四環(huán)素類抗生素耐藥研究進(jìn)展：質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機制

葉卓幸，湯燕君，何璐茜,2，白紅,2，高方舟,2，張敏,2，劉有勝,2，熊倩,2，趙建亮,2，何良英,2,*，應(yīng)光國,2

1．華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣州 510006 2．廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點實驗室&環(huán)境理論化學(xué)教育部重點實驗室，華南師范大學(xué)，廣州 510006

抗生素耐藥性問題日益嚴(yán)重，對生態(tài)安全與公共健康構(gòu)成重大威脅，預(yù)計到2050年，抗生素耐藥性問題將導(dǎo)致全球每年1 000萬人的死亡，比癌癥導(dǎo)致的全球死亡人數(shù)多180萬[1]。四環(huán)素類抗生素是一類廣譜類抗生素，主要通過阻止菌體蛋白的合成對細(xì)菌產(chǎn)生作用，廣泛應(yīng)用于臨床治療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[2]。據(jù)統(tǒng)計，四環(huán)素類抗生素每年全球的產(chǎn)量為數(shù)千噸[3]，在全球的抗生素生產(chǎn)量和使用量中排名第二[4]。2010—2015年，在全球獸用抗生素的使用中，四環(huán)素類抗生素使用量位列第一，占全球獸用抗生素使用量的48%[5]。近幾十年來，四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素等一代、二代四環(huán)素類藥物是世界上最常用的抗生素[4]。

四環(huán)素類抗生素耐藥機制已被廣泛報道，其耐藥基因分布于約130種革蘭氏陽性菌屬和革蘭氏陰性菌屬并廣泛存在于人類、動物和環(huán)境中[2,6]。四環(huán)素類抗生素的耐藥機制包括外排泵[7-9]、核糖體保護(hù)蛋白[10-13]和酶失活機制[14]。外排泵將四環(huán)素類抗生素泵出胞外從而降低了其胞內(nèi)濃度，核糖體保護(hù)蛋白與四環(huán)素類抗生素競爭在核糖體30S亞基的結(jié)合位點，酶失活則是產(chǎn)生氧化還原酶使四環(huán)素失活。外排泵和核糖體保護(hù)蛋白是臨床中對四環(huán)素類藥物最常見的耐藥類型[15]。自從第一批四環(huán)素類藥物被發(fā)現(xiàn)以來，核心結(jié)構(gòu)的不斷優(yōu)化使四環(huán)素類藥物在臨床應(yīng)用和開發(fā)中能夠克服許多耐藥性機制[15]。然而，新的四環(huán)素類抗生素耐藥基因正不斷增加，在全世界范圍內(nèi)快速傳播，嚴(yán)重影響了抗菌藥物治療的有效性。

替加環(huán)素是首個甘氨酰環(huán)素類半合成抗生素[16]，其屬于第三代新型四環(huán)素類藥物，具有超廣譜的抗菌活性，用于治療由多重耐藥病原菌引起的感染性疾病[17]。世界衛(wèi)生組織（WHO）于2019年將替加環(huán)素列為極其重要的抗菌藥物[18]。然而，有研究人員已經(jīng)從動物和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的高水平替加環(huán)素耐藥基因tet（X）變異體——tet（X3）和tet（X4）[5]。tet（X3）和tet（X4）不僅可以引起細(xì)菌對替加環(huán)素的高水平耐藥，最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）為32～64 μg·mL-1，還可介導(dǎo)2個第四代四環(huán)素類新藥奧馬環(huán)素和依拉環(huán)素的高水平耐藥。值得注意的是，新型tet（X）變異體還存在交叉耐藥性，可介導(dǎo)對傳統(tǒng)的一代、二代四環(huán)素類藥物耐藥。我國不同養(yǎng)殖動物和環(huán)境樣品中均發(fā)現(xiàn)了攜帶不同tet（X）變異體的細(xì)菌[19-22]。2021年，我國學(xué)者從來自世界四大洲（亞洲、歐洲、北美洲和南美洲）的12 829個人類微生物組樣本中鑒定出322個tet（X）變異體陽性樣本[23]。因此，四環(huán)素類抗生素尤其是替加環(huán)素的耐藥機制和流行傳播迫切需要全球關(guān)注。本文綜述了四環(huán)素類抗生素耐藥機制研究進(jìn)展，報道了新的四環(huán)素類抗生素耐藥基因；重點闡述了質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機制，詳述了tet（X）基因及其變異基因的產(chǎn)生與發(fā)展；利用生物信息學(xué)分析了大量公共數(shù)據(jù)庫已有細(xì)菌基因組，解析了替加環(huán)素耐藥基因的細(xì)菌宿主以及tet（X）基因家族在細(xì)菌染色體和質(zhì)粒中的分布特征，為進(jìn)一步監(jiān)測替加環(huán)素耐藥基因的傳播擴散提供科學(xué)參考。

1 四環(huán)素類抗生素作用機制與耐藥機制（Action mechanisms and resistance mechanisms of tetracyclines）

1.1 四環(huán)素類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)特征

四環(huán)素類抗生素發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40年代，目前已經(jīng)發(fā)展到第四代[2]。四環(huán)素類抗生素為廣譜抗生素，其名稱來源于4個芳香環(huán)的結(jié)合，并四苯四環(huán)素核是所有四環(huán)素類抗生素共同的基本結(jié)構(gòu)。金霉素（1948年）、土霉素（1950年）和四環(huán)素（1953年）是四環(huán)素家族的第一代成員（圖1）；第二代以米諾環(huán)素（1961年）和多西環(huán)素（1967年）為代表；替加環(huán)素（1993年）于2005年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床治療，是四環(huán)素類唯一的第三代成員；奧馬環(huán)素（2013年）和依拉環(huán)素（2013年）屬于第四代成員，均于2018年獲得FDA批準(zhǔn)用于臨床治療。目前，替加環(huán)素、奧馬環(huán)素和依拉環(huán)素屬于新型四環(huán)素類抗生素。

替加環(huán)素是一種化學(xué)修飾的米諾環(huán)素，其核心D環(huán)C9處的氫被N, N-二甲基甘氨酰胺取代，從而賦予替加環(huán)素獨特的微生物學(xué)特性和組織穿透性，替加環(huán)素抗菌譜得到擴展，其抑制蛋白質(zhì)合成的能力是米諾環(huán)素的3倍，四環(huán)素的20倍，且不受四環(huán)素類抗生素主要耐藥機制的影響[24]，因此，替加環(huán)素可以治療多重耐藥病原體引起的感染，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylocousaureus, MRSA）、耐青霉素肺炎鏈球菌（penicillin resistantStreptococcuspneumoniae, PRSP）、耐萬古霉素腸球菌（vancomycin resistantEnterococcus, VRE）以及產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases, ESBLs）大腸桿菌和肺炎克雷伯菌[25]。奧馬環(huán)素是氨甲基四環(huán)素類藥物，在D環(huán)的C7處有一個二甲氨基，在D環(huán)C9處有一個氨甲基修飾，C7官能團(tuán)和C9的修飾保障了奧馬環(huán)素對抗外排泵和核糖體保護(hù)蛋白耐藥機制的穩(wěn)定性[26]。依拉環(huán)素是含氟四環(huán)素，結(jié)構(gòu)類似于替加環(huán)素，其對革蘭氏陽性球菌的抗菌能力是替加環(huán)素的2倍～4倍，對革蘭氏陰性桿菌的抗菌能力是替加環(huán)素的2倍～8倍[27]。

圖1 典型四環(huán)素類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of representative tetracyclines

四環(huán)素類抗生素可逆地與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合，阻止了氨酰tRNA與核糖體結(jié)合位點A的結(jié)合，從而抑制細(xì)菌蛋白的翻譯過程（圖1），由于這種結(jié)合的可逆性，四環(huán)素類抗生素在細(xì)菌體內(nèi)濃度較低時會從作用靶點離開。四環(huán)素抗菌作用能力強，而對人類副作用小的原因在于四環(huán)素與真核細(xì)胞核糖體80S亞基的結(jié)合能力相對較弱[28]。

1.2 四環(huán)素類抗生素耐藥機制

細(xì)菌對四環(huán)素類抗生素耐藥的分子機制包括4種：四環(huán)素類特異性外排泵、核糖體保護(hù)、酶失活和多藥外排泵（圖2）。根據(jù)華盛頓大學(xué)更新的一個四環(huán)素類耐藥基因數(shù)據(jù)庫（http://faculty.washington.edu/marilynr/; updated April 20, 2021），四環(huán)素類特異性外排泵基因共有38個，核糖體保護(hù)基因共13個，酶修飾基因共13個，未知分類基因1個，鑲嵌式核糖體保護(hù)基因（mosiac ribosomal protection）共11個，四環(huán)素類耐藥基因在GenBank中的代表序列登錄號以及基因位置如表1所示。

細(xì)菌主動外排泵系統(tǒng)分為五大家族：主要易化超家族（major facilitator super family, MFS）、小多重耐藥家族（small multidrug resistance, SMR）、ATP結(jié)合盒家族（ATP binding cassette, ABC）、耐藥結(jié)節(jié)分化家族（resistance nodulation and cell division, RND）、多藥和毒性化合物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family, MATE）。MFS、SMR和RND類外排泵均以質(zhì)子驅(qū)動力為能量將藥物泵出膜外，ABC類外排泵利用ATP水解釋放的能量將抗生素泵出膜外[29-31]。38個四環(huán)素類特異性外排泵屬于MFS家族，已發(fā)現(xiàn)的可外排四環(huán)素類抗生素的多藥外排泵有RND、MFS和ABC家族[31]。RND家族四環(huán)素類多藥外排泵主要有AdeABC、AdeIJK、AcrAB-TolC、MexAB-OprM和MexVW-OprM等；MFS家族四環(huán)素類多藥外排泵主要有MdfA、NorA、NorB、Rv1410c和Rv2333c等；ABC家族四環(huán)素類多藥外排泵主要有Rv1258C、EfrAB和VcaM等[31-33]。

圖2 四環(huán)素類抗生素耐藥機制注：NADPH表示還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADP+表示煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，MFS表示主要易化超家族，ABC表示ATP結(jié)合盒家族，RND表示耐藥結(jié)節(jié)分化家族。Fig. 2 Mechanisms of tetracycline resistanceNote: NADPH stands for reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP+ stands for nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, MFS stands for major facilitator super family, ABC stands for ATP binding cassette, and RND stands for resistance nodulation and cell division.

表1 四環(huán)素類抗生素耐藥基因類型及其來源Table 1 Types and sources of tetracycline resistance genes

續(xù)表1

續(xù)表1

四環(huán)素類抗生素耐藥性通常是通過水平轉(zhuǎn)移獲得的[34-35]。2015年，F(xiàn)orsberg等[35]從土壤宏基因組中發(fā)現(xiàn)了9個通過酶失活機制導(dǎo)致高水平四環(huán)素抗性的基因，命名為tet（47）～tet（55），其中tet（47）和tet（54）與氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶耐藥基因相鄰。tet（62）、tet（63）和tet（64）為最新發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類抗生素耐藥基因[36-38]。McGivern等[36]在暴露于抗菌劑三氯生的合成廢水中識別出了新的外排泵基因tet（62），將攜帶tet（62）的基因文庫導(dǎo)入大腸桿菌后，抗生素敏感性分析表明細(xì)菌對所測試的四環(huán)素類抗生素耐藥性增加了4倍～50倍。Zhu等[37]在來源于雞樣本的金黃色葡萄球菌多重耐藥質(zhì)粒pSA01（25 664 bp）上發(fā)現(xiàn)一個新的外排泵基因tet（63），該質(zhì)粒同時攜帶了aadD、aacA-aphD和erm（C）等耐藥基因，Tet（63）蛋白與外排泵蛋白Tet（K）的同源性為73%。Somprasong等[38]在來源于土壤樣本的烏邦伯克霍爾德菌（Burkholderiaubonensis）中發(fā)現(xiàn)新的外排泵基因tet（64），對四環(huán)素呈現(xiàn)高水平耐藥性（MIC≥256 μg·mL-1），但不能介導(dǎo)米諾環(huán)素、替加環(huán)素和依拉環(huán)素抗性。

2 替加環(huán)素耐藥機制（Mechanisms of tigecycline resistance）

替加環(huán)素是一種新型甘氨酰環(huán)肽類抗生素，屬于第三代四環(huán)素類抗生素，與核糖體30S亞基的結(jié)合效率是四環(huán)素的5倍[39]。替加環(huán)素不受四環(huán)素類抗生素主要耐藥機制的影響，如四環(huán)素特異性外排泵和核糖體保護(hù)機制；也不受β內(nèi)酰胺酶、靶位修飾、大環(huán)內(nèi)酯類外排泵或酶靶位改變（如旋轉(zhuǎn)酶/拓?fù)洚悩?gòu)酶）等耐藥機制的影響。這些特性使得替加環(huán)素具有超廣譜抗菌活性，是治療產(chǎn)碳青霉烯酶多重耐藥腸桿菌感染的“最后一道防線”[17]。目前，替加環(huán)素已被批準(zhǔn)作為一種單藥治療復(fù)雜感染[40]。Hoban等[41]于2004年開展了替加環(huán)素評估和監(jiān)測試驗，評估了替加環(huán)素和常用抗生素對來自11個國家40個研究中心的6 792個臨床分離株的抗菌活性，其藥敏實驗結(jié)果表明，替加環(huán)素對糞腸球菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和肺炎鏈球菌的MIC90分別為0.12、0.12、0.25和0.25 μg·mL-1，對腸桿菌科細(xì)菌MIC90為1 μg·mL-1。因此，替加環(huán)素的重要性體現(xiàn)在它對大多數(shù)多重耐藥菌具有抗菌活性，被世界衛(wèi)生組織列為極其重要的抗菌藥物[5]。

隨著替加環(huán)素使用量的增加，現(xiàn)有研究表明替加環(huán)素耐藥性已經(jīng)出現(xiàn)，臨床上最常見于鮑曼不動桿菌和腸桿菌科，尤其是多藥耐藥菌株，替加環(huán)素耐藥機制的產(chǎn)生與發(fā)展已得到廣泛關(guān)注[5,42-44]。目前發(fā)現(xiàn)的替加環(huán)素耐藥機制有：核糖體蛋白結(jié)合位點突變、細(xì)胞膜變異、主動外排泵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和修飾酶降解等。其中核糖體蛋白結(jié)合位點突變和細(xì)胞膜變異的替加環(huán)素耐藥機制報道數(shù)量較少：在肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中，核糖體S10蛋白的編碼基因rpsJ突變可介導(dǎo)替加環(huán)素耐藥[45-47]；plsC基因突變和abrp基因缺失導(dǎo)致鮑曼不動桿菌細(xì)胞膜通透性改變，從而介導(dǎo)替加環(huán)素耐藥[48-49]；2021年，我國學(xué)者在豬鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了對替加環(huán)素具有抗性的核糖體保護(hù)蛋白Tet（M）的突變體，其編碼基因tet（M）位于基因島上[50]。鑒于替加環(huán)素在臨床治療中的重要性，有關(guān)其耐藥機制的報道正不斷增加，本文將詳述替加環(huán)素2種主要耐藥機制外排泵和修飾酶的形成與發(fā)展（圖3）。

2.1 替加環(huán)素外排泵

與替加環(huán)素耐藥相關(guān)的外排泵主要有RND家族、MFS家族中的Tet（A）和Tet（L）外排泵突變體（圖3）。

2.1.1 RND家族外排泵

RND家族外排泵常見于革蘭氏陰性菌，如銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌和摩氏摩根菌[43]。RND外排泵主要利用質(zhì)子梯度來驅(qū)動外排，1個H+交換1個藥物分子。與替加環(huán)素耐藥相關(guān)的RND型外排泵包括：AcrAB-TolC[51]、SdeXY-HasF[52]、OqxAB[43,53]、TMEXcd1-TOprJ[54]和AdeABC/AdeIJK/AdeFGH[55]。

在大腸桿菌中，RND家族外排泵AcrAB-TolC由三聯(lián)組合蛋白組成，包括膜連接蛋白（AcrA）、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白（AcrB）和外膜通道蛋白（TolC）（圖3）。AcrB捕獲和轉(zhuǎn)運底物，在AcrA的協(xié)助下，激活外排泵通道，將底物泵出細(xì)菌胞外。該外排泵的調(diào)控主要有局部調(diào)控（AcrR）和全局調(diào)控（MarA、SoxS、Rob和RamA）（圖3）。acrA和acrB基因由同一個操縱子轉(zhuǎn)錄而來，AcrR是一種負(fù)調(diào)控因子，調(diào)控acrAB的表達(dá)[51]。在腸桿菌科細(xì)菌中，AcrAB外排泵是替加環(huán)素的主要耐藥機制，其局部和全局調(diào)控因子則因物種而異[42]。在大腸桿菌中，當(dāng)替加環(huán)素進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，局部調(diào)控蛋白AcrR與之結(jié)合引發(fā)構(gòu)象改變，從而激活外排蛋白AcrAB的過表達(dá)，導(dǎo)致大腸桿菌對替加環(huán)素的敏感性降低[56]。在AcrAB-TolC外排泵全局調(diào)控因子中，現(xiàn)有研究表明ramA表達(dá)增強促成了陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和克雷伯氏菌的替加環(huán)素耐藥性[53,57]。

圖3 替加環(huán)素主要耐藥機制Fig. 3 Main mechanisms of tigecycline resistance

OqxAB外排泵是RND家族中第一個由質(zhì)粒介導(dǎo)的外排泵，由膜融合蛋白OqxA和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白OqxB組成。Veleba等[58]對肺炎克雷伯菌的研究結(jié)果表明，rarA的過表引起OqxAB和AcrAB表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致包括替加環(huán)素在內(nèi)的多耐藥表型。此外，該項研究還發(fā)現(xiàn)OqxAB外排泵受到OqxR的負(fù)調(diào)控。Veleba等[53]在另一項研究中發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌對替加環(huán)素耐藥的主要介導(dǎo)因素為RamR調(diào)控引起的RamA表達(dá)增加。隨后，Jiménez-Castellanos等[59]對肺炎克雷伯菌的研究證實了OqxAB同時受RamA和RarA的調(diào)控。綜上所述，OqxAB同時受到RarA、RamA以及OqxR的調(diào)控，其中RarA和RamA調(diào)控蛋白介導(dǎo)細(xì)菌對替加環(huán)素的耐藥性。

SdeXY-HasF外排泵系統(tǒng)由膜融合蛋白（SdeX）、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白（SdeY）和外膜蛋白（HasF）組成。SdeXY是在機會致病菌——粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中發(fā)現(xiàn)的第一個RND型外排泵，是一種能量依賴的藥物外排泵，具有廣泛的藥物底物，在粘質(zhì)沙雷氏菌多重耐藥過程中發(fā)揮了重要作用[60]。HasF是粘質(zhì)沙雷菌的TolC同系物，參與能量依賴的流出[61]。SdeXY-HasF外排泵系統(tǒng)的上調(diào)與粘質(zhì)沙雷氏菌對替加環(huán)素的耐藥性有關(guān)，進(jìn)一步的研究需要闡明SdeXY過表達(dá)的機制[52]。

TMexCD1-TOprJ1是最近在動物源克雷伯氏菌中發(fā)現(xiàn)的由IncFIA質(zhì)粒編碼的RND型外排泵[54]。TMexCD1-TOprJ1與銅綠假單胞菌染色體編碼的MexCD-OprJ外排泵氨基酸同源性為64.5%～77.8%，在大腸桿菌中表達(dá)TMexCD1-TOprJ1導(dǎo)致替加環(huán)素外排增加。tmexcd1-toprj1基因在動物源腸桿菌和假單胞菌中較為常見[62]，然而近2年在人醫(yī)臨床分離的細(xì)菌中陸續(xù)有報道該基因的檢出[63-64]，TMexCD1-TOprJ1的腸桿菌已擴散到食品市場的環(huán)境污水[65]。目前，已鑒定出其他2種類似的外排泵，其中TMexCD2-TOprJ2位于解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultellaornithinolytica）的質(zhì)粒和染色體[66]，TMexCD3-TOprJ3發(fā)現(xiàn)于動物源變形桿菌染色體（Proteusmirabilis）[67]。這一類型外排泵基因主要分布在克雷伯氏菌的雜合質(zhì)粒中，如IncHI1B-FIB質(zhì)粒、IncC-IncX3質(zhì)粒[62,65,68]。

AdeABC、AdeIJK和AdeFGH這3種RND家族外排泵被認(rèn)為與鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥有關(guān)[55,69-70]，其中，AdeABC外排泵系統(tǒng)在臨床分離的產(chǎn)碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌中最為常見[71]。該外排泵系統(tǒng)由膜連接蛋白AdeA、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白AdeB和外膜通道蛋白AdeC組成，其轉(zhuǎn)錄水平受到AdeRS雙組分系統(tǒng)的調(diào)控。

2.1.2 MFS家族外排泵

Tet（A）外排泵，是臨床上發(fā)現(xiàn)的最常見的四環(huán)素MFS型外排泵[72]，主要存在于革蘭氏陰性菌中。Tet（A）蛋白具有12個跨膜α-螺旋片段，其表達(dá)受到TetR蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，TetR蛋白屬于阻遏蛋白，四環(huán)素通過結(jié)合TetR阻遏蛋白將其從操縱子O1、O2上解離下來，進(jìn)而促進(jìn)tet（A）的表達(dá)[73]。雖然替加環(huán)素克服了四環(huán)素特異性外排泵Tet（A）的耐藥機制，但tet（A）突變體能介導(dǎo)細(xì)菌對替加環(huán)素高水平耐藥[52]。Hentschke等[74]對一株呈現(xiàn)替加環(huán)素高水平耐藥（MIC=16 μg·mL-1）的沙門菌進(jìn)行研究，分子機制分析表明tet（A）突變和ramR失活介導(dǎo)沙門菌對替加環(huán)素的高水平耐藥，且tet（A）突變體位于質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)座子Tn1721中。質(zhì)粒攜帶的tet（A）基因在臨床上產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌中廣泛存在，tet（A）的突變是導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥性的主要原因[75-76]。

Tet（L）是MFS家族外排泵中一種具有14個跨膜片段的四環(huán)素外排泵蛋白[77-78]，主要存在于革蘭氏陽性菌中。Tet（L）蛋白與Tet（K）類似，都能催化四環(huán)素-二價金屬離子Me2+復(fù)合物與H+逆向轉(zhuǎn)運而介導(dǎo)四環(huán)素類抗生素耐藥（圖3）[79]。tet（L）基因于1992年首次在葡萄球菌的質(zhì)粒pSTE1中報道[80]，常在革蘭氏陽性菌（如芽孢桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌）的質(zhì)粒中被發(fā)現(xiàn)，通常位于大小、結(jié)構(gòu)不同的質(zhì)粒上，并與四環(huán)素類耐藥基因tet（T）和tet（K）、氨基糖苷類耐藥基因aadD共存[81-82]。在革蘭氏陰性菌（如巴氏桿菌和曼海姆氏菌）的質(zhì)粒中偶爾也有報道[83]。Tet（L）外排泵可以輸出四環(huán)素和強力霉素，但不能外排替加環(huán)素。然而，已有研究表明，Tet（L）外排泵過表達(dá)可導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥，如在腸球菌中，Tet（L）外排泵和Tet（M）核糖體保護(hù)蛋白的過表達(dá)介導(dǎo)了替加環(huán)素的耐藥[84]。此外，Tet（L）外排泵突變也能介導(dǎo)替加環(huán)素耐藥，我國報道了新型Tet（L）外排泵變異體——tet（L）F58L和tet（L）A117V，可介導(dǎo)葡萄球菌、彎曲桿菌對替加環(huán)素和依拉環(huán)素的耐藥性[85-86]。

2.2 替加環(huán)素耐藥基因tet（X）及其變異體的產(chǎn)生與流行

替加環(huán)素修飾酶是由tet（X）及其變異基因編碼的黃素依賴性單加氧酶。Tet（X）由388個氨基酸組成，在黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、氧氣（O2）和鎂離子（Mg2+）存在的條件下具有催化活性，可催化降解傳統(tǒng)以及新型四環(huán)素類抗生素，pH為8.5時該酶的活性最高[14]。到目前為止，質(zhì)粒攜帶的可轉(zhuǎn)移tet（X）及其變異體有tet（X）、tet（X3）、tet（X4）、tet（X5）、tet（X6）和tet（X7），可介導(dǎo)對替加環(huán)素的高水平耐藥，其編碼的Tet（X）修飾酶可羥化替加環(huán)素的C11a，生成11a-羥基替加環(huán)素（圖3）。tet（X）基因家族在不同來源細(xì)菌或環(huán)境中的流行情況如表2所示。

2.2.1tet（X）

總之，通過“中國尋根之旅”的活動，組織來華青少年參加華語培訓(xùn)，提高其漢語知識能力和漢語應(yīng)用水平，通過一批批的營員返回駐在國后帶動當(dāng)?shù)貪h語學(xué)習(xí)熱潮。更進(jìn)一步培養(yǎng)一批初級漢語教師，通過培訓(xùn)提高他們的教學(xué)水平，回國后在華語教學(xué)界發(fā)揮帶動作用，從而在較大范圍內(nèi)提高華文教學(xué)質(zhì)量，推動華文教育加速發(fā)展。

tet（X）是第一個能直接滅活四環(huán)素的抗性基因。1982年，Tally等[87]在擬桿菌質(zhì)粒pBFTM10上發(fā)現(xiàn)新的四環(huán)素耐藥基因。1984年，Guiney等[88]發(fā)現(xiàn)位于質(zhì)粒pBF4的類似的耐藥基因，研究人員將該基因克隆到大腸桿菌載體中，藥敏試驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)化菌株在好氧條件下表達(dá)四環(huán)素耐藥性，而在擬桿菌屬（嚴(yán)格的厭氧菌）中不表達(dá)四環(huán)素耐藥性。1986年，Matthews和Guiney[89]的研究表明新的四環(huán)素耐藥基因位于質(zhì)粒pBFTM10上的轉(zhuǎn)座子Tn4400和質(zhì)粒pBF4上的轉(zhuǎn)座子Tn4351。1989年，Speer和Salyers[90]證明了這種四環(huán)素抗性基因產(chǎn)物對四環(huán)素進(jìn)行了化學(xué)修飾，該基因是第一個通過化學(xué)修飾四環(huán)素的耐藥機制的例子。1990年，Speer和Salyers[91]認(rèn)為該四環(huán)素基因不與已知的四環(huán)素耐藥基因雜交，屬于單獨的一類耐藥基因，并將該基因命名為tet（X）。

2.2.2tet（X1）、tet（X2）

2001年，Whittle等[92]首次在擬桿菌屬結(jié)合轉(zhuǎn)座子CTnDOT上發(fā)現(xiàn)了tet（X1）基因和tet（X2）基因，tet（X2）編碼的蛋白與tet（X）編碼的蛋白有99%的氨基酸同源性，然而tet（X1）編碼的蛋白與tet（X）編碼的蛋白僅有66%的氨基酸同源性。從tet（X）及其變體的首次發(fā)現(xiàn)至今，tet（X）/tet（X2）基因已在全球范圍內(nèi)廣泛傳播。2020年，F(xiàn)ang等[2]的流行病學(xué)回溯性研究表明，tet（X）/tet（X2）基因傳播范圍已超過16個國家/地區(qū)，覆蓋七大洲中的五大洲，并廣泛存在于各種生態(tài)系統(tǒng)中，包括人體腸道、土壤、沉積物、醫(yī)院廢水、污水廠污水、河水、牲畜糞便和環(huán)境氣溶膠。

2.2.3tet（X3）、tet（X3.2）、tet（X4）

He等[5]于2019年首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的高水平替加環(huán)素耐藥基因tet（X3）和tet（X4），分別位于p34AB質(zhì)粒和p47EC質(zhì)粒上。Tet（X3）和Tet（X4）滅活所有的四環(huán)素家族，包括替加環(huán)素和FDA新批準(zhǔn)的依拉環(huán)素和奧馬環(huán)素。2019年，tet（X3.2）首次從來源于蝦樣本的短穩(wěn)桿菌（Empedobacterbrevis）中鑒定出，且位于質(zhì)粒pSE1-3-9kb上，tet（X3.2）與tet（X3）和tet（X4）耐藥表型類似[93]。He等[5]的流行病學(xué)研究顯示，tet（X3）/tet（X4）在山東屠宰場的豬盲腸樣本中檢出率最高（40/60, 66.7%），替加環(huán)素耐藥菌分離株主要為腸桿菌科（51/77）和不動桿菌屬（16/77）。Dong等[94]分離得到289株tet（X）變異體陽性分離株，其中大部分不動桿菌分離株（83/289）攜帶tet（X3），所有大腸桿菌分離株（84/289）均攜帶tet（X4）。Sun等[20]從4 189份樣本中鑒定出42株tet（X4）陽性的大腸桿菌分離株，其中有24株（24/42, 57.1%）大腸桿菌攜帶的tet（X4）位于質(zhì)粒pLHM10-1-p6上，樣本來源主要為豬糞便（30/4189, 0.7%），在污水、蔬菜和人身上均未檢出。Li等[95]采用全基因組測序（WGS）和單質(zhì)粒分子分析方法，研究了tet（X4）載體質(zhì)粒的多樣性，攜帶tet（X4）的質(zhì)粒大小范圍為9～294 kb，質(zhì)粒種類有ColE2-like、IncQ、IncX1、IncA/C2、IncFII、IncFIB和具有不同復(fù)制子的雜交質(zhì)粒。2020年，F(xiàn)ang等[2]的流行性病學(xué)回溯性研究表明，tet（X3）和tet（X4）已廣泛分布于不動桿菌屬和腸桿菌科，樣本來源于動物、人、食物和環(huán)境中。

表2 tet（X）基因在不同來源細(xì)菌或環(huán)境中的流行情況Table 2 Distribution of tet（X） genes in bacteria or environments from different sources

2.2.4tet（X5）～tet（X14）

tet（X5）首次發(fā)現(xiàn)于一株來源于臨床傷口樣本的鮑曼不動桿菌，tet（X5）位于質(zhì)粒pAB17H194上，其耐藥水平略低于tet（X3）和tet（X4）[96]。He等[97]從豬肉樣本中分離出1株攜帶tet（X6）的奇異變形桿菌，tet（X6）位于染色體ICEPgs6Chn1，該染色體上還存在其他耐藥基因floR、strB、strA、aph（30）-Ia、aac（3）-IV、aph（4）-Ia和sul2。Gasparrini等[98]從一株臨床銅綠假單胞菌分離株中鑒定出tet（X7），該菌株來源于囊性纖維化患者氣管吸出物。在同一項研究中，7個tet（X）變體tet（X7）～tet（X13）通過功能宏基因組學(xué)的方法檢測出，樣本來源于環(huán)境、人類共生菌和致病菌，這些基因介導(dǎo)包括FDA最近批準(zhǔn)的奧馬環(huán)素和依拉環(huán)素在內(nèi)的所有四環(huán)素類抗生素的耐藥性。2021年，Soliman等[99]從埃及雞糞便樣本中分離出5株攜帶tet（X7）的大腸桿菌菌株，該基因位于質(zhì)粒pMS8345A上，藥敏結(jié)果表明5株分離株對替加環(huán)素的MIC值為8～16 μg·mL-1。Cheng等[100]發(fā)現(xiàn)tet（X）家族新變體tet（X14），該基因位于穩(wěn)桿菌的染色體上，菌株來源于中國養(yǎng)殖場的豬糞便樣本，該項研究表明黃桿菌科可能是tet（X14）的主要宿主。

2020年，Liu等[101]在肉雞和豬樣本中發(fā)現(xiàn)了tet（X6）的4個亞型，亞型一來源于褐色類香味菌（Myroidesphaeus），亞型二來源于卡氏變形桿菌（Proteuscibarius），亞型三來源于奇異變形桿菌（Proteusmirabilis），亞型四來源于魯氏不動桿菌（Acinetobacterlwoffii）和約氏不動桿菌（Acinetobacterjohnsonii），亞型二、三、四與亞型一的蛋白質(zhì)序列差異分別為16、4和11個氨基酸。2021年，Xu等[102]將亞型二、三、四重新命名為tet（X15）～tet（X17）。

2.2.6tet（X18）～tet（X44）

2021年，Umar等[103]從GenBank中收集的57個鴨疫里氏桿菌非冗余基因組序列中發(fā)現(xiàn)了26個新變異體tet（X18）～tet（X44），廣泛擴展了現(xiàn)有tet（X）家族，研究結(jié)果表明鴨疫里氏桿菌是tet（X）基因家族的天然存儲庫。此外，該項研究還在鴨疫里氏桿菌的染色體中發(fā)現(xiàn)了Tet（X2）與Tet（X4）的進(jìn)化前體Tet（X2/4）-P，對替加環(huán)素呈現(xiàn)中水平耐藥（MIC=8 μg·mL-1）。鴨疫里氏桿菌是tet（X）基因家族傳播到臨床病原體的跳板[104]。

2.2.7tet（X45）～tet（X47）

2021年，Zhang等[23]從12 829份人體微生物宏基因組樣本中重建了202 265個宏基因組組裝基因組（metagenome-assembled genomes, MAGs），并鑒定出3個新tet（X）基因，tet（X45）、tet（X46）和tet（X47）編碼的蛋白與tet（X2）編碼的蛋白分別有91%、97%和98%的氨基酸同源性，tet（X45）、tet（X46）和tet（X47）均對替加環(huán)素耐藥（8～16 μg·mL-1），并對奧馬環(huán)素（16～32 μg·mL-1）和依拉環(huán)素（2～4 μg·mL-1）高水平耐藥。

綜上所述，替加環(huán)素耐藥機制已經(jīng)得到國內(nèi)外研究人員的持續(xù)關(guān)注[2, 104-106]，目前已探明質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機制有：RND型外排泵OqxAB和TMEXcd1-TOprJ1，MFS外排泵Tet（A）突變體和Tet（L）突變體，以及Tet（X）修飾酶及其變異體Tet（X3）、Tet（X4）、Tet（X5）、Tet（X6）和Tet（X7）。質(zhì)粒介導(dǎo)的高水平替加環(huán)素耐藥基因tet（X3）和tet（X4）被首次發(fā)現(xiàn)后，tet（X）變異體正以飛快的速度變化發(fā)展，目前已發(fā)展至tet（X47）。

2.3 tet（X）基因家族分布特征

為了解析tet（X）基因家族的細(xì)菌宿主以及質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥基因的分布情況，基于Zhang等[23]對tet（X）及其變異體的全球溯源分析，本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了852個攜帶替加環(huán)素耐藥基因的細(xì)菌基因組加以分析。使用基因組分類數(shù)據(jù)庫（Genome Taxonomy Database, GTDB）進(jìn)行物種分類[107]，使用耐藥基因數(shù)據(jù)庫（Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD）注釋細(xì)菌基因組上的耐藥基因[108]。結(jié)果表明，tet（X）基因家族宿主主要為擬桿菌門（Bacteroidota）、彎曲桿菌門（Campylobacterota）、厚壁菌門（Firmicutes_A）和變形菌門（Proteobacteria）。在細(xì)菌科水平上分屬于以下20種細(xì)菌：Acutalibacteraceae、Aeromonadaceae、Arcobacteraceae、Bacteroidaceae、Campylobacteraceae、Chitinophagaceae、Enterobacteriaceae、Flavobacteriaceae、Lachnospiraceae、Marinifilaceae、Moraxellaceae、Muribaculaceae、Paludibacteraceae、Pseudomonadaceae、Rikenellaceae、Saprospiraceae、Shewanellaceae、Sphingobacteriaceae、Tannerellaceae和Weeksellaceae。其中，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、莫拉氏菌科不動桿菌屬（Moraxellaceae，Acinetobacter）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、威克氏菌科（Weeksellaceae）多種細(xì)菌攜帶替加環(huán)素耐藥基因（圖4（a））。在細(xì)菌基因組水平上，852株細(xì)菌的染色體和質(zhì)粒上攜帶tet（X）、tet（X1）、tet（X3）、tet（X4）、tet（X5）和tet（X6），同時共存多種四環(huán)素類抗生素耐藥基因：tet（33）、tet（39）、tet（40）、tet（43）、tet（45）、tet（49）、tet（52）、tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（J）、tet（V）、tet（W/N/W）、tet（X1）、tet（X3）、tet（X4）、tet（X5）、tet（X6）、tet（Y）、tet32、tet36、tetA（P）、tetB（60）和tetB（P）（圖4（b））。此外，852個細(xì)菌基因組中共有74個質(zhì)粒攜帶四環(huán)素耐藥基因，這些質(zhì)粒來自不動桿菌屬10種不同細(xì)菌，如腸桿菌科大腸桿菌、費格森埃希菌、變形桿菌，擬桿菌細(xì)菌等，質(zhì)粒上總共發(fā)現(xiàn)13種四環(huán)素耐藥基因：tet（A）、tet（B）、tet（D）、tet（X3）、tet（X4）、tet（X5）、tet（X6）、tet（Y）、tet36、tetB（60）、tetM、tetR和tet（X）（圖4（b））。值得注意的是，這些菌株同時攜帶不同類型的臨床重要抗生素耐藥基因，如超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因（blaCMY、blaCTX-M、blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaSHV和blaTEM）、質(zhì)粒介導(dǎo)的粘菌素耐藥基因（mcr-1.1、mcr-3.5、mcr-1.4、mcr-3.2、mcr-3.1和mcr-9.1）。

圖4 tet（X）宿主細(xì)菌物種分類及其攜帶的耐藥基因注：（a） tet（X）宿主細(xì)菌物種分類；（b） tet（X）在細(xì)菌染色體和質(zhì)粒中的分布特征。Fig. 4 Phylogenetic analyses of the tet（X） carrying isolatesNote: （a） Genome taxonomy of tet（X） carrying isolates; （b） Prevalence of tet（X） in bacterial genome and plasmids.

在852個攜帶替加環(huán)素耐藥基因的細(xì)菌中，一株攜帶tet（X）基因的超級耐藥致病菌值得關(guān)注。Hu等[109]從病人尿液樣本中分離出一株多耐藥香味類香味菌（Myroidesodoratimimus）PR63039，抗生素敏感性試驗結(jié)果顯示PR63039對所測試的21種抗生素均耐藥?；蚪M分析顯示其基因組含有大量的耐藥基因，包括β-內(nèi)酰胺酶、四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮、多耐藥質(zhì)子泵基因、耐藥突變基因rpoB和gyrA，并且染色體和質(zhì)粒上均攜帶有tet（X）基因。從病人身上分離出來的攜帶tet（X）基因的超級耐藥菌的出現(xiàn)，對抗生素療效構(gòu)成極大的威脅，應(yīng)警惕此類攜帶tet（X）及其變異體的超級耐藥致病菌介導(dǎo)的替加環(huán)素高水平耐藥性。

3 研究展望（Research prospect）

細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)對生態(tài)安全與公共健康構(gòu)成重大威脅，世界各國正積極采取行動，從動物-環(huán)境-人類的視角，以“大健康（One Health）”理念開展遏制細(xì)菌耐藥工作。細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)已證明替加環(huán)素耐藥基因的細(xì)菌宿主同時攜帶不同類型的臨床重要抗生素耐藥基因，表明其耐藥機制趨于復(fù)雜。因此，研究替加環(huán)素的耐藥機制和傳播機制，對臨床治療多重耐藥菌的感染和遏制細(xì)菌耐藥性具有重要意義。對于今后的研究重點，我們認(rèn)為需要主要關(guān)注幾個方面的工作。

（1）超級耐藥菌的出現(xiàn)是多種抗生素選擇壓力下共同作用的結(jié)果。雖然目前替加環(huán)素未被批準(zhǔn)用于養(yǎng)殖行業(yè)，但替加環(huán)素耐藥可導(dǎo)致第四代新型四環(huán)素類藥物的交叉耐藥，同時影響一代、二代四環(huán)素類抗生素的應(yīng)用，仍應(yīng)持續(xù)關(guān)注養(yǎng)殖業(yè)中新型替加環(huán)素耐藥機制的產(chǎn)生與發(fā)展。

（2）替加環(huán)素高水平耐藥基因的宿主屬于不同細(xì)菌物種，并且分布于臨床環(huán)境和非臨床環(huán)境，可能會在“動物-環(huán)境-人類”鏈條中傳播，當(dāng)前耐藥細(xì)菌的傳播機制研究主要集中于臨床環(huán)境，應(yīng)加強非臨床環(huán)境（如養(yǎng)殖環(huán)境和城市環(huán)境）中的研究。

（3）2020年后tet（X）基因家族的不斷壯大歸因于宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，tet（X）變異體成員的迅速增加說明了其大規(guī)模傳播的可能性，因此，有必要進(jìn)一步通過宏基因組學(xué)監(jiān)測新發(fā)現(xiàn)的tet（X）變異體的快速傳播，并探究其他未知的四環(huán)素修飾酶基因，重點監(jiān)測新的四環(huán)素特異性外排泵突變體介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥性。