內段和外段的形成和保存以及RPE和光感受器之間的直接相互作用，并且能夠精確地控制血流灌注，為基礎應用研究提供了方向。

1.3.1.2 藥物研究

人類ROs技術有望比動物和二維模型更真實地模擬發(fā)育和疾病過程[21]，能夠應用于臨床前藥物開發(fā)階段的靶向治療和藥物毒性評估，并取得了可觀的成果[22]。Ito等[23]研究發(fā)現維生素E相比葉黃素在保護視網膜退化上更有效。

1.3.1.3 移植治療

視網膜類器官可作為移植治療的細胞來源，近年來的大部分研究主要集中在光感受器視錐、視桿細胞，也有少部分關于Müller膠質細胞和視網膜神經節(jié)細胞的研究[24-25]。根據目前多項研究結果，多能干細胞衍生出的RPE細胞治療年齡相關性黃斑病變(age-related macular degeneration，ARMD)和Stargard疾病安全且穩(wěn)定，為光感受器的移植安全提供了事實依據[26]。目前主要有兩種移植方法，分別為供體的細胞懸液和細胞層。McLelland等[27]使用健康視網膜組織來源的ROs治療免疫缺陷的晚期視網膜變性大鼠模型，研究表明移植的細胞層經歷了分化和整合，盡管微環(huán)境退化，但其可以形成視錐視桿細胞、雙極細胞、Müller膠質細胞、無長突細胞等等，進而改善視功能。

CRISPR/Cas9技術的應用促進RP/XLRS模型的成功建立。成功構建Crx-iCreERT2紅色熒光報告人ESCs系經3D培養(yǎng)誘導分化為表達tdTomato紅色熒光的視網膜類器官,得到的視網膜類器官同人類正常視網膜的神經細胞組成一致且發(fā)育的時間和空間順序接近于正常的人類視網膜[28]。

1.3.1.4 基因治療

目前重組腺相關病毒(recombinant adenoassociated virus，rAVV)是在視網膜基因傳遞中最廣泛使用的基因擴增的載體，是遺傳性視網膜營養(yǎng)不良性疾病靶向治療的一種方式?；颊邅碓吹腞Os可替代動物模型測試AAV介導的基因擴增效率。最新研究的優(yōu)化AAV載體，可高效轉導人類視網膜類器官[29]，成功解決了載體轉導效率低的問題。

1.4 晶狀體

Huang等[30]在1970s利用正常和白內障小鼠的晶體初步研究探索晶狀體類器官。隨后Yang等[31]最先通過一系列的成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、轉化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)抑制和激活通路培養(yǎng)步驟進行“三階段”培養(yǎng)，成功從hESCs中培養(yǎng)出大量晶狀體祖細胞及三維晶狀體模型，但該模型誘導的晶狀體不能實現完全分化，且缺乏光聚焦能力。此后研究[32]發(fā)現：哺乳動物內源性LECs具有修復和再生能力，能夠形成具有生物視覺功能的晶狀體，其中PAX6、BMI-1是維持LECs更新的重要因素。這一發(fā)現用于治療先天性白內障，減少了并發(fā)癥，并對白內障形成機制有更深一步的了解。

2017年，Fu等[33]通過“煎蛋”分化方式將人多能干細胞誘導為晶狀體祖細胞和類晶狀體小體，由于在其分化過程中的一個時期細胞呈煎蛋樣外觀而得名，其“蛋黃”為E鈣黏蛋白陽性分化細胞，最終形成類晶狀體小體，“蛋清”為E鈣黏蛋白陰性支持細胞。使用相同的方法[34]，能夠研究源于人胚胎干細胞和多能干細胞的類晶狀體小體的自噬活性，用以揭示細胞器降解產生的無細胞器區(qū)與白內障的關系。目前，類晶狀體小體已經可以被用于研究白內障的各種病因，包括先天性白內障和年齡相關性白內障[35-36]。對于年齡相關性白內障模型，觀察發(fā)現類晶狀體小體在長期培養(yǎng)后會有自發(fā)性渾濁和蛋白聚集，并且過氧化氫等氧化劑會加速該過程。

Murphy等[37]研究了一種新的分化方式，所形成的類晶狀體小體含有更少的非晶狀體細胞。與以往的模型相比，他們的模型產生了更多具有雙凸外觀的球形小晶狀體，并且具有更強的光聚焦能力。他們通過磁激活細胞分選法純化細胞，以選擇表達ROR1的細胞，研究后囊膜混濁。他們的模型可以有效地幫助理解白內障多種危險因素背后的潛在機制，并尋找治療靶點。

來源于LECs的晶狀體類器官能夠在體內誘導分化而成，不受體外環(huán)境的干擾，在一定條件下能夠再生出具有視覺功能的晶體，使白內障手術有了大步飛躍。但LECs增殖能力與年齡成負相關，容易無序增長成渾濁的晶體。來源于ESCs的晶狀體類器官培養(yǎng)步驟復雜，先生成晶狀體祖細胞再形成三維晶狀體結構，需要嚴格地化學體外培養(yǎng)環(huán)境，但具有更大的分化潛能，該模型對于研究人類晶狀體胚胎發(fā)育的分子機制及病理模型十分有用。

晶狀體類器官模型已被應用于白內障病理生理機制、藥物篩選評估、治療等方面。手術摘除是先天性白內障的唯一治療方案，術中及術后并發(fā)癥多，尤其是發(fā)生炎癥、弱視、后囊下渾濁的概率高。目前通過使用患者特異性iPSC建立相應的先天性白內障疾病模型，發(fā)現近40種基因如CRYGD和CRYBB2突變可引起蛋白質聚集晶體混濁。除遺傳背景外，晶狀體發(fā)育的微環(huán)境也對先天性白內障發(fā)生起到重要作用，該模型也為臨床候選藥物篩選的研究提供了一個平臺[38]。通過對內源性LECs的再生研究，一種新的微創(chuàng)白內障手術方法保留了晶狀體囊和相關LECs的完整性，促進了患者晶狀體再生，恢復了視力且術后并發(fā)癥少，在治療先天性白內障方面取得了又一大突破。使用自然再生晶體治療白內障的新策略是非?？扇〉腫32]。

2 微流控芯片

2.1 角膜芯片

角膜芯片技術仍處于初級階段，但是通過對角膜芯片模型進行的簡單干預已經能夠重現某些疾病的特征。2018年，Bennet等[39]所開發(fā)的角膜芯片含有上皮層、基底膜和前彈力層，并且在微流控裝置中模擬淚液流動。他們使用聚二甲硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜培養(yǎng)永生化的人角膜上皮細胞，并發(fā)現與無涂層或膠原涂層的膜相比，種植在纖維結合蛋白涂層膜上的細胞更具活性。這種模型的上皮滲透性與人體組織十分相似。他們使用強的松和酮替芬滴眼劑對其模型進行了藥物研究，以評估其模型在藥物滲透性方面的功能，并發(fā)現與連續(xù)流動或靜態(tài)條件相比，脈動淚液流與人眼最為相似。然而，由于芯片缺少免疫系統(tǒng)，無法精確地模擬眼表的藥理學免疫調節(jié)作用，但能有效模擬非免疫過程。

Seo等[40]結合眼瞼、結膜和角膜設計的角膜芯片是一個重要突破，其設計的具有灌注系統(tǒng)和過量引流系統(tǒng)的穹頂狀支架，可以用于模擬淚液的分泌、排泄和眨眼過程。該芯片模擬角膜和結膜的復層上皮結構，含有1層表達基底細胞特異性標志物(p63)的細胞，且能分泌黏蛋白，維持眼表約6 μm厚的均勻淚膜。在這類模型中，眨眼的剪切力將有助于角膜上皮的生長分化，證明細胞生化網絡能對機械力進行感知和反應。通過減少眨眼頻率和調整環(huán)境濕度，加速淚液蒸發(fā)，可以直接構建干眼模型。更重要的是，白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和基質金屬蛋白酶9(matrix mentalloproteinase 9，MMP-9)等炎癥細胞因子在該干眼模型中過量表達，與干眼在人體內的反應一致，因此可以用于模擬和研究干眼的機械和生物化學特征。使用內源性潤滑素對該干眼模型進行測試后發(fā)現，淚膜破裂時間延長，淚膜破裂面積減少，角膜熒光染色發(fā)生相應改變，同時檢測到IL-8的TNF-α、IL-1β和MMP-9等炎癥因子的淚膜濃度分布明顯減少，與臨床試驗結果相似。這項分析表明，角膜芯片既可以在臨床前實驗階段進行“臨床試驗”，也可以在分子水平上揭示相應治療藥物的治療原理。

角膜芯片與角膜類器官相比，更容易進行相關干預，從而能更精確地模擬部分慢性眼部疾病，例如結膜炎或干眼等，并以更為具象的方式為疾病研究和藥物研發(fā)提供其實可靠的依據。

2.2 淚腺芯片

各種新型生物工程已被用于功能器官的再生，以模擬或治療相應疾病。Lu等[41]針對干眼的治療評價和發(fā)病機制研究，建立了眼表體外三維共培養(yǎng)模型。該模型由兔結膜上皮和淚腺細胞球體組成，模擬淚膜的水樣層和黏蛋白層。結果顯示：與單一培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)提供了更具生理相關性的治療反應，表明利用淚膜-眼表系統(tǒng)(包括淚腺球體和結膜上皮)的各種組織的共培養(yǎng)系統(tǒng)，可作為干眼和治療評價的模型。

2.3 視網膜芯片

由于視網膜芯片能夠實現細胞的多層排列以及類似血流的灌注，特別適用于模擬類器官所缺乏的血視網膜屏障(blood-retina barrier，BRB)，尤其是血視網膜外屏障(outer blood-retina barrier，oBRB)和微毛細血管內皮細胞形成的相鄰脈絡膜微血管網絡。最簡單的oBRB芯片為雙通道微流控芯片，其中RPE和內皮細胞種植在多孔膜的對側，隨后通過介質泵進行灌注以重建微血管血流。

此后，Chung等[42]采用纖維蛋白水凝膠間隙代替多孔膜。為了模擬三維脈絡膜血管網，將內皮細胞與纖維蛋白凝膠混合后植入纖維蛋白間隙下方的通道中，將RPE(ARPE19)細胞接種于凝膠壁上。血管生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)刺激后，脈絡膜內皮細胞浸潤纖維蛋白間隙和RPE層，再現了濕性老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)的發(fā)病過程。抗血管內皮生長因子抗體貝伐單抗可以用于治療模擬的濕性AMD，其后續(xù)治療可防止血管增生，表明血-視網膜屏障芯片不僅能重現病理生理過程，而且能重現治療過程。

Yeste等[43]的芯片采用多層設計，由多個滲透膜分隔，整合了血視網膜內外屏障和視網膜神經上皮層，并驗證了其屏障功能。Achberger等[20]開發(fā)的芯片對oBRB與視網膜神經上皮層一起建模，將所有主要的視網膜細胞類型結合在一個平臺上，并具有微流控灌注系統(tǒng)。通過施加抗瘧疾藥物氯喹和抗生素慶大霉素，能夠重現其對視網膜的毒副作用，證明了視網膜芯片在藥物測試中的適用性。這種基于人多能干細胞的視網膜芯片可能促進藥物開發(fā)，是探究視網膜疾病潛在病理機制的新途徑。

視網膜芯片能夠模擬視網膜的生理過程和生理屏障，對藥物效應的臨床前評估十分重要[44]。Achberger等[20]發(fā)現氯喹和慶大霉素對視網膜傷害性較大，RPE可能是藥物作用的生理屏障。視網膜芯片也被用于眼內填充物的開發(fā)和測試，例如在視網膜脫離和巨大視網膜裂孔等疾病中測試硅油的填充量。近年來，更多的研究用來開發(fā)更先進的視網膜芯片模型來模擬移植后視網膜結構和功能。細胞移植治療功能失調的效率主要依賴供體細胞共同遷移的正確方向[45]。Mishra等[46]研究發(fā)現：通過使用電場并提高基質細胞衍生因子1(stromal derived factor-1，SDF-1)，細胞的遷移距離和方向性都增強。光學相干斷層掃描、視覺動力學測試、免疫造血化學等方法可用于確定移植效果。

3 結語

工程化類器官和微流控芯片勢必會改變我們未來對眼睛進行體外研究的方式。特別是，這些技術為我們研究疾病表現的個體差異提供了可能[47]。盡管最近取得了一些進展，但仍有一些缺點和挑戰(zhàn)需要解決[48]。技術的多變性是類器官系統(tǒng)中的一個主要問題，需要一個標準化方案來避免不同實驗室報告結果的差異。同樣地，使用特性良好的商用多能干細胞系將有助于實驗室間結果的闡述。此外，部分類器官和微流控芯片血管系統(tǒng)的缺乏也阻礙了糖尿病[49]、高血壓等全身性疾病在眼部組織的研究。而另一個重要的難題是對不同眼組織間建立相互作用的模型。角膜和視網膜芯片是體外研究藥物作用[50]、治療方法和疾病相關問題的有效工具，但是目前的芯片仍然過于簡單，可能無法重現機體復雜的內分泌環(huán)境所導致的一系列功能變化，測試藥物的結果不一定完全可觀準確。未來的發(fā)展可能會使這些芯片變得更加復雜，能夠越來越真實地反應人眼的結構和功能特征。

病毒性疾病和微生物組分析是類器官和微流控芯片用于眼科研究的2個重要領域。由于病毒與宿主相互作用的特殊性，通常很難在動物體內模擬人類病毒性疾病。類器官由于其對組織的高度還原性，可以用于病毒學研究[51]。而微流控芯片技術提供了一種研究微生物與人體外不同組織之間直接相互作用的方法。在未來，眼部微生物組芯片技術有望成為眼表疾病病理生物學和臨床治療等領域的一個新途徑。

最后，只有開發(fā)相關的測量方法，從工程模型中提取生化和物理數據，才能充分發(fā)揮體外建模的潛力，而組織學技術的進步在這方面發(fā)揮著重要作用。目前，生物學的分析研究與生物衍生工程共同發(fā)展，預示著類器官和微流控芯片在臨床轉化研究中的巨大潛力。

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