間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的生物學(xué)功能及其治療支氣管肺發(fā)育不良研究進(jìn)展

高倩茜，程 銳

南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒醫(yī)療中心，江蘇 南京 210008

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dyspla?sia，BPD）是極低出生體重兒常見的慢性肺病［1］。隨著圍產(chǎn)救治水平的提高，如產(chǎn)前糖皮質(zhì)激素、產(chǎn)后肺表面活性物質(zhì)的應(yīng)用、通氣技術(shù)的提升，明顯改善了早產(chǎn)/低出生體重兒，尤其是極低、超低出生體重兒的預(yù)后，使其生存率大大提升，但是BPD 的發(fā)生率未見明顯下降［2］。目前治療BPD的方法主要是呼吸管理、營(yíng)養(yǎng)支持以及藥物治療，但對(duì)于BPD 藥物治療的有效性及利弊仍然存在爭(zhēng)議。因此，仍然需要探索BPD 的新的治療方法。BPD 的主要病理特征為肺泡及肺微血管發(fā)育不良，可見肺泡數(shù)量減少、肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化及持續(xù)氣道炎癥反應(yīng)［3］。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）對(duì)肺部疾病具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)再生、促血管生成和抗纖維化等特性［4］?；谶@些特性，MSC 為BPD 提供了一種新的治療思路。研究發(fā)現(xiàn)，MSC 可以改善BPD動(dòng)物模型的肺泡簡(jiǎn)化及血管發(fā)育不良［5］，目前MSC 治療BPD 也已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段［6］。但有研究指出，雖然MSC治療后病肺的生理有了很大的改善，但在肺內(nèi)沒有明顯的細(xì)胞植入［7］，這表明MSC可能通過旁分泌方式發(fā)揮作用。最近，有研究指出使用間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體（mesenchymal stem cell?derived exosome，MSC?exo）可以使許多鼠肺疾病模型受益。MSC?exo是MSC分泌組中生理相關(guān)且功能強(qiáng)大的組成部分，有著與MSC相似的生物學(xué)功能，且MSC?exo 代替MSC 治療還可以避免大多數(shù)與細(xì)胞治療有關(guān)的安全問題［8］，如無增殖、分化潛能，基本無免疫原性、無排斥作用等，是值得期待的治療BPD的新方法。

1 MSC?exo

1.1 MSC?exo來源

MSC?exo是MSC分泌的胞外囊泡，包含蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA 和DNA 等物質(zhì)［9］，是MSC 分泌組（外泌體、微泡和凋亡小體）中生理相關(guān)且功能強(qiáng)大的組成部分［10］。MSC也稱為間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，由Frie?denstein 等［11］于1968年首次發(fā)現(xiàn)。MSC可以從不同來源分離，如臍帶、臍帶血、臍帶膠質(zhì)、骨髓、脂肪組織等［12］。在這些不同來源的MSC中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可能是一種理想的治療方法［13］，因?yàn)樗鼈円子谔崛『蛿U(kuò)增，成本低，收集過程無創(chuàng)，細(xì)胞含量高以及較低的免疫原性。根據(jù)MSC來源的不同（臍帶、骨髓、脂肪等），其衍生的外泌體可進(jìn)一步分成不同的亞類。

1.2 MSC?exo異質(zhì)性

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌的外泌體具有極強(qiáng)的異質(zhì)性，不同的微環(huán)境及不同的干預(yù)條件均會(huì)影響外泌體中包含的內(nèi)容物［14］。Liu 等［15］研究發(fā)現(xiàn)相比常規(guī)的培養(yǎng)條件，低氧條件下（1%O2）培養(yǎng)的MSC可分泌更多的外泌體，且其內(nèi)含的功能性物質(zhì)的量也有一定的變化。Ban 等［16］通過比較不同pH 的培養(yǎng)基對(duì)外泌體分離的影響發(fā)現(xiàn)，酸性條件是外泌體生存的有利壞境，其分離出的外泌體蛋白及核酸濃度與其他pH環(huán)境相比顯著增加。目前對(duì)于最佳的MSC培養(yǎng)條件仍需探索，使之可分泌出療效更好的外泌體以確保臨床療效。

1.3 MSC?exo分離及儲(chǔ)存

研究者一般選擇狀態(tài)好且增殖能力強(qiáng)的第3～5代MSC 的條件培養(yǎng)上清來分離外泌體。目前對(duì)于外泌體的富集和純化方法主要有：超速離心法、聚合沉淀法、超濾法及抗體親和捕獲法等。超速離心法是收集外泌體最常見及最常規(guī)的方法，大多數(shù)研究者用此方法收集，在此基礎(chǔ)上通過密度梯度的分離，可以獲得高純度的胞外囊泡［17］。但是，這種方法雖然純度高，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還可能破壞外泌體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致囊泡內(nèi)成分丟失。聚合沉淀法也是較為常用的方法，商品化試劑盒（ExQuick 試劑盒）即基于這種原理，其操作方便，耗時(shí)短，且無需使用昂貴的設(shè)備，但可能存在化學(xué)品污染，影響后續(xù)試驗(yàn)［18］。超濾法利用超濾膜通過壓力或離心設(shè)備收集外泌體，其濾膜易堵塞，導(dǎo)致提取外泌體的純度較低?？贵w親和捕獲法成本高，產(chǎn)量低，不適合臨床大規(guī)模的使用。對(duì)于提取出的外泌體還需要通過電鏡、免疫印跡以及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)進(jìn)一步的鑒定。目前，外泌體的提取及純化特別是如何大規(guī)模的提取出適用于臨床的外泌體仍然具有一定挑戰(zhàn)，還需要繼續(xù)摸索有利于外泌體生存及分離的條件，提高外泌體的提取效率以更好地適用于臨床。

分離出的外泌體在4 ℃的條件下可以儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)1 周而不會(huì)發(fā)生嚴(yán)重降解，但如果需要長(zhǎng)時(shí)間保存需要低溫凍存。重懸于無菌PBS溶液中的外泌體可以在-20 ℃保存6個(gè)月，在-80 ℃保存1年，且其形態(tài)及生物學(xué)特性不發(fā)生改變［19］。

2 MSC?exo在肺部的生物學(xué)功能

2.1 免疫調(diào)節(jié)

越來越多的肺部疾病被發(fā)現(xiàn)伴有一定的免疫功能紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，MSC?exo 具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，可以通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抑制炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)MSC?exo可通過直接接觸或者分泌可溶性因子抑制淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的增殖，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖以及調(diào)節(jié)M1型和M2型巨噬細(xì)胞的平衡［17，20-21］，從而起到免疫調(diào)節(jié)的作用。

2.2 促再生

當(dāng)肺部疾病出現(xiàn)肺損傷時(shí)，肺部細(xì)胞及其血管的再生對(duì)于損傷肺的肺部結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定具有重要作用。Zhu 等［22］發(fā)現(xiàn)MSC?exo 可以分泌可溶性因子如角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其可促進(jìn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（alveolar typeII epithelial cell，ATⅡ）增生，ATⅡ作為肺泡上皮的干細(xì)胞既可以分化為ATⅠ，也可以通過有絲分裂產(chǎn)生子代ATⅡ以維持自身的細(xì)胞群，因而MSC?exo通過對(duì)ATⅡ的再生修復(fù)發(fā)揮對(duì)肺損傷的保護(hù)作用。Braun 等［23］發(fā)現(xiàn)MSC?exo 還可以促進(jìn)肺血管的生成，對(duì)肺血管的生長(zhǎng)、發(fā)育有積極作用。

2.3 抗氧化應(yīng)激

氧化損傷是許多肺部疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要組成部分，一些損傷因素如感染或者機(jī)械通氣可使肺部因“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生大量氧自由基，加重肺部的損傷。MSC?exo可以減輕肺組織氧化應(yīng)激造成的損傷。Li 等［24］發(fā)現(xiàn)MSC?exo 大量表達(dá)microRNA?124?3p，并能直接靶向急性肺損傷大鼠中高表達(dá)的嘌呤能受體P2X 配體門控離子通道7（P2X7），抑制P2X7的表達(dá)，改善氧化應(yīng)激損傷。Lee等［25］用MSC?exo治療缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型中發(fā)現(xiàn)，MSC?exo可以通過調(diào)節(jié)miR?17/miR?204平衡來調(diào)控STAT3信號(hào)通路，對(duì)肺部發(fā)揮多效保護(hù)作用并抑制肺動(dòng)脈高壓。

2.4 抗炎

許多肺部疾病在發(fā)生發(fā)展中都伴隨著一定的炎癥反應(yīng)，失控的炎癥反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加劇疾病的嚴(yán)重程度。研究發(fā)現(xiàn)，MSC?exo 可以降低一些肺部疾病的炎癥水平，從而改善疾病的預(yù)后。Xu等［26］在急性肺損傷大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，MSC衍生的外泌體可以降低支氣管肺泡灌洗液和血漿中腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor α，TNF?α），白介素（interleu?kin，IL）?1β和IL?6 等炎癥因子水平。Liu 等［27］得到與之一致的結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)MSC?Exos 表達(dá)的mi?croRNA?451 通過TLR4/NF?κB 途徑來發(fā)揮作用。Zhu 等［22］發(fā)現(xiàn)MSC?exo 還可以通過分泌可溶性因子如角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子發(fā)揮抗炎作用。

2.5 抗纖維化

一些間質(zhì)性肺疾病在終末期可出現(xiàn)纖維化，通常呈慢性進(jìn)行性，嚴(yán)重影響疾病的預(yù)后。研究表明，MSC?exo 具有抗肺部纖維化的作用。Shentu等［28］研究人骨髓MSC衍生的胞外囊泡，發(fā)現(xiàn)其含有miR?630可以靶向特發(fā)性肺纖維化模型中成纖維細(xì)胞上調(diào)的促纖維化基因，具有抗纖維化的作用。

3 MSC?exo治療BPD研究現(xiàn)狀

3.1 可能作用機(jī)制

3.1.1 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型

肺部炎癥是BPD 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵特征。暴露在高氧或?qū)m內(nèi)感染、機(jī)械通氣中并發(fā)展成BPD的早產(chǎn)兒，其肺部可見明顯的炎癥細(xì)胞及炎癥因子的浸潤(rùn)。這些炎癥細(xì)胞及炎癥因子影響肺泡細(xì)胞完整性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)肺部結(jié)構(gòu)直接有害［29］。

肺巨噬細(xì)胞是肺免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用［30］。巨噬細(xì)胞屬于免疫細(xì)胞，在體內(nèi)分布廣泛。巨噬細(xì)胞從功能特征上主要被分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞（又稱M1型巨噬細(xì)胞）和替代性活化的巨噬細(xì)胞（又稱M2 型巨噬細(xì)胞）。M1型巨噬細(xì)胞可以分泌促炎性細(xì)胞因子，有促進(jìn)炎癥的作用；M2 型巨噬細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子，具有抗炎、促修復(fù)的作用。Willis 等［17］用來自人臍帶膠質(zhì)及人骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療BPD 模型小鼠，發(fā)現(xiàn)MSC?exo很容易被肺泡巨噬細(xì)胞吸收，并抑制巨噬細(xì)胞促炎性“M1”狀態(tài)同時(shí)增強(qiáng)抗炎性“M2樣”狀態(tài)，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到了一致結(jié)果，且反應(yīng)是劑量依賴性的。

3.1.2 促血管生成

肺微血管發(fā)育不良是新型BPD 病理改變的主要特征之一。肺血管的發(fā)育受部分血管生成相關(guān)因子調(diào)控。血管形成是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用的，一旦平衡破壞將導(dǎo)致異常的血管生成。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血管發(fā)生方面的核心因子，其表達(dá)水平對(duì)肺血管的生長(zhǎng)、發(fā)育、功能的維持均發(fā)揮重要作用。血清中VEGF 的降低可影響肺血管的發(fā)育［31］。

Braun 等［23］在間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到VEGF 蛋白，而在外泌體耗盡的培養(yǎng)基中則沒有檢測(cè)到，說明間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以生成VEGF。而后Braun 等［23］在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MSC 衍生的外泌體可以刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛的毛細(xì)血管網(wǎng)形成，用MSC衍生的外泌體治療BPD 大鼠，可防止肺泡生長(zhǎng)中斷并增加小血管數(shù)量。由此，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以通過促血管生成機(jī)制發(fā)揮作用。

3.1.3 分泌外泌體相關(guān)因子TSG?6

腫瘤壞死因子α刺激基因?6（tumor necrosis fac?tor α stimulated gene 6，TSG?6）是Lee 等［32］在篩選TNF?α誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，其編碼的分泌性蛋白是一種保護(hù)性的炎癥反應(yīng)因子，可響應(yīng)TNF?α和IL?1β等炎性介質(zhì)［33］。

Chaubey 等［34］在間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中檢測(cè)到TSG?6，含TSG?6的外泌體給予BPD小鼠減弱了BPD及其相關(guān)病理，在外泌體中通過NAb 或siRNA 敲除TSG?6 消除了其治療作用，表明TSG?6 是重要的治療分子。他們還發(fā)現(xiàn)，在BPD小鼠模型的肺中TSG?6 水平高度升高，這表明BPD 與TSG?6 升高水平相關(guān)。據(jù)此，Chaubey等［34］認(rèn)為外泌體中的TSG?6主要通過兩種途徑發(fā)揮作用：①對(duì)抗TNF?α和IL?1 的炎癥效應(yīng)；②MSC?exo 治療后炎癥增強(qiáng)達(dá)到治療水平的閾值。一旦達(dá)到這個(gè)水平，TSG?6 水平就會(huì)因負(fù)反饋反應(yīng)而降低，認(rèn)為TSG?6 是炎癥反應(yīng)中負(fù)反饋回路的一部分。

3.2 移植方式

3.2.1 移植途徑

研究發(fā)現(xiàn)靜脈內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)給予MSC?exo均有一定的治療效果。由于肺是BPD 治療的目標(biāo)器官，且呼吸樹是一個(gè)狹窄的環(huán)境，極低出生體重兒往往出生后需要?dú)夤懿骞埽虼藲獾谰植康巫SC?exos是易行、便捷、有效的給藥途徑［35］，且經(jīng)氣管內(nèi)給藥可以直接到達(dá)肺間隔，避開了全身應(yīng)用時(shí)要跨越的多層屏障。Chaubey 等［34］經(jīng)腹膜內(nèi)給BPD小鼠MSC?exo以達(dá)到全身運(yùn)用，發(fā)現(xiàn)外泌體對(duì)肺、腦及心臟的病理變化均有改善作用，因此當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)肺外器官的病理改變時(shí)，全身給藥是更好的選擇。

3.2.2 移植時(shí)機(jī)

小鼠肺的發(fā)育階段與人類早產(chǎn)兒的妊娠期在24～28周之間重疊，小鼠的肺泡化從出生后第5天開始［36］。Willis 等［17］給BPD 模型小鼠于生后第4 天外泌體治療，當(dāng)暴露于高氧的小鼠已經(jīng)回到室內(nèi)空氣1周后，與對(duì)照組相比，大多數(shù)由高氧引起的肺基因表達(dá)失調(diào)已恢復(fù)正常，這表明早期干預(yù)對(duì)于維持適當(dāng)?shù)姆尾堪l(fā)育至關(guān)重要。Willis 等［37］在后續(xù)研究中繼續(xù)研究合適的給藥時(shí)機(jī)，在BPD模型小鼠于生后第18 天單次給予MSC?exos 及生后18～39 d 接受連續(xù)治療，并與先前的生后4 d外泌體治療比較，發(fā)現(xiàn)早期和晚期干預(yù)均有效，不僅可以預(yù)防BPD 的發(fā)生，還可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)已BPD小鼠的心肺并發(fā)癥。

3.2.3 移植劑量

Willis等［17］靜脈給予小鼠在24 h內(nèi)由0.7×106個(gè)MSC 產(chǎn)生的外泌體，并取得一定的治療效果，但目前缺少不同劑量治療效果之間的比較，因此對(duì)于移植的最佳劑量仍未確定。且目前尚無基于外泌體的治療藥物的定量方法。大多數(shù)已發(fā)表的研究?jī)H依靠蛋白質(zhì)測(cè)量來進(jìn)行定量，但受分離程序的影響，該方法不夠精確［38］。因此，對(duì)于外泌體施用的最佳劑量仍需進(jìn)一步探索。

4 總結(jié)與展望

BPD 是一種常見于早產(chǎn)兒的慢性肺部疾病，由于發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，至今仍未發(fā)現(xiàn)有效治療方法。相關(guān)研究顯示，MSC?exo 具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、促進(jìn)再生及抗纖維化等特性，顯示出其有希望成為治療BPD 的有效手段。根據(jù)目前已有研究發(fā)現(xiàn)，MSC?exo 可有效緩解BPD 動(dòng)物模型的肺泡簡(jiǎn)化、肺纖維化以及肺血管重塑，肺功能和肺動(dòng)脈高壓也有所好轉(zhuǎn)。目前已有MSC?exo應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中（https：//www.clinicaltrials.gov/），MSC?exo 治療BPD 的臨床試驗(yàn)尚在招募中。本文根據(jù)現(xiàn)有研究總結(jié)了MSC?exo治療BPD可能的作用機(jī)制。但由于目前對(duì)MSC?exo 的認(rèn)知有限，MSC?exo 仍然存在未知成分，因此MSC?exo 對(duì)BPD 的治療作用可能存在其他作用機(jī)制，需要更多的實(shí)驗(yàn)去深入研究，同時(shí)對(duì)于如何大規(guī)模生產(chǎn)出可供臨床使用的MSC?exo，以及其最佳治療方式如移植時(shí)機(jī)、移植方式、移植劑量等問題也是應(yīng)用于臨床前需要解決的問題，距離其真正用于臨床仍有一定挑戰(zhàn)。隨著生物工程和細(xì)胞修飾技術(shù)的飛速發(fā)展，外泌體領(lǐng)域的下一步將是對(duì)外泌體表面和內(nèi)容物進(jìn)行工程改造或修飾，這可能會(huì)帶來更高的特異性，將其應(yīng)用擴(kuò)展到更復(fù)雜的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［39］。