基于rbcL序列對(duì)貓人參及其近緣種的分子鑒定研究

張曉芹，毛佳樂，王慧玉，雷后興，藍(lán) 艷

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬麗水中醫(yī)院，浙江 麗水 323000）

貓人參為獼猴桃科植物對(duì)萼獼猴桃（鑷合獼猴桃）（Actinidia valvataDunn.）或大籽獼猴桃（Actinidia macrospermaC.F.Liang）的干燥根及粗莖，收載于2015年版《浙江省中藥炮制規(guī)范》，具有解毒消腫、祛風(fēng)濕的功效，臨床常用于深部膿腫、骨髓炎、風(fēng)濕痹痛、瘡瘍腫毒等疾?。?］。藥理研究表明，貓人參對(duì)胃癌［2-3］、肝癌［4］、肺癌［5］等具有較好療效，臨床應(yīng)用廣泛。

近年來，隨著野生貓人參的不斷消耗，貓人參資源日益短缺，市場(chǎng)上貓人參混偽品開始出現(xiàn)，以其近緣種較為多見。調(diào)研發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上常用作貓人參使用的還有黑蕊獼猴桃（Actinidia melanandraFranch.）及中華獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）。對(duì)萼獼猴桃、大籽獼猴桃、黑蕊獼猴桃為獼猴桃屬凈果組植物，中華獼猴桃為獼猴桃屬星毛組植物，雖然其親緣關(guān)系較近，然而在藥理活性上具有較大差異。體外抗腫瘤活性研究表明，對(duì)萼獼猴桃和大籽獼猴桃對(duì)于胃癌和肺癌具有較好的抑制作用，而黑蕊獼猴桃和中華獼猴桃抑制效果較差［6-8］。因此在臨床應(yīng)用中，應(yīng)將貓人參與其混偽品進(jìn)行區(qū)分。

有學(xué)者基于性狀鑒定對(duì)貓人參及其近緣種進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為草酸鈣結(jié)晶（皮部有亮星）、紫色斑（貓爪?。┘案鶕?jù)貓是否愛吃等特點(diǎn)可對(duì)貓人參進(jìn)行物種鑒定［9］，然而該方法依靠經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)，且同屬其他物種植物也多有此類特征；另有學(xué)者采用熒光、紫外、紅外、指紋圖譜等方法對(duì)貓人參及其近緣種進(jìn)行鑒定［8，10］，但前處理復(fù)雜，需要根據(jù)貓人參不 同極性提取物分類鑒定，鑒定結(jié)果依靠檢索表確認(rèn)，耗時(shí)較長(zhǎng)；基于脫氧核糖核酸（DNA）條形碼的獼猴桃屬系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明，獼猴桃屬植物可根據(jù)其基因序列進(jìn)行初步區(qū)分，然而前期主要對(duì)其屬內(nèi)不同亞組的劃分規(guī)律進(jìn)行了研究［11］，尚缺乏對(duì)貓人參的物種鑒定分析。

葉綠體核酮糖-1，5-二磷酸酯羧化酶基因（rbcL）序列具有易擴(kuò)增、保守性強(qiáng)、單性遺傳、進(jìn)化路線獨(dú)立等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥用植物的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，對(duì)于種間植物具有較好的鑒定優(yōu)勢(shì)［12-13］。綜上，本研究基于rbcL序列對(duì)貓人參及其近緣種進(jìn)行鑒定研究，以期為貓人參的用藥安全及質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司），2-16R離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司），BIO-RAD T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）儀（美國(guó)伯樂公司），JY-SP型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），NanoDropOne微量核酸定量?jī)x（美國(guó)Thermo公司），GenoSens1850凝膠成像分析系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），IMS-50全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（常熟市雪科電器有限公司）。

1.2 試劑

Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒、Taq酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物（Marker）（100～2000 bp）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（5 mmol/L）、5×PCR Buffer、氯化鎂（MgCl2）（25 mmol/L）、瓊脂糖均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用試劑均為分析純。

1.3 材料

同科水東哥屬植物水東哥（Saurauia tristylaDC.）的基因序列下載自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，另外9種獼猴桃屬植物為野外采集獲得的樣品，共計(jì)110份，分別來源于浙江麗水市、福建省南平市共計(jì)11個(gè)采樣地點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)采集葉片10份用于基因序列測(cè)定；其余35條用于分析的基因序列下載自NCBI數(shù)據(jù)庫（Genbank）。野外采集樣品經(jīng)麗水市中醫(yī)院主任中藥師林娜鑒定為相應(yīng)獼猴桃屬植物。見表1。

2 方法

2.1 DNA提取

取各樣品的新鮮葉片約20 mg，經(jīng)液氮研磨粉碎后，根據(jù)Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒使用說明提取DNA，微量核酸定量?jī)x檢測(cè)所得DNA質(zhì)量。

2.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增引物序列為r-F：5′-ATGTCACCACAA ACAGAGACTAAAGC-3′，r-R：5′-GTAAAATCAAGTC CACCRCG-3′。采用50 μL反應(yīng)體系：5×PCR Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，MgCl24 μL，引物各2 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)35；72℃延伸10 min。

2.3 測(cè)序分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.00%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀檢驗(yàn)。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。每個(gè)樣品均采用正反雙向測(cè)序。

2.4 序列比對(duì)及ML系統(tǒng)聚類樹的建立

DNA序列采用ContingExpress及DNAman軟件進(jìn)行拼接及序列比對(duì)，采用Editseq及MEGA-X軟件對(duì)序列長(zhǎng)度、變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)以及堿基組成進(jìn)行分析，并計(jì)算種間及種內(nèi)遺傳距離，構(gòu)建ML系統(tǒng)聚類樹。DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)采用DNAman軟件生成。

3 結(jié)果

3.1 rbcL基因擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.00%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀檢驗(yàn)，110份野生樣品均在600 bp左右處出現(xiàn)單一、明亮、清晰的條帶。

3.2 rbcL序列分析

除大籽獼猴桃外，同一物種獼猴桃的rbcL序列具有高度保守性，種內(nèi)差異為0。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行堿基修正后得到rbcL序列長(zhǎng)度約為507 bp。9種獼猴桃樣品中鳥嘧啶+胞嘧啶（G+C）含量整體差異較小，為43.39%～44.38%。見表2。

表2 9種獼猴桃科樣本rbcL序列堿基組成

3.3 遺傳距離分析

9種獼猴桃種間遺傳距離為0.0%～1.8%，其中中華獼猴桃、毛花獼猴桃、浙江獼猴桃、長(zhǎng)葉獼猴桃的種間以及軟棗獼猴桃、黑蕊獼猴桃種間遺傳距離為0，對(duì)萼獼猴桃、黑蕊獼猴桃種間以及對(duì)萼獼猴桃、軟棗獼猴桃種間遺傳距離最大，為1.8%。見表3。

表3 9種獼猴桃科樣本種間遺傳距離

3.4 變異位點(diǎn)分析

9種獼猴桃屬植物共產(chǎn)生變異位點(diǎn)10個(gè)，其中根據(jù)195 bp處的胸腺嘧啶（T）堿基可以將貓人參來源物種（對(duì)萼獼猴桃和大籽獼猴桃）與另外7種獼猴桃進(jìn)行區(qū)分鑒定，根據(jù)182 bp處的腺嘌呤（A）堿基和426 bp處的鳥嘧啶（G）堿基可以將葛棗獼猴桃與其余物種進(jìn)行區(qū)分鑒定，根據(jù)227 bp處的T堿基、239 bp處的G堿基和258 bp處的胞嘧啶（C）堿基可以將軟棗獼猴桃和黑蕊獼猴桃與其他物種進(jìn)行區(qū)分鑒定。見表4。

表4 9種獼猴桃科樣本變異位點(diǎn)分析

3.5 系統(tǒng)聚類樹分析

以水東哥屬的水東哥rbcL序列為外類群，貓人參及其近緣種的ML系統(tǒng)聚類樹見圖1。聚類結(jié)果表明，葛棗獼猴桃、大籽獼猴桃、對(duì)萼獼猴桃聚為一支，其中對(duì)萼獼猴桃與本研究采集并測(cè)得的大籽獼猴桃序列聚為一支；其余6種獼猴桃聚為一支，其中軟棗獼猴桃、黑蕊獼猴桃與Genbank上下載的大籽獼猴桃序列聚為一支。通過聚類分析，可以將貓人參與其他物種獼猴桃進(jìn)行區(qū)分鑒定。

圖1 貓人參及其近緣種的系統(tǒng)聚類樹

3.6 rbcL基因序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

貓人參及其近緣種的rbcL序列二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖2。從中可以看出，二級(jí)結(jié)構(gòu)圖與遺傳聚類分析及系統(tǒng)聚類分析結(jié)果相似，作為貓人參來源的對(duì)萼獼猴桃和大籽獼猴桃具有其特有的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可明顯與其他物種獼猴桃進(jìn)行區(qū)分。

圖2 貓人參及其近緣種的脫氧核糖核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)

4 討論

4.1 基于rbcL序列對(duì)貓人參及其近緣種鑒定的可行性分析

植物葉綠體基因與核基因相比具有相對(duì)分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，且葉綠體DNA屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳，進(jìn)化速率較快，適用于植物親緣學(xué)分析［14］。rbcL序列全長(zhǎng)約1 kb，具有種內(nèi)進(jìn)化速率低、種間進(jìn)化速率高的特點(diǎn)，在石斛屬［15］、菊科［16］等多種藥用植物中體現(xiàn)了較好的鑒別優(yōu)勢(shì)。

貓人參為獼猴桃屬植物，屬于嚴(yán)格的葉綠體基因組父系遺傳，這一罕見而特殊的遺傳方式極大地提高了獼猴桃屬植物親緣關(guān)系的復(fù)雜性［17］。有學(xué)者基于簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）以及多種葉綠體DNA條形碼等分子生物學(xué)手段對(duì)獼猴桃屬的親緣關(guān)系及遺傳多樣性進(jìn)行了研究［17-18］，但尚缺乏對(duì)貓人參的物種鑒定研究。本研究發(fā)現(xiàn)，貓人參基源物種對(duì)萼獼猴桃和大籽獼猴桃具有獨(dú)特的堿基變異位點(diǎn)，且聚類分析對(duì)萼獼猴桃和大籽獼猴桃聚為一支，其DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)也與其他物種明顯不同。因此，rbcL序列在貓人參的物種鑒定中具有較好的應(yīng)用效果。

4.2 基于rbcL序列對(duì)獼猴桃屬植物進(jìn)行分子鑒定的可行性分析

本研究發(fā)現(xiàn)，rbcL序列可用于貓人參的物種鑒定研究，然而對(duì)獼猴桃屬部分物種的鑒定能力較差。本研究中，中華獼猴桃、毛花獼猴桃、浙江獼猴桃、長(zhǎng)葉獼猴桃的基因序列一致，軟棗獼猴桃和黑蕊獼猴桃的基因序列一致，將毛花獼猴桃在Genbank上進(jìn)行檢索比對(duì)，比對(duì)分值為100%的有浙江獼猴桃、中華獼猴桃、黑蕊獼猴桃、小葉獼猴桃等多個(gè)物種，說明基于rbcL序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，尚不能對(duì)獼猴桃屬植物進(jìn)行完全鑒定。這可能與本文所選取的片段為rbcL部分片段有關(guān)，片段長(zhǎng)度越短，所包含的堿基變異位點(diǎn)相應(yīng)越少，然而片段長(zhǎng)度越長(zhǎng)，PCR擴(kuò)增率及測(cè)序成功率相應(yīng)降低。因此，對(duì)于獼猴桃屬植物的鑒定，尚需要對(duì)葉綠體基因長(zhǎng)片段或多片段聯(lián)合序列對(duì)獼猴桃屬植物的鑒定能力開展進(jìn)一步研究。

4.3 貓人參藥材DNA條形碼鑒定的意義

貓人參在浙江、江西、福建等地被廣泛應(yīng)用，臨床抗腫瘤效果明顯，尤其對(duì)于胃癌及肺癌細(xì)胞抑制作用明顯，然而其藥用部位為地下根，在栽培基地尚未普及的情況下，目前貓人參野生資源已近匱乏。另一方面，貓人參具有兩個(gè)藥用來源，其一為對(duì)萼獼猴桃（俗稱“白貨”），其二為大籽獼猴桃（俗稱“紅貨”），白貨和紅貨主要根據(jù)地下根的顏色區(qū)分。獼猴桃屬其他植物地下部分與貓人參藥材較難區(qū)分，而其藥理作用卻具有較大差異。近年來市場(chǎng)上出現(xiàn)了較多貓人參混淆品，其中以黑蕊獼猴桃和中華獼猴桃居多。對(duì)貓人參進(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒定是保證臨床用藥安全的前提。

DNA條 形 碼 在 鼠 尾 草 屬［19］、黃 芪［20］、甘 草［21］等多種中藥材的物種鑒定中發(fā)揮了巨大優(yōu)勢(shì)，其操作簡(jiǎn)便、經(jīng)驗(yàn)依賴性小、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究發(fā)現(xiàn)葉綠體rbcL序列可用于貓人參的物種鑒定，因此基于DNA條形碼對(duì)貓人參進(jìn)行鑒別具有較大的臨床意義。另一方面，基于DNA條形碼可探討物種之間的系統(tǒng)發(fā)育及親緣關(guān)系，可為拓寬藥材資源提供一定的參考。