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    基于線粒體COⅠ基因滁州地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析

    2022-11-23 13:38:06余紅喜朱國美任信林劉鑫鑫凌武海蘇時萍
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年21期
    關(guān)鍵詞:堿基克氏線粒體

    余紅喜,劉 帆,朱國美,任信林,劉鑫鑫,凌武海,蘇時萍*

    (1.滁州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村技術(shù)推廣中心,安徽滁州 239000;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

    克氏原螯蝦(Procambarusclarkii),隸屬甲殼綱十足目螯蝦科原螯蝦屬,俗稱小龍蝦。自20世紀(jì)30年代傳入我國,在長江流域擴(kuò)繁[1],其味道鮮美,高蛋白低脂肪[2],生命力頑強(qiáng),適應(yīng)性廣,繁殖能力強(qiáng),對水質(zhì)要求不高,現(xiàn)已遍布于我國中東部地區(qū)十余省[3],成為我國稻田養(yǎng)殖的主要品種,養(yǎng)殖面積總量大,產(chǎn)量居淡水蝦類之首[4]。由于近幾年克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積和規(guī)模不斷擴(kuò)大,受其逆向選擇及種苗自繁自育的養(yǎng)殖模式等人為因素的影響,使得克氏原螯蝦個頭逐年變小,病害頻發(fā),種質(zhì)退化嚴(yán)重,群體遺傳多樣性受到嚴(yán)峻考驗[5]。為了恢復(fù)與保護(hù)克氏原螯蝦種質(zhì)資源,提供優(yōu)良品種的選育科學(xué)依據(jù),并提高經(jīng)濟(jì)效益,研究克氏原螯蝦遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。

    線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是保守的共價閉合的雙鏈DNA分子,具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、無重組、多拷貝、母系遺傳等特點。線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COⅠ)作為蛋白編碼基因的一員,在分子標(biāo)記上是研究最為清楚的線粒體基因之一,也有學(xué)者認(rèn)為,相比其他線粒體基因,COⅠ基因是更為理想和常用的分子標(biāo)記[6]。徐浩文等[7]分析了8個地理種群紅條毛膚石鱉COⅠ基因的遺傳多樣性,單倍型遺傳多樣性數(shù)據(jù)顯示,多樣性數(shù)值較高,核苷酸多樣性較低,結(jié)果表明,紅條毛膚石鱉北方群體的遺傳多樣性與南方群體存在差異,2個群體應(yīng)該分別采取相應(yīng)措施來保護(hù)遺傳多樣性;李大命等[8]基于線粒體COⅠ基因序列分析江蘇省4個太湖新銀魚群體遺傳多樣性,結(jié)果表明4個太湖新銀魚種群偏離中性進(jìn)化,歷史上經(jīng)歷過種群擴(kuò)張;劉士力等[9]分析了紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體線粒體COⅠ基因序列的遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,5個紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性存在差異,群體間存在著一定的基因交流;軒中亞等[10]基于線粒體COⅠ序列分析中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體與野生群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)野生中華絨螯蟹遺傳多樣性較低,尤其是在長江水系,不同地理群體之間的種質(zhì)混雜情況較為嚴(yán)重,反映了過度捕撈對種質(zhì)資源的極大破壞。然而,有關(guān)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體線粒體COⅠ基因序列遺傳多樣性的研究鮮見報道。

    安徽省滁州市稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦至今已有25年,養(yǎng)殖群體分布廣泛,也是最早開展克氏原螯蝦苗種繁育的地區(qū)之一,以該地區(qū)為代表,研究克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性具有良好的代表性。筆者基于線粒體COⅠ基因序列,分析了安徽滁州市8個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu),探究其養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀,為更高效地開發(fā)利用安徽省克氏原螯蝦種質(zhì)資源及開展種質(zhì)資源評估提供參考依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料樣品采自安徽省滁州市,分別為全椒縣潘氏生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司(F1)、全椒縣赤鎮(zhèn)龍蝦經(jīng)濟(jì)合作社(F2)、全椒縣金順家庭農(nóng)場(F3)、全椒縣銀花家庭農(nóng)場(F4)、定遠(yuǎn)縣曹永明家庭農(nóng)場(F5)、定遠(yuǎn)錦鴻種養(yǎng)殖專業(yè)合作社(F6)、定遠(yuǎn)縣成海家庭農(nóng)場定遠(yuǎn)成海生態(tài)農(nóng)場(F7)、定遠(yuǎn)縣許令國生態(tài)種養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(F8),共8個群體200個樣本。取其背部肌肉組織置于95%乙醇中,4 ℃保存,用于線粒體DNA抽提。

    1.2 試驗方法

    1.2.1線粒體DNA的抽提。肌肉組織使用YEASEN動物組織直接PCR試劑盒抽提DNA,-20 ℃保存。

    1.2.2COⅠ序列的擴(kuò)增、測序。COⅠ引物序列[11]:LCO1490:5′-GGTCAA CAAATCATAAAGATATTGG -3′;HC02198:5′- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA -3′,委托上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。 PCR反應(yīng)體系為40 μL,包括2×Tissue Direct PCR Mix 20 μL,20 mol/L上下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O補(bǔ)足至 40 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共30個循環(huán);最后一個循環(huán)結(jié)束后,72 ℃延伸10 min。

    PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳初步確定片段長度后,由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行產(chǎn)物純化、測序。

    1.2.3遺傳多樣性和群體分化分析。序列的比對、堿基組成、遺傳距離使用MEGAX[12]進(jìn)行分析。序列的變異位點、核苷酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd)、分化系數(shù)(FST)使用DNAsp 5.0[13]進(jìn)行分析。

    1.2.4群體結(jié)構(gòu)分析。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖使用POPART[14]構(gòu)建。鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGAX[12]構(gòu)建,并進(jìn)行1 000次的Bootstrap檢驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 遺傳多樣性和群體分化分析COⅠ測序數(shù)據(jù)經(jīng)人工校正、比對、去除兩端冗余序列和BLAST驗證序列同源性后,共獲得182條長度為655 bp的COⅠ序列用于下游分析,182條序列共檢出25個變異位點,包括15個簡約信息位點和10個單堿基變異位點;堿基平均含量為T(40.0%),C(13.0%),A(27.0%)和G(20.0%),具有明顯的(A+T)堿基偏倚。遺傳多樣性分析顯示(表1),多數(shù)群體具有較低的單倍型多樣性(0.13 ~0.41 < 0.50),僅F7組擁有較高的單倍型多樣性(Hd=0.82)。核苷酸多樣性與單倍型多樣性趨勢一致,但所有群體均較低??傮w來說,8個群體整體呈現(xiàn)低單倍型多樣性及低核苷酸多樣性的遺傳多樣性現(xiàn)狀。

    表1 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)

    群體分化分析顯示(表2),8個養(yǎng)殖群體間發(fā)生了不同程度的分化,從輕微分化(FST<0.05)到中等分化(0.05

    表2 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的FST(對角線下)與群體間遺傳距離(對角線上)

    2.2 群體結(jié)構(gòu)分析鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示(圖1),個體并未按照養(yǎng)殖群體地理位置分布聚集成相應(yīng)的分支,反而混雜在一起,且個體間遺傳距離較近。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示(圖2),共檢出26種單倍型,其中,Hap_1、Hap_2、Hap_4、Hap_7、Hap_15為多群體共享單倍型;Hap_2在群體共享單倍型中占主要分布,其余均為群體內(nèi)獨有單倍型;F7組群體擁有最多的單倍型(12個)。單倍型的分布方式與系統(tǒng)發(fā)育樹趨勢相同,并未依據(jù)地理位置而聚集,而是通過Hap_2替換數(shù)個堿基后相連接,多數(shù)單倍型為群體內(nèi)部獨有。

    圖1 克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹

    注:圓圈面積大小代表單倍型頻數(shù),不同的顏色代表不同的群體,豎線代表突變位點

    3 討論

    3.1 序列特征與遺傳多樣性分析COⅠ基因進(jìn)化速度快,引物通用性強(qiáng),堿基替換速率快,被廣泛應(yīng)用于群體遺傳變異及系統(tǒng)進(jìn)化等研究[15]。該研究共獲得8個克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體182條,COⅠ區(qū)序列約為655 bp。堿基T、C、A、G 的平均含量為T(40.0%),C(13.0%),A(27.0%)和G(20.0%),其中A+T(67.0%)高于C+G(33.0%),呈現(xiàn)明顯的AT堿基偏倚,符合脊椎動物線粒體堿基構(gòu)成的一般特征[16]。

    遺傳多樣性是生物適應(yīng)與進(jìn)化的物質(zhì)基礎(chǔ),用于評價物種進(jìn)化潛能與健康狀況,豐富的遺傳多樣性使得物種能夠更好地適應(yīng)環(huán)境,擁有巨大的進(jìn)化潛力。人工養(yǎng)殖的動物常因親本基數(shù)不足,難以避免近交,產(chǎn)生奠基者效應(yīng),加速遺傳漂變,使得遺傳多樣性迅速丟失。核苷酸多樣性指數(shù)和線粒體DNA 的單倍型多樣性指數(shù)是衡量DNA 多態(tài)程度的2個重要指標(biāo)。8個群體的遺傳多樣性指數(shù)表現(xiàn)為較低的單倍型多樣性(Hd=0.37)與較低的核苷酸多樣性(Pi=0.001 72),表明滁州地區(qū)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較低,需要改良育種措施和育種方法。

    3.2 遺傳分化和群體結(jié)構(gòu)群體間的遺傳距離是衡量群體遺傳分化的重要指標(biāo)[17]。利用遺傳距離數(shù)值定量估計了物種不同分類單位間的遺傳分化水平,種群間遺傳距離值為0~0.05,亞種間是0.02~0.20。該研究中8個克氏原螯蝦群體間的遺傳距離均在0.05 以下,且 MGEA軟件聚類分析發(fā)現(xiàn),8個群體均為混合聚類,說明8個群體之間的遺傳分化處于群間水平。

    群體遺傳學(xué)研究認(rèn)為,F(xiàn)ST值可以表示群體間的分化程度,根據(jù)Wright[18]的劃分標(biāo)準(zhǔn)可分為:0~0.05,無分化;>0.05~0.15,中度分化;>0.15 ~ 0.25,高度分化;>0.25,重度分化。該研究8個群體間的FST為-0.023 56~ 0.122 14,F(xiàn)7組與F1組群體間的遺傳分化系數(shù)為0.122 14,表現(xiàn)為中度遺傳分化;F6組與F8組群體間分化最弱。同樣地,在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示出與系統(tǒng)進(jìn)化樹相似的結(jié)果,8個群體的單倍型并未依照地理位置聚集,反而以Hap_2為主要共享單倍型,其余單倍型通過數(shù)個堿基的替換演變成群體內(nèi)部獨有單倍型。

    4 結(jié)論

    綜上所述,該研究基于能夠反映種群間遺傳多樣性的線粒體COⅠ為分子標(biāo)記,分析了8個安徽省滁州市克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,8個群體的遺傳多樣性較低,群體結(jié)構(gòu)為輕微程度的分化,群體間遺傳 距離較小,不足以認(rèn)定為群體間有差異。因此,在后續(xù)的繁殖與選育工作中,應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對遺傳背景的篩查,避免因遺傳背景的相似,造成克氏原螯蝦遺傳多樣性的進(jìn)一步丟失,進(jìn)而影響克氏原螯蝦養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。

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