外泌體在心房顫動發(fā)生中的作用及其應用?

陳慧宇 趙慶彥

外泌體是細胞外囊泡的一種,早期研究將外泌體作為細胞運輸代謝廢物的一種形式。目前的研究表明,在不同環(huán)境條件下,細胞分泌包含有各種信號因子(如DNA、RNA、細胞因子等)的外泌體,靶向作用于特定細胞,促進細胞間的信息交流[1]。前期研究顯示外泌體與腫瘤發(fā)生密切相關,隨著研究的不斷進展,發(fā)現(xiàn)外泌體在心房顫動(簡稱房顫)發(fā)生機制中起著重要作用,有可能成為房顫診療的新靶點。筆者就外泌體與房顫的發(fā)生機制作一綜述。

1 外泌體的來源及其作用

外泌體是一種細胞外囊泡,幾乎所有的細胞均可分泌,存在于乳汁、唾液、尿液、腦脊液等多種體液中,其直徑約40～160 nm。首先,細胞通過內(nèi)吞作用形成杯狀結構即內(nèi)吞囊泡,后者包括細胞外環(huán)境中的可溶性蛋白及膜表面蛋白,參與早期核內(nèi)體(ESEs)的產(chǎn)生,也可直接與已存在的ESEs融合。同時,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體也參與了ESEs的形成[2]。隨后在Rab蛋白的作用下ESEs成熟形成晚期核內(nèi)體(LSEs),后者在核內(nèi)體轉運復合體(ESCRT)的作用下形成腔內(nèi)小泡(ILVs)和多泡體(MVBs)。ESCRT 在這個過程中起著重要的分選作用,決定ILVs所運輸?shù)男》肿游镔|(zhì)的含量及其釋放速率,使得最終生成的外泌體具有細胞特異性[3]。MVBs可在細胞質(zhì)中被溶酶體或自噬體降解,也可以通過胞吐方式將ILVs釋放到胞外形成外泌體[2]。

外泌體的細胞膜上含有豐富的跨膜蛋白,參與外泌體的合成、分選、釋放、黏附、融合等多種生理過程。四跨膜蛋白(CD9,CD63,CD81)在外泌體中高度表達,參與外泌體的合成和運輸。表皮生長因子受體(EGFRs)、上皮細胞黏附分子(Ep CAM)、整合蛋白、選擇素以及CD40反映了外泌體細胞質(zhì)膜的起源,是外泌體重要的生物學標志。此外,多種管腔蛋白在外泌體中發(fā)揮著各自不同的生理功能。TSG101,ALIX,Rabs,膜聯(lián)蛋白有著特異性的膜受體結合能力,負責外泌體的合成及外泌體運載蛋白的篩選。細胞骨架蛋白(如肌動蛋白、微管蛋白、原肌球蛋白)、分子伴侶(如熱休克蛋白HSP60)、多種代謝酶以及核糖體蛋白也存在于外泌體中[4]。根據(jù)來源的細胞所處的生理病理狀態(tài)不同,外泌體運載不同種類的蛋白質(zhì)、DNA、多種RNA,如信使RNA(m RNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(microRNAs)、脂類以及生物活性分子等物質(zhì),這些小分子物質(zhì)具有細胞特異性,通過內(nèi)吞作用、膜融合、受體配體結合等方式靶向作用于受體細胞,調(diào)節(jié)細胞之間的信息交流[5]。外泌體存在于多種體液中,在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用,有望成為疾病新型診斷指標和治療靶點[6]。

2 不同來源的外泌體與心房重構和房顫誘發(fā)的關系

研究發(fā)現(xiàn)心臟中的多種細胞均可分泌外泌體,如心肌細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、心臟祖細胞等[7]。一方面,外泌體在維持細胞的正常結構和功能方面發(fā)揮了重要作用;另一方面,在病理狀態(tài)下,外泌體通過調(diào)節(jié)細胞間的信息交流從而調(diào)控基因表達,參與心房重構過程,誘導房顫的發(fā)生。下面討論不同來源的外泌體在房顫發(fā)生機制中的作用。

2.1 脂肪組織 研究表明,心房纖維化是心房重構的重要標志,纖維化過程改變了心肌細胞間縫隙鏈接蛋白43(CX43)的生理特性,使其電阻抗增高,心房電傳導速度降低,形成房顫發(fā)生和維持的結構基礎[8]。脂肪組織作為多種炎性細胞和炎性因子趨化募集的重要“工廠”,在房顫心房纖維化重構和電重構的發(fā)生過程中占有重要地位。Pan等[9]研究發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪組織來源的外泌體攜帶的miR-34a可靶向作用于轉錄調(diào)節(jié)因子KLF4抑制M2型巨噬細胞的極化,提高M1型巨噬細胞的活性。而M1 型巨噬細胞能促進脂肪細胞基質(zhì)重塑,導致膠原蛋白的堆積和纖維化的形成[10]。研究發(fā)現(xiàn)房顫患者心房組織中促炎型M1型巨噬細胞增加,后者通過分泌IL-1β抑制心房肌細胞顫動蛋白(QKI)的表達,加劇心房電重構[11]。Shaihov-Teper等[12]收集32 例房顫患者和30 例非房顫患者心臟手術后的心外膜脂肪(EAT),分離純化EAT 中的外泌體,分析了外泌體的數(shù)量、大小、形態(tài)、特異性標志物、運載的細胞因子、蛋白質(zhì)組和微小核糖核苷酸,通過將外泌體與人心房間充質(zhì)基質(zhì)細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)、外泌體干預誘導人多能干細胞來源的心肌細胞的房顫模型、小鼠外泌體心室注射等方法,發(fā)現(xiàn)與來自非房顫患者的EAT 外泌體相比,來自房顫患者的EAT 外泌體對人心房間充質(zhì)基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞的增殖和遷移有更大的影響,房顫患者EAT 來源的外泌體能誘發(fā)心肌細胞房顫模型持續(xù)折返轉子的形成。提示房顫患者的EAT 來源的外泌體具有獨特的促炎、促纖維化和促心律失常的特征,揭示了EAT 是促進房顫發(fā)生的另一種途徑。

2.2 成纖維細胞 成纖維細胞作為心房纖維化的重要參與者,其產(chǎn)生的外泌體miRNA 加速了心房纖維化的進程,提高了房顫的易感性。有研究顯示在快速起搏1周犬的左心房成纖維細胞中,鈣瞬時受體電位通道(TRPC3)蛋白表達明顯增加,而miR-26表達下調(diào)。房顫誘導心房成纖維細胞的活化T 細胞核因子(NFAT)激活,經(jīng)核定位及量化技術表明其5'啟動子區(qū)域結合是miR-26的靶向結合位點,負向調(diào)節(jié)miR-26 的轉錄而增加TRPC3 通道的表達,從而促進TRPC3依賴的成纖維細胞增殖和分化,參與房顫的發(fā)生和維持[13]。Lyu等[14]研究表明AngⅡ能刺激心臟成纖維細胞產(chǎn)生外泌體,后者通過旁分泌效應作用于心肌細胞,提高心肌細胞表面AT1和AT2受體表達水平,增強了腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)對心肌細胞的作用,從而促進了心肌細胞的肥大。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)肌成纖維細胞(myofibroblasts,MFB)來源的外泌體可以抑制心肌細胞中L 型鈣離子通道(Cav1.2)的表達,將MFB 來源的外泌體與心肌細胞共培養(yǎng),心肌細胞中的Cav1.2表達明顯下調(diào),此外MFB 源性外泌體能顯著降低腎上腺素處理后的心肌細胞的鈣離子內(nèi)流信號,MFB外泌體中包含有miRNA-21-3p,一個潛在的Cav1.2抑制性miRNA,上調(diào)了心肌細胞對MFB 的反應性,進一步降低了心肌細胞Cav1.2的表達,增加了房顫的易感性。

2.3 心房肌細胞 心肌細胞來源的外泌體可通過miRNA調(diào)節(jié)靶細胞基因水平的表達,參與心臟微環(huán)境中的各種細胞活動[16]。Girmatsion等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-1在房顫患者心房組織中表達水平下降,其上調(diào)了鉀離子通道蛋白亞基的表達,使得內(nèi)向整流鉀離子通道Ik1的表達增加,加速心房肌細胞的復極過程,可能與房顫電重構中心房有效不應期縮短有關。而Jia等[18]通過兔右心房快速起搏后,發(fā)現(xiàn)心房肌細胞miR-1表達升高,其靶向調(diào)節(jié)KCNE1和KCNB2下調(diào),同時降低了心房有效不應期,心房IKs增加,由此表明miR-1在房顫的電重構中起重要作用。Lu等[19]研究來自房顫患者和犬房顫模型的心房組織,發(fā)現(xiàn)心房肌細胞中的miR-328能特異性地作用于Cav1.2基因CACNA1C,使Cav1.2表達水平下降,縮短動作電位時程,促進心房電重構的發(fā)生。Reilly等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-31在房顫患者心房肌細胞中特異性表達,并降低了房顫患者心房肌營養(yǎng)不良蛋白和神經(jīng)源性一氧化氮合酶(n NOS)的含量,在房顫小鼠中,miR-31過表達或n NOS信號中斷后,縮短了心房動作電位時程及其速率依賴性,導致心房表型改變誘發(fā)房顫。相比之下,在房顫患者心房肌細胞中沉默miR-31 可恢復肌營養(yǎng)不良蛋白和n NOS,并使動作電位持續(xù)時間及其速率依賴性正常化。研究表明在小鼠房顫模型組心房肌細胞miR-122的表達明顯較對照組升高,miR-122抑制劑組較房顫組和對照組的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)/總ERK 比值顯著增加,在抑制miR-122后,抗凋亡蛋白BCL-X 的表達顯著降低,結果提示,miR-122可能參與房顫發(fā)生過程中心肌細胞增殖和凋亡分子機制[21]。Sun等[22]發(fā)現(xiàn)激活T 細胞核因子LncRNA非編碼阻遏物NRON 的過表達抑制了來自心房肌細胞包含的miR-23a的外泌體表達,促進了巨噬細胞極化,減輕了心房纖維化。Lv等[23]建立大鼠房顫模型,發(fā)現(xiàn)心房過表達miR-27b-3p,后者可降低房顫的發(fā)生率和維持時間,減輕心房纖維化,增加心房CX43 的表達水平,降低膠原-Ⅰ、α-SMA、膠原-Ⅲ、TGF-β1、Wnt3a 和p-β-Catenin 的表達。MiR-27b-3p通過靶向作用于Wnt3a調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路,在心房纖維化和房顫的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2.4 心包液 最近研究發(fā)現(xiàn)在房顫微環(huán)境刺激下,人心包液中包含的外泌體可影響心臟成纖維細胞和內(nèi)皮細胞參與的纖維化過程。Liu等[24]收集9例成人先天性心臟疾病伴持續(xù)性房顫和竇性心律手術患者的心包液(pericardial fluid,PF)樣本,通過生物信息學分析(簡稱生信分析)評估m(xù)iRNA 的表達,結果顯示miR-382-3p、miR-3126-5p 和miR-450a-2-3p參與心臟纖維化相關的KEGG 通路,如蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)/糖原合酶激酶-3p(GSK-3P)和TGF-β/MAPK1通路,在房顫進展中發(fā)揮潛在的作用。Liu等[25]采用GSE55296 數(shù)據(jù)集進行基因篩查,其中LncRNA 即AC022532.1、LINC00636和SNHG16 下調(diào),生信分析顯示,miR-450a-2-3p 是 LINC00636 的潛在靶基因,推測LINC00636/miR-450a-2-3p在房顫發(fā)生過程中有潛在功能。該研究組分別收集了12名房顫患者和非房顫患者PF中的外泌體,發(fā)現(xiàn)房顫患者PF 外泌體中LINC00636 和miR-450a2-3p的表達均低于非房顫患者組。將分離得到的PF外泌體和miR-450a-2-3p分別與成纖維細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞和大鼠原代內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),PF 外泌體LIN00636靶向調(diào)節(jié)miR-450a2-3p,后者抑制TGF-β1 誘導成纖維細胞的激活,同時也抑制了TGF-β1誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮-間質(zhì)纖維化過程,降低了纖維化程度,據(jù)此推測人心包液中的外泌體包含的LINC00636 靶向促進miR-450a-2-3p的表達,可能參與抑制房顫患者心房纖維化過程。

3 血漿外泌體可能成為房顫的臨床生物學標志物

由于外泌體所包含的小分子物質(zhì)可以反應其細胞來源,通過測定循環(huán)血液中不同類型的外泌體,可以作為生物學標志反映疾病早期的病理狀態(tài)[6]。Su等[26]收集34例陣發(fā)性房顫患者和33例非陣發(fā)性房顫患者的外周血清標本,通過微陣列檢測白細胞中的lncRNA 譜,發(fā)現(xiàn)在陣發(fā)性房顫患者和對照組之間分別發(fā)現(xiàn)了2 095個和1 584個差異表達的基因,通過生物信息(簡稱生信)分析(LncRNAs分類和亞組、基因本體分析、途徑分析和基因共表達網(wǎng)絡構建)結果表明陣發(fā)性房顫患者LncRNAENST00000559960 和LncRNAuc004aef3可能對房顫的發(fā)生有預測作用。Mun等[27]通過臨床研究發(fā)現(xiàn),相比于陣發(fā)性房顫和陣發(fā)性室上性心動過速患者,miR-107,miR-103a,miR-320d,miR-486和miR-let-7b在持續(xù)性房顫患者血漿中較竇性心律患者表達增加4.5倍以上,生信分析結果提示這些miRNA 可能與心房功能和結構信號通路有關,如心肌細胞中的縫隙鏈接、黏附連接和腎上腺素能信號;氧化應激信號,如MAPK、Wnt和缺氧誘導因子1在內(nèi)的纖維化信號通路。

補體介導的炎癥反應可能是導致房顫的另一個因素。Ni等[28]基于竇性心律和房顫患者血清蛋白組學分析,證實房顫患者血清外泌體的補體激活和蛋白質(zhì)折疊改變;蛋白質(zhì)二硫化物異構酶(PDI)、真核翻譯延伸因子(eEF1A)和(脯氨酰順反異構酶)Pin1表達參與蛋白質(zhì)合成和折疊。房顫患者血清外泌體中PDI、eEF1A 和Pin1表達降低可能會破壞蛋白質(zhì)平衡,加速氧化應激和活性氧的形成,這些同樣也參與了房顫的發(fā)生發(fā)展。外泌體與房顫的發(fā)病機制和血栓形成風險增加有關,具有促炎和促血栓形成的特性[29]。研究表明單核巨噬細胞系可能是循環(huán)血液中攜帶組織因子(TF)的外泌體的主要來源,血小板、內(nèi)皮細胞和中性粒細胞在一定條件下可產(chǎn)生攜帶TF的外泌體[30]。Chung等[31]報道房顫患者血漿中TF水平升高。攜帶TF、陰離子磷脂、尤其是外表面攜帶磷脂酰絲氨酸的外泌體是血栓形成的危險因素[32]。外泌體,尤其是miRNA,作為房顫的臨床生物標志,可能有助于評估和劃分風險,個體化治療以及評估房顫患者的預后。識別可確定卒中風險房顫臨床生物標志物將有助于指導血栓栓塞卒中高危房顫患者的抗凝治療[33]。

4 外泌體在房顫治療中的應用前景

外泌體有著較好的生物相容性、納米級的直徑以及獨特的運輸功能,可以運載藥物、基因到體內(nèi)發(fā)揮作用,因而外泌體可能成為比基于細胞治療更有效的診斷和治療方向[34]。目前外泌體已經(jīng)應用于臨床疾病的治療,Alvarez-Erviti等[35]利用外泌體作為載體,修飾外源性短鏈干擾RNA 并靶向作用于小鼠大腦,證明了外泌體在神經(jīng)退行性疾病治療應用中的獨特潛力。Hirai等[36]已將心肌球樣細胞來源的外泌體miRNA 應用于小兒擴張性心肌病的心肌修復,并發(fā)揮了顯著的治療效果。將具有保護作用的外泌體應用于房顫的臨床治療可能成為房顫治療的全新發(fā)展方向。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)、胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)以及心肌祖細胞(cardiac progenitor cells,CPCs)、心球樣細胞(cardiosphere-derived cells,CDCs)可產(chǎn)生攜帶有不同類型的miRNA、蛋白質(zhì)的外泌體,后者通過旁分泌、血液循環(huán)等途徑作用于特定的靶細胞,在改善心功能、減輕心臟纖維化、減少心肌細胞凋亡、促進血管生成以及調(diào)節(jié)miRNA 的表達等方面起著重要的作用[37]。下面分別介紹上述細胞產(chǎn)生的外泌體在心房結構重構、電重構及氧化應激中的保護作用。

在缺氧條件下CPCs通過釋放外泌體,抑制TGF-β促成纖維細胞活化效應,降低促纖維化基因的表達,并促進血管生成和心肌細胞的存活。將CPC來源的外泌體與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)24 h后,內(nèi)皮細胞中血管生成基因表達上調(diào),明顯促進內(nèi)皮細胞管狀結構的形成,CPC 外泌體增加梗死后心臟左室射血分數(shù),明顯減低了心臟梗死后的纖維化水平[38]。CDCs源性外泌體中的Y RNA 片段能調(diào)節(jié)IL-10的基因表達,經(jīng)外泌體干預后的巨噬細胞能顯著降低缺血再灌注心肌細胞的死亡率[39],而IL-10 是重要的心臟保護性細胞因子[40],將CDC源性外泌體的Y RNA 片段輸注到心肌梗死的大鼠心臟中,心肌梗死的面積明顯縮小,梗死區(qū)域內(nèi)M1型巨噬細胞明顯減少,凋亡心肌細胞明顯減少[39]。MSCs產(chǎn)生的外泌體通過旁分泌作用調(diào)控鈣離子操縱基因的表達、肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋-ATP酶活性和心臟組織纖維化,建立人MSC-心肌細胞旁分泌模型和纖維化心臟組織模型,與對照組相比,蛋白質(zhì)組學分析提示MSC 外泌體通過PI3K/AKT 信號途徑使得心肌細胞在1 Hz起搏條件下產(chǎn)生的收縮力較對照組增加了4倍,在無成纖維細胞的模擬二維心臟單層組織中,人MSC 外泌體干預模型組,單個心肌細胞動作電位時程縮短,傳導速度降低,至心律失常性增加[41],因而MSC 是否對纖維化心臟組織的致心律失常性有保護作用需要進一步研究加以驗證。

研究發(fā)現(xiàn)將miR-320d模擬物轉染骨髓間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AMSCs),將后者產(chǎn)生的外泌體與房顫心肌細胞共培養(yǎng),結果顯示,在AMSCs、外泌體和心肌細胞中的miR-320d水平明顯增加,STAT3是miR-320d的直接靶基因,其在房顫心肌細胞中下調(diào),心肌細胞凋亡明顯減少,細胞活力增加[42]。Barile等[43]收集接受心臟手術患者心耳組織中CPCs和胸骨骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BMCs)中的外泌體,分別將兩者的外泌體與心肌細胞共培養(yǎng),CPC外泌體比BMC 外泌體更有效地阻止星形孢菌素誘導的細胞凋亡,在大鼠心肌梗死模型中,CPC外泌體較BMC外泌體更有效地減小心肌瘢痕面,改善心室功能。蛋白質(zhì)組學分析表明妊娠相關血漿蛋白A(PAPP-A)在CPCs分泌的外泌體中通過調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子(IGF-1)的釋放,使得Akt和細胞外活動調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)發(fā)生磷酸化,降低了凋亡蛋白酶caspase的活性,減少心肌細胞的凋亡。

上述外泌體可發(fā)揮逆轉心律失常、抗纖維化、抑制心肌細胞凋亡等心臟保護效應,將這些保護性外泌體進一步應用于房顫的臨床治療可能成為新的研究方向。細胞分泌的外泌體經(jīng)修飾后可產(chǎn)生補丁外泌體、基因工程外泌體、靶向外泌體以及干細胞源性外泌體,通過心臟補丁、心肌內(nèi)注射、靜脈/冠狀動脈等途徑特異性作用于心肌細胞用于心血管疾病的治療[44],可以為外泌體在房顫中的研究提供切實可行的方案。通過設計基因工程外泌體/干細胞源性的外泌體,運載抗炎、抑制纖維化的蛋白質(zhì)、藥物等,靶向作用于受體細胞,抑制心臟成纖維細胞參與纖維化的病理過程,減少細胞外基質(zhì)的堆積[45],進一步應用于抑制心房纖維化過程,有可能為抑制房顫心房重構提供新的研究思路。然而基于外泌體的治療還存在有諸多挑戰(zhàn),一是外泌體的分離純化技術還不夠成熟,其生物學特性還存在一定的不穩(wěn)定因素;二是外泌體運載機制尚未明確,而外泌體作用于受體細胞可能會帶來其他潛在風險等,將外泌體應用于房顫的治療需要進一步研究和探索。

5 小結

心臟不同類型細胞分泌的外泌體通過介導各種信號轉導參與心房重構及炎癥反應、氧化應激等病理過程,形成房顫發(fā)生的重要病理基質(zhì)。血漿中特定外泌體水平可能反映房顫的病理狀態(tài),成為房顫臨床生物學標志物。而來源于CPCs,ESCs,CDCs等細胞的外泌體在房顫中發(fā)揮著重要的抗炎、抗纖維化和心臟保護效應。通過基因工程技術設計特異性外泌體靶向作用于受體細胞,抑制心房重構,改善心房纖維化,調(diào)節(jié)K＋、Ca2＋等離子通道介導的心房電生理紊亂,可能成為房顫治療的新方案。