外泌體在干燥綜合征診斷和治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

彭 馨，楊 鵬，馬武開，曾 蘋

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，貴州 貴陽 550002)

干燥綜合征(Sj?gren′s syndrome,SS)是一種針對(duì)外分泌腺受損的自身免疫性疾病，以淋巴細(xì)胞浸潤唾液腺和淚腺而導(dǎo)致口干和眼干為主要特征。SS可引起外分泌腺以外表現(xiàn)，如肌肉骨骼疼痛、疲勞及全身癥狀。非霍奇金淋巴瘤是SS最嚴(yán)重的并發(fā)癥，5%～10%的患者可并發(fā)非霍奇金淋巴瘤[1]?？购丝贵w(antinuclear antibody，ANA)是SS患者檢出率最高的自身抗體，而抗Ro/SSA和抗La/SSB是最常見的診斷抗體，也是最特異的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[2-3]。既往研究盡管對(duì)SS有較深入的認(rèn)識(shí)，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，其診斷及治療水平也有待進(jìn)一步提高。外泌體是細(xì)胞以出芽方式分泌的雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡。幾乎所有的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞均可分泌外泌體。外泌體含有疾病狀態(tài)下許多重要的信息物質(zhì)，是免疫應(yīng)答啟動(dòng)及免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì)，幾乎參與免疫應(yīng)答的全過程，包括抗原呈遞、T細(xì)胞活化、增殖和分化以及免疫抑制等，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SS等自身免疫性疾病的病程進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-7]。因此，深入開展外泌體研究有助于闡明SS發(fā)病機(jī)制，并提高SS的診斷和治療水平。本文對(duì)外泌體在SS病理機(jī)制、診斷和治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體形成和轉(zhuǎn)運(yùn)

外泌體是一種由細(xì)胞主動(dòng)分泌至細(xì)胞外的納米級(jí)脂質(zhì)雙層膜囊性小泡，呈球形或杯狀，直徑在40～100 nm之間，廣泛分布在體液中[5]。各種免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、干細(xì)胞等和非免疫細(xì)胞均可釋放外泌體[7-8]。外泌體的形成首先是由細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期內(nèi)體，內(nèi)體的膜再向內(nèi)出芽形成含有許多小泡的多囊泡體，當(dāng)多囊泡體的泡膜與細(xì)胞膜融合時(shí)將外泌體釋放到細(xì)胞外。外泌體可通過內(nèi)吞、直接膜融合或者受體配體相互作用進(jìn)入受體細(xì)胞，作為一種運(yùn)輸工具可將內(nèi)含物信息穩(wěn)定地傳遞給靶細(xì)胞。近10 a研究已經(jīng)明確證實(shí)，細(xì)胞外液中的外泌體可通過細(xì)胞膜受體直接與細(xì)胞膜融合或者被內(nèi)吞而釋放其內(nèi)含物進(jìn)而作用于靶細(xì)胞，這些過程已通過R18標(biāo)記的外泌體和PKH-67標(biāo)記的細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，且在熒光顯微鏡下能夠觀察到外泌體膜和細(xì)胞膜融合的過程[9-10]。此外，通過熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外泌體微RNA(microRNA，miRNA)可轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞[11]。以上研究結(jié)果提示，外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)過程體現(xiàn)細(xì)胞間信息物質(zhì)交流，與人體生理調(diào)節(jié)和病理過程進(jìn)展密切相關(guān)。

2 外泌體生物學(xué)特征

外泌體作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞間信息物質(zhì)傳遞的工具，具有以下特征：(1)外泌體內(nèi)含物十分豐富。外泌體內(nèi)含物包含細(xì)胞因子、三磷酸鳥苷(gross domestic product，GTP)酶、四跨膜蛋白超家族、熱休克蛋白、整合素等各種蛋白，磷酸甘油酯、膽固醇等脂類，以及信使RNA(messenger RNA，mRNA)、環(huán)狀RNA、非編碼RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、miRNA、單鏈DNA、基因組DNA等[5]。通過對(duì)各種組織進(jìn)行大規(guī)模分析，已粗略地建立了外泌體內(nèi)含物數(shù)據(jù)庫，包括11 261個(gè)蛋白質(zhì)條目、2 375個(gè)mRNA條目和764個(gè)miRNA條目[11-12]。(2)外泌體質(zhì)膜囊泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。外泌體質(zhì)膜囊泡具有牢固的雙分子磷脂結(jié)構(gòu)，內(nèi)腔可負(fù)載水溶性物質(zhì)，磷脂中間的疏水區(qū)可包裹疏水性物質(zhì)，這種特殊結(jié)構(gòu)能保護(hù)miRNA、mRNA等內(nèi)含物長期存在于體液中而不被降解，同時(shí)也可避免被免疫系統(tǒng)捕獲和清除，穩(wěn)定地將這些物質(zhì)攜帶的信息傳遞給靶細(xì)胞[13-14]。(3)外泌體具有快速傳遞信號(hào)及信號(hào)放大功能。外泌體的作用方式并不局限于細(xì)胞間的直接接觸，而是代表了一種新的遠(yuǎn)距離作用模式，具有快速傳遞信號(hào)及信號(hào)放大的功能[15]。

3 外泌體在SS病理機(jī)制中的作用

外泌體中含有細(xì)胞產(chǎn)生的眾多信息物質(zhì)，在抗原呈遞、凋亡、炎癥及分子通訊中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一般來說，外泌體的功能取決于原本宿主細(xì)胞和組織的狀態(tài)，除了參與生理過程外，還參與病理過程，包括癌癥、感染和自身免疫性疾病等[5,16]。SS的病理特點(diǎn)主要是淋巴細(xì)胞浸潤到外分泌腺，而浸潤的淋巴細(xì)胞中主要為T細(xì)胞，尤其是輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)等細(xì)胞亞群，上述細(xì)胞亞群的異常分化及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子紊亂已成為SS病理及其治療關(guān)注的熱點(diǎn)?，F(xiàn)有研究表明，外泌體可作為T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞活化的誘導(dǎo)因素直接參與免疫調(diào)節(jié)，例如：樹突狀細(xì)胞來源的外泌體可以增強(qiáng)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)I、MHC-II及其共刺激分子的表達(dá)，在處理抗原肽免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17]。Treg細(xì)胞活化可分泌大量的外泌體，通過外泌體中的miRNA抑制Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答、CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)及其自身免疫性疾病的發(fā)生[18]。巨噬細(xì)胞來源的外泌體可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，并促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞活化[19]。上述研究結(jié)果提示，外泌體可能參與SS淋巴細(xì)胞的異?；罨Ｒ延凶C據(jù)表明，外泌體與SS進(jìn)展直接相關(guān)，例如：KAPSOGEORGOU等[20]研究發(fā)現(xiàn)，SS患者唾液腺上皮細(xì)胞分泌大量的外泌體，且這些外泌體中含有大量上皮細(xì)胞骨架蛋白、抗Ro/SSA、抗La/SSB和Sm核糖核蛋白等，而這些特異性蛋白參與內(nèi)源性自身抗原呈遞，推測(cè)外泌體可能通過這些蛋白激活自身免疫反應(yīng)從而促進(jìn)SS的發(fā)生、發(fā)展；另一項(xiàng)研究表明，Epstein-Barr(EB)病毒miRNA可以從B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腺體上皮細(xì)胞而影響唾液分泌[21]。CORTES-TRONCOSO等[22]研究發(fā)現(xiàn)，含有miR-142-3p的T細(xì)胞源性外泌體可能是SS發(fā)病的觸發(fā)因子；當(dāng)miR-142-3p轉(zhuǎn)染唾液腺上皮細(xì)胞時(shí)，miR-142-3p可影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)而降低環(huán)磷酸腺苷產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腺體細(xì)胞功能障礙。目前，關(guān)于SS外泌體的研究報(bào)道有限，但外泌體作為免疫細(xì)胞信息物質(zhì)傳遞工具，其病理作用可能涉及SS患者多個(gè)系統(tǒng)和器官，深入開展外泌體研究有望為闡明SS發(fā)病機(jī)制提供新的視角。

4 外泌體作為標(biāo)志物在SS診斷中的作用

國際公認(rèn)的SS診斷標(biāo)準(zhǔn)包括眼部癥狀和口腔癥狀，干眼癥、唾液腺損害以及實(shí)驗(yàn)室檢查異常是主要客觀證據(jù)。ANA檢測(cè)對(duì)SS的診斷有一定價(jià)值，但 31.7%的健康人也可能存在ANA陽性[23]。類風(fēng)濕因子也不是SS特有的標(biāo)志物，因?yàn)樵谄渌陨砻庖咝约膊≈幸裁黠@增加，尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎?？筊o/SSA抗體具有良好的特異性，可在約2/3的SS患者中被發(fā)現(xiàn)，通常與抗La/SSB抗體同時(shí)出現(xiàn)。然而，在疾病早期，患者的癥狀可能并不典型，甚至血清學(xué)檢測(cè)不到陽性標(biāo)志物。目前，SS的診斷仍缺乏敏感和特異的生物標(biāo)志物，而外泌體中含有疾病狀態(tài)下許多重要的信息物質(zhì)，能夠全面反映疾病的本質(zhì)。此外，在人體的很多體液中都能檢測(cè)到外泌體，包括血清、尿液、唾液、乳液、精液、腦脊液和腹水等，有利于臨床采集標(biāo)本。由于在外泌體雙層脂質(zhì)膜的保護(hù)下，一些特異性蛋白或核酸分子可長期存在而不被降解，因而更有助于挖掘出更可靠的SS診斷標(biāo)志物。一些研究已經(jīng)證明，外泌體在SS及其自身免疫性疾病中具有一定的診斷價(jià)值。例如:AQRAWI等[24]從SS患者唾液和淚液中分離外泌體，認(rèn)為外泌體可作為SS診斷的生物標(biāo)志物。MICHAEL等[25]從SS患者腮腺唾液中提取miRNA，且SS患者唾液腺miRNA表達(dá)譜完全不同于健康對(duì)照組，提示miRNA檢測(cè)可作為炎癥或SS患者唾液腺功能障礙的潛在標(biāo)志物。盡管取得了這些有希望的研究成果，但外泌體或外泌體miRNA 作為SS診斷的可靠標(biāo)志物仍無足夠的臨床證據(jù)，未來尚需要更多的研究對(duì)上述發(fā)現(xiàn)加以論證[26]。此外，目前還缺乏外泌體應(yīng)用于SS疾病的活動(dòng)性和預(yù)后評(píng)估的研究報(bào)道。因此，外泌體或外泌體miRNA作為診斷SS潛在標(biāo)志物的特異性和敏感性尚需要進(jìn)一步研究。

5 外泌體作為運(yùn)輸工具在SS治療中的作用

SS患者的健康管理是長期和復(fù)雜的。目前，唾液代替品和人工眼淚可以緩解SS臨床癥狀，非甾體抗炎藥、羥基氯喹及皮質(zhì)類固醇也能夠有效地治療SS；其他一些免疫抑制劑如甲氨蝶呤、霉酚酸酯及生物制劑也是必需的。但長期使用這些藥物會(huì)引起許多不良反應(yīng)。外泌體在SS、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病治療中的潛在用途已被廣泛研究。外泌體中含有與細(xì)胞類似的許多生物學(xué)信息，其作為一種新的治療方法不僅可以提高細(xì)胞治療效果，還可以克服細(xì)胞治療的局限[27]。與細(xì)胞治療相比，外泌體治療具有性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存、無免疫原性、獲取容易且方便改造等諸多優(yōu)點(diǎn)[28]。KIM等[29]研究發(fā)現(xiàn)，用白細(xì)胞介素-10處理的樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體可以抑制膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。研究報(bào)道，表達(dá)吲哚胺的樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體具有免疫抑制和抗炎作用[30]。另有研究報(bào)道，富集人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體可有效緩解SS患者的眼部炎癥[31]。BULLERDIEK等[32]報(bào)道了19號(hào)染色體miRNA簇衍生的miRNA類似物可應(yīng)用于SS等自身免疫性疾病的臨床治療。眼部受累是SS的主要癥狀之一，最常見的治療方法是局部滴眼藥水，但也存在不良反應(yīng)，包括藥物被快速清除或生物活性迅速降低而降低治療效果。由于外泌體具有脂質(zhì)雙層膜，因而可作為遞送多肽或合成藥物的載體用于眼疾病的治療。例如，攜帶miRNA-126的干細(xì)胞源性外泌體通過抑制高遷移率族box1信號(hào)通路降低高血糖血癥誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎癥，提示用干細(xì)胞來源的外泌體治療SS相關(guān)的干眼癥可能是一種理想治療方法[33]。雖然外泌體在SS的治療應(yīng)用方面已經(jīng)顯示出了較好的效果，但這些治療效果大多停留在實(shí)驗(yàn)觀察階段，要在臨床應(yīng)用還面臨諸多挑戰(zhàn)。

6 小結(jié)與展望

外泌體在SS的診斷及治療領(lǐng)域已經(jīng)顯示出巨大的潛力，但仍然面臨諸多問題：首先，外泌體在SS發(fā)生中的作用，以及作為生物標(biāo)志物和作為載體的治療價(jià)值相關(guān)理論尚未完全清楚；其次，目前用于外泌體和外泌體miRNA的檢測(cè)、分離和純化方法仍比較繁瑣和復(fù)雜，有必要尋找簡(jiǎn)單、廉價(jià)和可復(fù)制的技術(shù)；再次，在制備和保存高質(zhì)量的外泌體方面，現(xiàn)有的方法仍不足，需要尋找更優(yōu)越的外泌體制備和保存方法以獲得高質(zhì)量外泌體。盡管關(guān)于SS外泌體的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究仍處于初級(jí)階段，但從理論上說，外泌體含有疾病狀態(tài)下許多重要的信息物質(zhì)，能夠真實(shí)反映疾病的本質(zhì)，其內(nèi)含物在脂質(zhì)雙層膜的保護(hù)作用下可長期存在體液中而不被降解。因此，開展外泌體研究不但有利于揭示SS的發(fā)病機(jī)制，還有助于挖掘出更優(yōu)越的生物診斷標(biāo)志物。此外，外泌體含與細(xì)胞類似的許多生物信息，并以內(nèi)分泌模式作用于遠(yuǎn)處的靶細(xì)胞，具有快速傳遞信號(hào)及信號(hào)放大的能力；因此，外泌體作為載體不僅可代替細(xì)胞治療發(fā)揮更好的生物治療效果，而且可克服細(xì)胞治療的瓶頸。值得關(guān)注的是，中藥對(duì)SS的治療效果確切，但能否通過這些中藥刺激干細(xì)胞分泌具有中藥類似治療作用的外泌體來代替中藥本身治療，使其外泌體在發(fā)揮對(duì)SS治療作用的同時(shí)，克服中藥治療的缺陷，從而提高中藥的應(yīng)用價(jià)值，這一問題值得關(guān)注。因此，深入廣泛地開展外泌體研究有望提高SS的診斷和治療水平。