基于BSMV 病毒載體的作物內(nèi)源miRNA 功能研究

焦 健，沙小晶

（中國(guó)科學(xué)院科技戰(zhàn)略咨詢(xún)研究院，北京 100190）

一、作物miRNA 的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

利用生物信息學(xué)的途徑預(yù)測(cè)并發(fā)現(xiàn)新的miRNA 是一種有效方法，它以計(jì)算機(jī)程序分析為基礎(chǔ)、以給定的基因組序列為范圍，在動(dòng)植物中鑒定出許多miRNA[1]。此方法可以鑒定那些表達(dá)量低或有時(shí)空表達(dá)特性的miRNA，利用miRNA 前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征、熱力學(xué)穩(wěn)定性和物種間的相對(duì)保守性，尋找同源miRNA。

植物miRNA 的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法有同源性比對(duì)、與靶標(biāo)基因相結(jié)合、模式學(xué)習(xí)等方法[2]。同源性比對(duì)是根據(jù)同源miRNA在物種間的相對(duì)保守性和pre-miRNA 前體的結(jié)構(gòu)特征來(lái)搜索miRNA。利用miRNA 與其靶標(biāo)基因可以發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)的特點(diǎn)，以及該配對(duì)方式也具有保守性，可以結(jié)合miRNA 的靶標(biāo)基因，作為預(yù)測(cè)中的一個(gè)篩選條件，這種與靶標(biāo)基因相結(jié)合來(lái)預(yù)測(cè)miRNA 的方法進(jìn)一步提高了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。模式學(xué)習(xí)是預(yù)先訓(xùn)練計(jì)算機(jī)程序?qū)σ阎?yáng)性miRNA 數(shù)據(jù)集和陰性miRNA 數(shù)據(jù)集的識(shí)別，進(jìn)而對(duì)未知數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析的技術(shù)手段，該方法通過(guò)區(qū)分miRNA 和非miRNA 的天然特點(diǎn)，成為預(yù)測(cè)新miRNA 的一種途徑。

根據(jù)以上預(yù)測(cè)方法的基本原理，出現(xiàn)了系列miRNA 及其靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)軟件，如：miRanda、DIANA-microT、RNAhybrid、TargetScan、MicroInspector、PicTar、TargetBoost、miTarget、RNA22 和microTar 等[3]。這些程序或預(yù)測(cè)軟件各有優(yōu)缺點(diǎn)，還需其他方法加以佐證才能真正鑒定新的miRNA。

二、作物miRNA 的高通量測(cè)序法

近年來(lái)，第二代測(cè)序法即高通量測(cè)序法被廣泛應(yīng)用于植物siRNA 或miRNA 的測(cè)序和鑒定，客觀上加快了siRNA 和miRNA研究進(jìn)展，使大規(guī)?？寺RNA 并分析它們的功能成為可能。

高通量測(cè)序法具有高通量、高靈敏度、雜交特異性好等優(yōu)點(diǎn)。該方法首先需提取植物組織的Total RNA，用高密度聚丙烯酰胺凝膠電泳回收長(zhǎng)度為18～30 nt 的sRNA，將得到的sRNA 5’和3’端加特異的接頭adaptor，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄和PCR 級(jí)聯(lián)擴(kuò)增，建立富含18～30 nt的sRNA 文庫(kù)，再高通量上機(jī)測(cè)序得到大量初始數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)這些初始數(shù)據(jù)的比對(duì)、分析和鑒定，可以獲得相當(dāng)可觀的信息。

目前，通過(guò)高通量測(cè)序法建立的miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)有：GEO（Gene Expression Ommibus）、miRBase、ASRP（Arabidopsis Small RNA Project）、Rfam、MPSS（Massively Parallel Signature Sequencing）和TarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)等[4]。

三、作物miRNA 靶標(biāo)基因的鑒定和研究

miRNA 靶標(biāo)基因的鑒定并進(jìn)而對(duì)其的功能分析，是研究miRNA 生物學(xué)功能的重要環(huán)節(jié)[5]。由于miRNA 可以與其靶標(biāo)基因互補(bǔ)配對(duì)，因此，可以較方便的利用生物信息學(xué)方法，比對(duì)miRNA 所在的物種基因組全序列或部分ESTs 數(shù)據(jù)庫(kù)，就能對(duì)miRNA 的靶標(biāo)基因進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。

初步預(yù)測(cè)得到的候選miRNA 靶標(biāo)基因，還需通過(guò)其他試驗(yàn)方法加以驗(yàn)證，最終結(jié)合多種miRNA 靶標(biāo)基因鑒定的方法，可以確定一個(gè)miRNA 的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)基因。其中，5’RACE 方法可以在轉(zhuǎn)錄水平鑒定miRNA 對(duì)其靶標(biāo)基因的切割降解，通過(guò)5’RACE 卻不能擴(kuò)增到的候選基因，即為miRNA 的靶標(biāo)基因。

Western bloting 方法可以在翻譯水平鑒定miRNA 對(duì)其靶標(biāo)基因翻譯的抑制，Western 雜交后目的蛋白條帶不清晰或沒(méi)有蛋白條帶的候選基因，即為miRNA 的靶標(biāo)基因。

利用Northern bloting 方法可以檢測(cè)靶標(biāo)基因的降解片段，從而在體外驗(yàn)證miRNA 對(duì)靶標(biāo)基因的切割降解。

通過(guò)對(duì)miRNA 靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)和各種鑒定后，對(duì)其功能分析也可以間接證明內(nèi)源miRNA 的功能，因此，miRNA 靶標(biāo)基因的鑒定和研究對(duì)分析miRNA 功能和作用具有重要意義[6]。

四、miRNA 研究案例

1、植株材料

大麥材料：I10；小麥材料：中國(guó)春；其他植株材料：本生煙、擬南芥、短柄草等。

2、載體和菌株

VIGS 相關(guān)的病毒載體包括：BSMV-LIC 載體（α,β 和γ 均為DNA 質(zhì)粒）。

表達(dá)載體包括：pGreen 載體，用于內(nèi)源siRNA 或miRNA 在本生煙中高表達(dá)。

克隆載體包括：pEASY-T、Gateway 相關(guān)載體。

大腸桿菌菌株包括：DH5α 和DH10B；農(nóng)桿菌菌株包括：GV3101 和EHA105。

3、BSMV pCaBS-γ-LIC 載體的構(gòu)建

用于內(nèi)源基因沉默：PCR 擴(kuò)增目的片段時(shí)（最優(yōu)片段大小約為200-400bp），正向引物5’端需加LIC 接頭的序列為：5’-AAGGAAGTTTAA-3’，反向引物5’端需加LIC 接頭的序列為：5’-AACCACCACCACCGT-3’。

操作流程：PCR 擴(kuò)增帶有LIC 接頭的目的片斷；將pCaBSγ-LIC 載體用ApaI 完全酶切，并依照以下流程將目的片段與載體用LIC 克隆方法連接：

若將攜帶amiRNA 的miRNA 前體序列插入BSMV pCaBS-γ-LIC載體，需要利用多重PCR，用amiRNA 和amiRNA*序列替換內(nèi)源的miRNA 和miRNA*序列，并保持原miRNA 前體二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)不變。

4、結(jié)果與分析

目前，越來(lái)越多的miRNA 通過(guò)測(cè)序或生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的手段被報(bào)道，而僅有其中少數(shù)被研究透徹。通過(guò)表達(dá)和沉默miRNA是廣泛使用的反向遺傳學(xué)策略，為驗(yàn)證BSMV 表達(dá)miRNA 前體而產(chǎn)生vamiRNA 或“與miRNA 序列相同的sRNA”（以vsiRNA表示）能否用于研究麥類(lèi)作物內(nèi)源miRNA 的功能，可利用BSMV 病毒載體在麥類(lèi)作物和模式植物短柄草中表達(dá)miRNA 前體以產(chǎn)生vsiRNA，或利用vamiRNA 沉默內(nèi)源miRNA。

（1）構(gòu)建基于BSMV 的vsiR_miRNA 表達(dá)載體

在大麥品種I10 中分別過(guò)表達(dá)HvuMIR164 和HuvMIR171 前體（以下用BSMV：vsiR_miR164 和BSMV：vsiR_miR171 表示），利用半定量End-point Stem-loop RT-PCR 檢測(cè)到內(nèi)源miR164 或miR171均有顯著上調(diào)，這可能是vsiR_miR164或vsiR_miR171高表達(dá)的結(jié)果。

（2）構(gòu)建基于BSMV 的miRNA 沉默載體

通過(guò)WMD3 平臺(tái)，設(shè)計(jì)靶向內(nèi)源miR164 和miR171 區(qū)域的amiRNAs 序列，即vamiR_miR164 和vamiR_miR171，再利用水稻OsaMIR528 前體作為骨架攜帶它們，通過(guò)BSMV 在I10 中表達(dá)（以下用BSMV：vamiR_miR164和BSMV：vamiR_miR171表示）。

半定量RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，BSMV：vamiR_miR164 或BSMV：vamiR_miR171 侵染的植株中，miR164 或miR171 的相對(duì)表達(dá)量顯著低于BSMV：EV 處理的植株，并且BSMV：vamiR_miR164 或BSMV：vamiR_miR171 侵染的植株中檢測(cè)到了vamiR_miR164 或vamiR_miR171 的高表達(dá)，而對(duì)照BSMV：EV 處理的植株未檢測(cè)到了vamiR_miR164 或vamiR_miR171 的表達(dá)。

結(jié)果說(shuō)明，基于BSMV 的miRNA 前體或vamiRNA 的表達(dá)系統(tǒng)可在大麥中表達(dá)與miRNA 序列相同的sRNA（即vsiRNA）或沉默內(nèi)源miRNA，這為研究麥類(lèi)作物內(nèi)源miRNA 的功能提供了一種研究手段。

（3）基于BSMV 的miRNA 表達(dá)或沉默在小麥和短柄草中的驗(yàn)證

試驗(yàn)進(jìn)一步證明，BSMV 病毒載體也可以在普通小麥和模式植物短柄草中實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源miRNA 的沉默或表達(dá)與miRNA序列相同的sRNA。QRT-PCR結(jié)合End-point Stem-loop技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照BSMV：EV 處理的植株相比，BSMV：vsiR_miR164 和BSMV：vsiR_miR171 處理后，大、小麥和短柄草vsiR_miR164 和vsiR_miR171 表達(dá)量顯著上升；而B(niǎo)SMV：vamiR_miR164 和BSMV：vamiR_miR171 處理后，大、小麥和短柄草內(nèi)源miR164 和miR171 表達(dá)量顯著下降。

半定量PCR 檢測(cè)BSMV 在大麥中高表達(dá)vsiR_miR164和vsiR_miR171。半定量PCR 檢測(cè)BSMV 在大麥中沉默內(nèi)源miR164 和miR171。QRT-PCR 檢測(cè)BSMV 在麥類(lèi)作物和短柄草中vsiR_miR164 或vsiR_miR171 的表達(dá)變化。

5、結(jié)論與討論

研究?jī)?nèi)源miRNA 的功能，首先，要獲得miRNA 序列，這可以通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、高通量測(cè)序或直接克隆得到。其次，要研究miRNA 的功能，過(guò)表達(dá)和沉默是研究?jī)?nèi)源miRNA 功能的重要技術(shù)手段，可以借助于miRNA 高表達(dá)載體在植物中瞬時(shí)或穩(wěn)定的高表達(dá)內(nèi)源miRNA，也可以通過(guò)amiRNA 技術(shù)和miRNA target mimic 技術(shù)沉默內(nèi)源miRNA。此外，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)內(nèi)源miRNA 的靶標(biāo)基因，對(duì)其靶標(biāo)基因的功能分析也可以間接證明內(nèi)源miRNA 的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，在麥類(lèi)作物和短柄草植物中，BSMV 病毒載體可通過(guò)表達(dá)內(nèi)源miRNAs 的前體以過(guò)表達(dá)與miRNA 序列相同的sRNAs（即vsiRNAs）或表達(dá)適當(dāng)?shù)膙amiRNAs 以沉默相應(yīng)的內(nèi)源miRNAs?；蛟S，BSMV 病毒載體還可以結(jié)合STTM 技術(shù)，或?qū)?shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源miRNAs 的沉默?？傮w來(lái)看，這使得鑒定麥類(lèi)作物和模式植物短柄草內(nèi)源miRNAs 的靶標(biāo)基因成為可能。